Пираноиндолы с противотуберкулезной активностью Российский патент 2018 года по МПК C07D491/52 A61K31/407 A61P31/06 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям производным пираноиндолов общей формулы (I), проявляющим активность в отношении микобактерий туберкулеза, способу их получения и их применению в качестве противотуберкулезных лекарственных средств.

Начиная с 1998 года, когда полная последовательность генома микобактерий туберкулеза стала доступной, геномика предоставила ценный ресурс обнаружения новых лекарственных препаратов катализируя генетические манипуляции и порождая современные мощные технологии, включающие транскриптомику, протеомику, сравнительную и структурную геномику. Эти постгеномные достижения значительно повлияли на наше понимание биологии туберкулеза и способствовали попыткам целевой разработки препаратов, их идентификации и проверки. Тем не менее, многие из задач, которые изначально казались очень важными и дающими много информации для использования в разработке лекарственных препаратов in vitro генетическими методами, такими, как замена гена или насыщение мутагенеза, на самом деле оказалось, не дают требуемого результата вследствие генетической избыточности или метаболизма. В результате стало понятно, что стандартные микробиологические и фармакологические проверки являются гораздо более надежными и лучшими для достижения успеха в плане создания новых противоинфекционных средств.

Обнаружение новых лекарств против туберкулеза может следовать по двум основным маршрутам: от препарата к мишени или от мишени к препарату. Все существующие на сегодняшний день препараты и кандидаты в клинических испытаниях были получены по пути от «препарата к мишени» с участием высокопроизводительного скрининга против целых клеток, что подчеркивая важность этого подхода. Тем не менее, постгеномные инструменты теперь поддерживают и этот традиционный маршрут на пути к разработке новых препаратов.

Несмотря на то, более элегантно выглядящий с точки зрения прикладной биологии, подход от мишени к препарату был неудовлетворительным, главным образом, из-за изменения способности соединения ингибировать очищенный фермент по сравнению с исследованием активности в отношении целых клеток (минимальная подавляющая концентрация), оказалось серьезным препятствием для рационального дизайна лекарств. Многообещающие ингибиторы фермента, как правило, плохо активны против самой бактерии, и это, вероятно, связано со сложной микобактериальной клеточной оболочкой, которая предотвращает поглощение соединения клеткой, к действию эффлюксных насосов или инактивация соединения в результате внутиклеточного метаболизма. Кроме того, уровень проникновения соединения в клетку само по себе не всегда объясняет отсутствие корреляции между IC 50 и MIC. Например, уровень ингибирования белка, необходимого, чтобы вызвать цидный эффект является еще одним важным вопросом, и может изменяться в широких пределах.

Некоторые из клинически наиболее продвинутых кандидатов для лечения туберкулеза являются молекулы, которые первоначально были разработаны для лечения других инфекционных заболеваний, но были перенаправлены на туберкулез. К ним относятся соединения из группы рифамицина, фторхинолона, оксазолидинона.

Классический подход к разработке новых противотуберкулезных препаратов

Скрининг библиотек химических соединений с определением МИК против живой микобактерии представил в настоящее время несколько перспективных кандидатов лекарств против ТБ: Нитроимидазолы (PA-824 и деламанид), бедаквилин (TMC207), недавно идентифицированный имидазопиридин амидное соединение Q203, диэтиламин SQ109 и бензотиазинон BTZ043.

К успехам постгеномной эпохи можно отнести обнаружение мишеней и механизма действия бициклических нитроимидазолов, PA-824 и деламанида. Оба нитроимидазола обладают высокой активностью против Mtb в аэробных условиях и против не-делящихся и гипоксических бактерий. Были использованы микрочипы на основе секвенирования генома для выявления мутаций, связанных с устойчивостью к PA-824. Интересно отметить, что мутации, влияющие на специфическую нитроредуктазу, придают устойчивость и к РА-824 и к деламаниду. Показано, что нитроредуктаза активирует оба этих нитроимидазола что приводит к внутриклеточному высвобождению оксида азота, который предположительно убивает бактерии. Профилированый анализ экспрессии генов после воздействия PA-824 показал активацию генов, участвующих в синтезе клеточной стенки, а также дыхании, предполагая, что РА-824 возможно ингибирует оба пути.

