НАФТОХИНОНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/122 A61P31/06 

Предпосылки изобретения

Данное изобретение относится к лечению и борьбе с туберкулезом, вызываемым Mycobacterium tuberculosis, и в частности к использованию нафтохиноновых производных для такого лечения и борьбы.

Туберкулез (ТБ) остается серьезной проблемой для здоровья во многих регионах мира, в особенности в развивающихся странах. Он является инфекционным заболеванием и приобретает масштабы эпидемии в ряде частей света. Согласно оценкам 30-60% взрослого населения в развивающихся странах заражены Mycobacterium tuberculosis. Приблизительно у 8-10 миллионов человек развивается клинический ТБ и 3 миллиона ежегодно умирает от ТБ (WHO/IUATLD, 1989).

В Южной Африке свыше 3 из каждой тысячи человек умирают от ТБ - наиболее высокий процент в мире, при этом один из каждых 200 человек страдает активным туберкулезом. Туберкулез является наиболее регистрируемым заболеванием в Южной Африке и стоит на пятом месте из самых серьезных причин смерти среди черного населения (South African Tuberculosis Association, 1998).

В Соединенных Штатах Америки число случаев ТБ неуклонно уменьшалось вплоть до 1986, когда было отмечено их увеличение. С тех пор число случаев ТБ продолжает расти. Десять миллионов человек заражено в США, с приблизительно 26000 новых случаях активной болезни каждый год (National Jewish Medical and Research Center, 1994).

Люди, зараженные вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), очень восприимчивы к туберкулезу и данная болезнь часто развивается прежде, чем становятся очевидными другие проявления СПИДА (Grange and Davey, 1990). Борьба с эпидемией ТБ, связанной с ВИЧ инфекцией, очевидно во многом зависит от соответствующего лечения ТБ и возможно от эффективной химической профилактики не только для ВИЧ-инфицированных людей, но также и для общества в целом (WHO/IUALTD, 1989).

Терапия ТБ претерпела революцию и существующая система лечения ТБ основана на многолекарственной терапии обычно 3 или 4 противотуберкулезными лекарствами. Однако появляется проблема многолекарственной устойчивости туберкулезных бацилл к различным лекарствам, таким как, например, изониазид, этамбутол, рифампицин и стрептомицин (Girling, 1989; Grange and Davey, 1990). Устойчивый к лекарствам ТБ плохо поддается лечению, требуя большего числа и разнообразия лекарственных средств в течение более длительного периода лечения. Потребность в новых противотуберкулезных агентах является неотложной из-за увеличивающейся устойчивости микобактерий к этим классическим противотуберкулезным лекарствам. В недавнем отчете WHO отмечается, что в общем 2% от всех случаев туберкулеза являются многолекарственно устойчивыми, что определяется устойчивостью к рифампицину плюс изоназиду (плюс/минус прочие устойчивости). Такие случаи можно лечить в США и других высокоразвитых странах, но с высокой стоимостью (в каждом случае>250000 $ США!) и с использованием очень длительных курсов лечения довольно токсичными лекарствами, ставя тем самым серьезную проблему соответствия требованиям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (WHO, 1997). Южная Африка является свидетельством взрыва числа случаев лекарственно устойчивого туберкулеза. В некоторых частях Южной Африки 1 из 10 случаев ТБ является устойчивым к лечению (New Scientist, March 1997). Весьма возможно иметь новые противотуберкулезные агенты, предпочтительно такие, которые могут быть легко и просто получены из некоторых местных источников.

Краткое описание изобретения

Согласно первому аспекту изобретения предоставляется нафтохиноновое производное формулы 1

в которой R является ОН группой, метиловым простым эфиром, этиловым простым эфиром или сходным эфиром;

R1 является метилом, этилом или сходным алифатическим углеводородным производным;

R2 и R3 каждый независимо является водородом или группой, выбранной из

в которых R5 является ОН группой, метиловым простым эфиром, этиловым простым эфиром или сходным эфиром и R6 является метилом, этилом или сходным алифатическим углеводородным производным; R4 является водородом или группой, выбранной из

в которых R7 является ОН группой, метиловым простым эфиром, этиловым простым эфиром или сходным эфиром и R8 является метилом, этилом или сходным алифатическим углеводородным производным;

или его фармацевтически приемлемые соли для использования в способе лечения и/или борьбы с туберкулезом пациентов, вызываемым Mycobacterium tuberculosis.