В 2005 году, используя классический фенотипической подход была обнаружена очень сильная молекула, TMC207 или бедаквилин, инновационный, недавно одобренный лекарственный препарат, который дает значительную надежду на лечение случаев МЛУ-ТБ. Генетическое исследование спонтанно приобретенных ТМС-207 устойчивых мутантов показало, что только 15 из 53 мутантов имеют мутации в atpE, что свидетельствует о том, что препарат имеет либо дополнительные цели или механизмы сопротивления, такие как принудительное выведение лекарств. Открытие бедаквилина, воздействующего на энергетический метаболизм в целом и ингибирование АТФ-синтазы, в частности, делает эти мишени чрезвычайно интересными с точки зрения разработки препаратов специфично на них воздействующие.

Недавно, дополнительно была подтверждена важность АТФ-синтезы в качестве основной мишени для лекарственного средства против ТБ с открытием нового класса - имидазопиридина амидных соединений, которые блокируют рост микобактерий путем воздействия на BC1 цитохром комплекса дыхательной цепи. Использование фенотипический скрининг на инфицированных макрофагах, ряд соединений, были отобраны и химически оптимизированы с выходом к Q203, ингибитору с активными наномолярными концентрациями и с многообещающей эффективностью в мышиных моделях ТБ. Спонтанные устойчивые мутанты, указывают на единственную аминокислотную замену в цитохром-субъединице bc1 комплекса.

Основной мишенью препарата SQ109, который ингибирует синтез миколовых кислот, только недавно был идентифицирован как MmpL3, трансмембранный переносчик трегалозной мономиколата. Первоначально исследователи не смогли получить спонтанные устойчивые мутанты к SQ109. Тем не менее, с использованием аналогов этилендиамина, устойчивые мутанты были сгенерированы, и они показали перекрестную резистентность к SQ109 и таким образом были выявлены мутации в гене mmpL3.

Бензотиазиноны, новый класс серосодержащих гетероциклических соединений, являются чрезвычайно мощным против микобактерий туберкулеза, показывая низкую наномолярной бактерицидную активность in vitro и в моделях внутриклеточных инфекций. Генетические и биохимические исследования, а также транскриптомные и протеоминые анализы, определили DprE1 субъединицу жизненно важный фермент декапренилфосфорил-D-рибоза 2'-эпимеразу в качестве мишени. Ингибирование DprE1 останавливает синтез арабиногалактана, что в конечном итоге приводит к лизису клетки. Представляется что DprE1 также представляется крайне перспективной мишенью для потенциальных противотуберкулезных препаратов.

Рациональный дизайн лекарственных средств

Несмотря на значительные усилия, затраченные, целевой подход, основанный на поиске соединений влияющих на известные мишени в туберкулезной клетке был весьма ограниченно результативен в плане открытия новых противотуберкулезных препаратов. Некоторые из наиболее многообещающих результатов, полученных выявленных таким образом приведены ниже.

Этионамид является одобренным препаратом второй линии, но он обладает значительными побочными эффектами. Его мишень - еноил-АСР редуктаза, Inha, так же мишень что и для изониазида, и механизм действия основан на ингибировании синтеза миколовых кислот. Этионамид является пролекарством, он активируется моно-оксигеназой, а его экспрессия подавляется EthR. Активация и, в свою очередь, эффективность этого лекарственного средства ограничены низкими конструктивными особенностями этионамида. Лекарственно-подобные ингибиторы EthR, такие как BDM31343, были разработаны с использованием кристаллической его структуры в качестве матрицы и новые производные этионамида показывают лучшую активность в опытах in vitro и лучшую эффективность в экспериментах на животных.

Глиоксилатный путь является важным метаболическим путем для физиологии микобактерий, так как он усиливает свою активность в отсутствие гликолиза для поддержания цикла трикарбоновых кислот в течение персистирующей фазы инфекции. У млекопитающих отсутствуют два основных фермента, изоцитратлиазы и малатсинтазы, что делает эти ферменты перспективными и специфическими в качестве антибактериальных мишеней для лекарственных средств. Структура фермента была использована при дизайне лекарственных средств и были разработаны мощные селективные ингибиторы фенильные-дикетостероидных кислот малатсинтазы, которые активны в мышиной модели ТБ. Это химически обосновывает глиоксилатный путь в качестве перспективной новой мишени для поиска противотуберкулезного лекарственного средства.

Скрининг природных соединений

Природные соединения, в частности, стрептомицин и рифампицин, сыграли значительную роль в борьбе с туберкулезом. Несмотря на преобладание природных антибиотиков для борьбы с другими бактериальными инфекциямий, не удавалось обнаружить новых природных соединений активных на микобактериий до 2012. Недавно был расшифрован механизм действия пиридомицина, противотуберкулезного природного соединения, найденного впервые с 1953 г. После отбора пиридомицин устойчивых мутантов, были идентифицированы Inha, являющийся мишенью для изониазида, в качестве мишени и для пиридомицина. Так же как и изониазид является пролекарством, что требует его активации с помощью каталазы-пероксидазы KatG, инактивация пиридимицина чаще всего ассоциируется с мутациями в гене katG. Изониазид устойчивые клинические изоляты, несущие мутации в katG сохраняют чувствительность к пиридомицину, что делает этот натуральный продукт многообещающим соединением для борьбы со штаммами с лекарственной устойчивостью и перспективным является дополнительное исследование библиотек натуральных продуктов, но с использованием новых подходов.

Таким образом, можно однозначно утверждать, что только комплексный подход к направленному поиску противотуберкулезных препаратов нового поколения имеет шансы на успех. Такое направление исследования должно содержать и скрининг в отношении полноклеточных форм микобактерий, и скрининг в отношении дормантных форм и подробное генетической исследование как резистентных мутантных штаммов, так и проведение секвенирования чувствительных штаммов, подвигнувшихся обработке потенциальными препаратами.

Данная задача была решена путем синтеза производных пираниндола, соответствующими общей структурной формуле 1.

Соединение общей формулы 1.

1

где

R¹ означает Н, HO, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, AcO, Cl, CF₃, CF₃O, NO₂, MeO;

R² означает Н, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, Ac, CH₂Ph, CH₂Ph-4-CN, CH₂Ph-4-OMe;

R³ означает Н, NHCH₃, NHC₃H₅;

R⁴ означает CN, CONH₂, COOC₂H₅, NHCOPh.

Соединения 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил, 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-этоксикарбонил и 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбамид ранее описаны в литературе (Н. С. Мастерова, С. Ю. Рябова,_ Л. М. Алексеева, М. И. Евстратова, С. С. Киселев, В. Г. Граник, Изв. Аккад. Наук, Сер. Хим. 2010, 3, 623), однако их биологическая активность выявлена не была.

Соединения могут быть получены и использованы в кристаллическом виде.

Нами впервые обнаружено, что пираноиндолы обладают противотуберкулезной активностью и мы синтезировали серию соединений содержащих различные заместители в этом скаффолде с целью выявить положения молекулы, по которым возможно получение производных в дальнейшем с сохранением или в идеале с увеличением уровня противомикробной активности. Для этого мы ввели заместители как по индольному атому азота, по индольному кольцу. При этом, учитывая электроно акцепторный характер заместителя в пирановом цикле, нами были получены производные так же содержащие в этом положении электроно акцепторные заместители, амид и карбонил. Для введения в индольное ядро мы выбрали серию заместителей сильно отличающихся по свойствам, алкильные заместители различного размера, нитрогруппа, галоген, трифторметильная группа, с целью изучения не только их влияния на противотуберкулезную активность, но так же и для понимания влияния липофильности конечных соединений на искомую активность.

С целью получения библиотеки новых оригинальных производных пираноиндола нами был разработан эффективный восьми стадийный метод их синтеза на основе коммерчески доступных реагентов. Этот метод был использован для наработки всех целевых 35 пираноиндолов. Каждый эксперимент по синтезу был повторен два раза с количественным коэффициентом 5. Общий выход целевых пираноиндолов составляет 30-40% и чистота получаемых продуктов > 99%. Строение полученный образцов пираноиндолов показано в таблице 1.

Таблица 1. Строение синтезированных и исследованных пираноиндолов.

номер Предполага-емый шифр соединения в библиотеке Структурная формула 11126066 11126067 11526065 11526066 11526108 11526109 11526110 11626056 11626057 11626058 11626062 11626210 11626211 11626212 11626213 11626214 11626215 11626216 11626217 11626218 11626219 11626220 11626223 11626224 11626225 11626226 11626227 11626229 11626230 11626231 11626232 11626233

Так, первой стадией процесса была предложена хорошо известная реакция Вильсмайера проводящая к введению формильной группы в третье положение индола.

Следующая стадия – введение защитной группы по индольному атому азота. Данный процесс был реализован традиционным методом с использованием избытка уксусного ангидрида и каталитического количества триэтиламина. Этот способ введения ацетильной защиты хорошо проявил себя на исследуемой системе.

Процесс мягкого окисления формильной группы был реализован с использованием хлорпербензойной кислоты.