Согласно второму аспекту изобретение предоставляет применение нафтохинонового производного, имеющего формулу 1, представленную выше, в производстве лекарственных препаратов для способов лечения и/или борьбы с туберкулезом пациентов, вызываемым Mycobacterium tuberculosis.

Согласно третьему аспекту изобретение предоставляет способ лечения и/или борьбы с туберкулезом, вызываемым Mycobacterium tuberculosis, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества нафтохинонового производного, имеющего формулу 1, представленную выше.

Нафтохиноновое производное формулы 1 в типичном случае является соединением формулы 1а или формулы 1b

в которых R и R1 имеют значения, определенные для формулы 1 выше.

R в соединении формулы 1а или 1b является предпочтительно ОН группой.

R1 в соединении формулы 1а или 1b является предпочтительно СН₃ группой.

В частности, нафтохиноновым производным формулы 1 является 5,5'-дигидрокиси-7,7'-бинафтохинон (диоспирин) или 5-гидрокиси-7-метил-1,4-нафтохинон (метилюглон).

Описание предпочтительных исполнений изобретения

Настоящее изобретение направлено на использование нафтохиноновых производных для лечения и/или борьбы с туберкулезом, вызываемым Mycobacterium tuberculosis. В частности обнаружено, что нафтохиноновые производные общей формулы 1

в которой R является ОН группой, метиловым простым эфиром, этиловым простым эфиром или сходным эфиром;

R1 является метилом, этилом или сходным алифатическим углеводородным производным;

R2 и R3 каждый независимо является водородом или группой, выбранной из

в которых R5 является ОН группой, метиловым простым эфиром, этиловым простым эфиром или сходным эфиром и R6 является метилом, этилом или сходным алифатическим углеводородным производным; R4 является водородом или группой, выбранной из

в которых R7 является ОН группой, метиловым простым эфиром, этиловым простым эфиром или сходным эфиром и R8 является метилом, этилом или сходным алифатическим углеводородным производным;

эффективны против Mycobacterium tuberculosis.

Обнаружено, что особенно эффективны конкретные нафтохиноновые производные формул 1а и 1b

В частности обнаружено, что диоспирин (diospyrin) и метилюглон (methyljuglone), нафтохиноновые производные формулы 1а и формулы 1b, соответственно, в которых R является ОН и R1 является метильной группой, ингибируют несколько как устойчивых к антибиотику, так и восприимчивых к антибиотику штаммов Mycobacterium tuberculosis. Хотя диоспирин (diospyrin) и метилюглон (methyljuglone) особенно предпочтительны, предоставляются также нафтохиноновые производные формул 1а и 1b, в которых R является метиловым эфиром, этиловым эфиром или сходным эфиром и R1 является этилом или сходным алифатическим углеводородным производным.

Была предпринята обширная исследовательская программа по идентификации противотуберкулезных агентов, которые могут быть легко и просто получены из местных источников.

Двадцать южноафриканских лекарственных растений, используемых для лечения легочных заболеваний, были исследованы на активность против устойчивых и чувствительных к лекарствам штаммов М. tuberculosis. Предварительное исследование ацетоновых и водных экстрактов растений против чувствительного к лекарствам штамма М. tuberculosis H37Rv проводили по методу с использованием агаровой пластинки. Четырнадцать из 20 ацетоновых экстрактов показали игибирующую активность против данного штамма в концентрации 0,5 мг/мл. Ацетоновые, а также водные экстракты Cryptocarya latifolia, Euclea natalensis, Helichrysum melanacme, Nidorella anomala и Thymus vulgaris ингибировали рост М. tuberculosis. Принимая активность 14 ацетоновых экстрактов в 0,5 мг/мл против чувствительного к лекарствам штамма М. tuberculosis по методу агаровой пластинки, были проведены дальнейшие исследования с применением быстрого радиометрического метода для подтверждения ингибирующей активности.

Данные активные ацетоновые экстракты исследовали как против H37Rv штамма, так и против штаммов, устойчивых к лекарствам, изониазиду и рифампицину. Минимальной ингибирующей штамм H37Rv концентрацией Croton pseudopulchellus, Ekebergia capensis, Euclea natalensis, Nidorella anomala и Polygala myrtifolia по радиометрическому методу была 0,1 мг/мл. Экстракты Chenopodium ambrosioides, Ekebergia capensis, Euclea natalensis, Helichrysum melanacme, Nidorella anomala и Polygala myrtifolia были активны против устойчивого штамма при 0,1 мг/мл. Восемь растений показали активность против обоих штаммов в концентрации 1,0 мг/мл.