Введение пиперидинового фрагмента во второе положение индола было предложено производить с помощью диметоксиметилпиперидина. Следующая стадия ацетилирование индола по третьему положению, проводилась классическим методом с использованием ацетил хлорида. Реакция проходила хорошо с выходом близким к количественному. Взаимодействие малондинитрила с формильной группой индола необходимо проводить в присутствии какого либо основного агента. Поэтому нами были исследованы реакции с использованием гидроксида натрия, гидрида натрия, пиперидина, триэтиламина и пиридина. Лучший выход был получен при использовании пиперидина и триэтиламина. При этом выход в этой реакции достигал 90%. Процесс замыкания пиранового кольца является ключевой и лимитирующей стадией синтеза целевых пираноиндолов.

Общая методика синтеза пираноиндолов

В экспериментах in vitro показана высокая активность представителей пираноиндолов в отношении микобактерий туберкулеза при низкой цитотоксичности соединений.

Объектом изобретения является способ предупреждения или лечения туберкулезной инфекции, включающий введение или нанесение субъекту соединения формулы I или фармацевтических композиций на их основе в эффективном количестве. Способ лечения с использованием соединений изобретения, фармацевтических композиций или лекарственных средств на их основе эффективен также к штаммам резистентным к существующим в настоящее время лекарственным препаратам.

Настоящая работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства Образования и Науки Российской Федерации (Соглашение № 14.616.21.0065; уникальный идентификационный номер RFMEFI61616X0065)

Ниже показаны примеры получения соединений по изобретению.

Синтез пираноиндолов.

Стадия а).

При температуре 5^оС прикапывали 12 ммоль POCl₃ к 50 ммоль ДМФА, раствор перемешивали 30 мин и к нему в один прием прибавляли 5-R¹-1Н-индол (10 ммоль). Реакционную массу перемешивали 12 ч при комнатной температуре и выливали в 200 мл ледяной воды. Смесь перемешивали 2 ч, выпавший осадок фильтровали, промывали водой и сушили до постоянного веса.

Стадия б).

Смесь 5-R¹-1Н-индол-3-карбальдегида (10 ммоль), уксусного ангидрида (70 ммоль) и триэтиламина (3 ммоль) кипятили с обратным холодильником 3 ч. Реакционную массу охлаждали уксусный ангидрид и триэтиламин удаляли под вакуумом. К остатку прибавляли воду, смесь перемешивали 1 ч, выпавший осадок фильтровали, промывали водой и сушили до постоянного веса.

Стадия в).

К раствору 5-R¹-1-ацетил-1Н-индол-3-карбальдегида (10 ммоль) в 50 мл хлористого метилена прибавляли мета-хлорпербензойную кислоту (m-CPBC) (15 ммоль). Раствор перемешивали при комнатной температуре 20 ч, добавляли к реакционной массе 100 мл воды, перемешивали 30 мин, водный слой отделяли, органическую фазу промывали водным раствором NaHCO₃, водой и сушили Na₂SO₄. Хлористый метилен удаляли под вакуумом, остаток затирали с эфиром. Выпавшие кристаллы фильтровали, промывали эфиром и сушили до постоянного веса.

Стадия г).

К раствору 5-R¹-1-ацетил-1Н-индол-3-ил формата (10 ммоль) в 40 мл бензола прибавляли 1-(диметоксиметил)пиперидин (20 ммоль) и пиперидин (1,1 ммоль). Смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре и затем кипятили 3 ч. Реакционную массу упаривали под вакуумом, к остатку прибавляли 30 мл метанола, триэтиламин (10 ммоль) и кипятили 2 ч. Летучие вещества удаляли под вакуумом, остаток затирали с эфиром. Выпавшие кристаллы фильтровали, промывали эфиром и сушили до постоянного веса.

Стадия д).

К суспензии (2E,Z)-5-R¹-2-(пиперидин-1-илметилен-1,2-дигидро-3Н-индол-3-она (10 ммоль) в 40 мл ДМФА прикапывали ацетил хлорид (30 ммоль). Реакционную массу перемешивали 2 ч при комнатной температуре и упаривали под вакуумом. К остатку прибавляли 30 мл воды и перемешивали смесь 2 ч, Полученные кристаллы фильтровали, промывали водой и сушили до постоянного веса.

Стадия е).

К суспензии 2-формил-5-R¹-1Н-индол-3-ил ацетата (10 ммоль) в 100 мл бензола прибавляли малононитрил (12.5 ммоль) и триэтиламин (1 ммоль). Реакционную массу перемешивали 4 ч при комнатной температуре, кристаллы фильтровали, промывали эфиром и сушили до постоянного веса.

Стадия ж).