Следующая процедура была разработана заявителем для выделения диоспирина и метилюглона из Е. natalensis и других видов данного рода, также как и из любых других растений, которые могут синтезировать диоспирин или метилюглон или другие хиноновые производные.

1. Идентификация видов растений.

Корни и воздушные части растения Е. natalensis собирали недалеко от Дурбана и идентифицировали в HGWJ Schweickerdt Herbarium of the University of Pretoria и также в гербарии National Botanical Institute, Pretoria.

2. Экстракция.

Высушенные корни Е. natalensis измельчали в порошок в сухой мельнице и экстрагировали в течение 48 часов ацетоном. Экстракт фильтровали и концентрировали досуха на роторном испарителе.

3. Тонкослойная хроматография.

Применяли прямой антибактериальный биоанализ (Dilika & Meyer, 1996) на ТСХ-пластинках для ускорения выделения противотуберкулезных соединений в соответствии с активностью. М. tuberculosis не может быть испытан таким образом из-за очень низкой скорости его роста. Прямые антибактериальные биоанализы ацетонового экстракта проводили на ТСХ пластинках (Merck), проявляемых смесью хлороформ-гексан (1:1). После проявления ТСХ пластинки сушили и опрыскивали их 24-часовой культурой Staphylococcus aureus в питательном бульоне. После 24-часовой инкубации пластинки опрыскивали водным раствором 2 мг/мл п-иоднитротетразолия фиолетового для визуализации бактериальных клеток. Пластинки затем повторно инкубировали при 37° С в течение 2-3 часов. На ТСХ пластинках, опрысканных S. aureus, можно было видеть две зоны ингибирования бактериального роста. Активность была более выраженной в зоне R_f 0,30 (хлороформ-гексан (1:1)), чем в зоне R_f 0,54.

4. Колоночная хроматография.

Неочищенный экстракт растения сушили, определяли его массу и повторно суспендировали в хлороформе. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 с использованием хлороформа в качестве элюента. Собранные антибактериальные фракции затем подвергали Sephadex LH-20 колоночной хроматографии с использованием этанола в качестве элюента. Собранные фракции снова испытывали на антибактериальную активность на ТСХ для обнаружения фракций, содержащих активные соединения R_f 0,30 и R_f 0,54.

5. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

Соединения дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ, с использованием аналитической Phenomenex 250× 4,60 мм колонки с обращенной фазой, при скорости потока 1,0 мл/мин, температурой печи 40° С и длиной волны 206 нм. Раствор этанол-вода (50:50) использовали в качестве подвижной фазы. Чистые соединения еще один раз подвергали Sephadex LH-20 колоночной хроматографии и подтверждалось, что они являются чистыми. Данными ¹H и ¹³С ЯМР и масс-спектрометрией подтверждалось, что химические структуры представляют

диоспирин (5,5'-дигидрокси-7,7'-бинафтохинон); C₂₂H₁₄O₆. Молекулярная масса 374,35

7-метилюглон (5-гидрокиси-7-метил-1,4-нафтохинон); С₁₁Н₈О₃. Молекулярная масса 188,19.

Влияние диоспирина и метилюглона на рост чувствительного штамма (H37Rv) и устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis, определенное радиометрическим методом, представлено в табл. 1 и 2.

Таблица 1Влияние диоспирина на рост чувствительного штамма (H37Rv) и устойчивых штаммов Mycobacterlum tuberculosis, определенное радиометрическим методомШтаммы Mycobaсterium tuberculosisMIC (мг/мл)Δ GI^a значения экстрактов растений (мг/мл)Δ GI значения контрольного сосуда (мг/мл)Чувствительный H37Rv штамм0,1-1± 1,4120± 4,24Штамм, устойчивый к 2 лекарствам (устойч. к изониазиду и рифампицину)0,13,5± 0,7025± 7,07Штамм, устойчивый к 3 лекарствам (устойч. к стрептомицину, изониазиду и этамбутолу)0,14± 2,1229± 1,41Штамм, устойчивый к 4 лекарствам (устойч. к стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбутолу)0,15± 2,8225± 2,82Штамм, устойчивый к 5 лекарствам (устойч. к изониазиду, стрептомицину, рифампицину, триацетозону и циклоцерину)0,110± 1,4122,5± 3,53Штамм, устойчивый к 6 лекарствам (устойч. к изониазиду, рифампицину, этионамиду, теризидону, триацетозону и офлоксацину)0,19± 2,8230± 1,0Штамм, устойчивый к 7 лекарствам (устойч. к изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, канамуцину, рифампицину и этионамиду)0,113,5± 3,228± 3,1 ^aΔ^{GI значения являются средними ± стандартное отклонение}

Таблица 2Влияние 7-метилюглона как единственного агента и в сочетании с диоспирином на рост чувствительного штамма H37Rv и устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis, определенное радиометрическим методом.Штаммы Mycobacterium tuberculosisЛабораторный референсный номерСоединениеMIC^a (мкг/мл)Δ GI^b значения экстрактов растенийΔ GI значения контрольного сосудаЧувствительный H37Rv штаммАТСС272947-Метилюглон500± 115± 3,78Штамм, устойчивый к 2 лекарствам (изониазиду и рифампицину)CCKО28469V7-Метилюглон500± 030± 4,94Чувствительный H37Rv штаммАТСС27294Диоспирин+ 7-метилюглон103± 115± 3,78Штамм, устойчивый к 2 лекарствам (изониазиду и рифампицину)CCK028469VДиоспирин+ 7-метилюглон103,33± 3,0530± 4,94 ^аМинимальная ингибирующая концентрация
 ^bΔ^{GI значения являются средними ± стандартное отклонение}

Результаты показывают, что диоспирин и метилюглон эффективны в борьбе с Mycobacterium tuberculosis. Для лечения или борьбы с туберкулезом в типичном случае будет использоваться пероральное введение диоспирина или метилюглона в подходящих фармацевтических композициях с подходящими разбавителями и носителями. Это будут таблетки, жидкости или сходные пероральные дозированные формы, поскольку диоспирин и метилюглон легко абсорбируются в кишечнике.

Однако считается, что диоспирин или метилюглон, вводимые внутривенно или внутримышечно, также будут эффективно абсорбироваться через кровеносные сосуды и поток крови пациента.

Чрезкожное введение, с помощью пластыря или сходных носителей для чрезкожного введения, также является возможным.

Предусматривается также комбинационное лечение диоспирином и метилюглоном, которое может быть более эффективным, по сравнению с лечением одним из двух нафтохинонов.

Заявитель считает, что можно увеличить концентрацию диоспирина, метилюглона или других хинонов в Е. natalensis или сходных видах с помощью фитоалексиновой стимуляции или биотехнологических манипуляций культур тканей и/или интактных растений.

В общем случае хиноны синтезируют из катехина (1,2-хиноны) или гидрохинона (1,4-хиноны) мягким окислением

Насколько заявитель смог установить, диоспирин был один раз синтезирован в лабораторных условиях (Yoshida, M. and Mori, К. 2000. European Journal of Organic Chemistry, стр. 1313-1317). Однако сходные бинафтохиноны могут быть также синтезированы по реакции плюмбагина (94 мг в метаноле, 10 мл) и его гидрохинона (190 мг в метаноле, 14 мл), забуференного фосфатом до рН 6,8 при 30° С (Sankaram et al. 1975; Kumari et al. 1982).

Следует считать, что диоспирин, метилюглон и родственные нафтохиновые производные являются жизнеспособными альтернативами традиционным лекарствам в лечении и борьбе с туберкулезом человека.

Предложены применение нафтохиноновых производных для лечения и/или борьбы с туберкулезом, вызываемым Mycobacterium tuberculosis, способ лечения туберкулеза. Заявленные нафтохиноновые производные известны как экстракты из южноафриканских лекарственных растений, например диоспирин и O-метилюглон. Изобретение отличается тем, что указанные соединения эффективны как в отношении чувствительных штаммов М. tuberculosis, так и штаммов, устойчивых к изониазиду, рифампицину или штаммов с множественной устойчивостью. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Применение нафтохинонового производного, имеющего формулу 1

в которой

R является ОН группой;

R1 является метилом;

R2 и R3 каждый независимо является водородом или группой, выбранной из

в которых R и R1 имеют значения, определенные выше;

R4 является водородом или группой, выбранной из

в которых R и R1 имеют значения, определенные выше;

или его фармацевтически приемлемых солей, в качестве агента фармацевтической композиции для лечения и/или борьбы у пациентов с туберкулезом, вызываемым Mycobacterium tuberculosis.

в которых R и R1 имеют значения, определенные для формулы 1 в п.1.

в которой R является ОН группой;

R1 является метилом;

R2 и R3 каждый независимо является водородом или группой, выбранной из

в которых R и R1 имеют значения, определенные выше;

R4 является водородом или группой, выбранной из

в которых R и R1 имеют значения, определенные выше;

или его фармацевтически приемлемой соли.

в которых R и R1 имеют значения, определенные для формулы 1 в п.4.