К кипящей суспензии 2-(2,2-дициановинил)-5-R¹-1Н-индол-3-ил ацетата (10 ммоль) в 250 мл ацетонитрила при перемешивании прикапывали 30 мл концентрированной соляной кислоты. Реакционную массу кипятили 3 ч с обратным холодильником и концентрировали под вакуумом до объема 70 мл. Кристаллы фильтровали, промывали смесью ацетонитрил-вода (1:1) водой до рН~6.5, метанолом и сушили до постоянного веса. Полученные 8-R¹-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрилы кристаллизовали из ацетонитрила или смеси ацетонитрил-ДМФА.

Стадия з).

К суспензии 8-R¹-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрила (1 ммоль) и карбоната цезия (1.25 ммоль) в 5 мл сухого ДМФА прибавляли соответстующий алкилгалогенид (1.5 ммоль). Реакционную массу перемешивали 3 ч при комнатной температуре, прибавляли к ней 0.3 мл (5 ммоль) уксусной кислоты и 10 мл воды. Выпавшие кристаллы фильтровали, промывали смесью ДМФА-вода (1:1), водой и сушили до постоянного веса. Полученные 8-R¹-5-R²-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрилы кристаллизовали из ацетонитрила.

Пример 1

2-Оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11126066

Брутто формула C₁₂H₆N₂O₂; Т.пл.(скорость 10 ^oC/min) 299-302 ^oC; Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 210; ИК спектр, см^-1 2610, 2100, 1746, 1234; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9,88 (1H, s, NH), 8.69 (1H, s, CH), 7.80 (1H, d, CH), 7.43 (1H, d, CH), 7.28 (1H, t, CH), 7.16 (1H, t, CH) ppm; Элементный анализ %: C 68.62, H 2.84, N 13.35. Рассчитано %: C 68.57, H 2.88, N 13.33.

Пример 2.

Этил 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбоксилат 11126067

Брутто формула C₁₄H₁₁N₂O₄; Т.пл.(скорость 10 ^oC/min) 212-214 ^oC; Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 472; ИК спектр, см^-1 2614, 1789, 1740, 1231; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9,89 (1H, s, NH), 8.71 (1H, s, CH), 7.84 (1H, d, CH), 7.47 (1H, d, CH), 7.30 (1H, t, CH), 7.16 (1H, t, CH), 4,25 (2H, q, CH₂), 1,30 (3H, t, CH₃) ppm; Элементный анализ %: C 65.41, H 4.29, N 5.44. Рассчитано %: C 65.37, H 4.31, N 5.44.

Пример 3.

4-метиламино-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11526065

Брутто формула C₁₃H₉N₃O₂; Т.пл.(скорость 10 ^oC/min) 256-259 ^oC; Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 239; ИК спектр, см^-1 2610, 2578, 2100, 1741; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.69 (1H, s, CH), 7.80 (1H, d, CH), 7.43 (1H, d, CH), 7.28 (1H, t, CH), 7.16 (1H, t, CH), 3,11 (3H, s, CH₃) ppm; Элементный анализ %: C 65.25, H 3.74, N 17.49. Рассчитано %: C 65.27, H 3.79, N 17.56.

Пример 4.

4-циклопропиламино-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11526066

Брутто формула C₁₅H₁₁N₃O₂; Т.пл.(скорость 10 ^oC/min) 224-226 ^oC; Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 265; ИК спектр, см^-1 2613, 2569, 2107, 1749; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.69 (1H, s, CH), 7.80 (1H, d, CH), 7.43 (1H, d, CH), 7.28 (1H, t, CH), 7.16 (1H, t, CH), 3,40 (1H, s, NHCH), 1,06 (4H, m, CH₂CH₂) ppm; Элементный анализ %: C 67.64, H 4.15, N 15.79. Рассчитано %: C 67.62, H 4.18, N15.84.

Пример 5.

8-фтор-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11526108

Брутто формула C₁₂H₅ FN₂O₂; Т.пл.(скорость 10 ^oC/min) 303-305 ^oC; Масс-спектр (ЭУ)

ESI-MS/MS – 228; ИК спектр, см^-1 2567, 2112, 1748; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9,89 (1H, s, NH), 8.68 (1H, s, CH), 7.80 (1H, s, CH), 7.28 (1H, d, CH), 7.21 (1H, d, CH) ppm. Элементный анализ %: C 63.11, H 2.19, N 12.31. Рассчитано %: C 63.17, H 2.21, N 12.28.

Пример 6.

8-изопропил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11526109

Брутто формула C₁₅H₁₂N₂O₂; Т.пл. 277-280^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 252; ИК спектр, см^-1 2574, 2110, 1750; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9.89 (1H, s, NH), 8.68 (1H, s, CH), 7.80 (1H, s, CH), 7.28 (1H, d, CH), 7.21 (1H, d, CH), 3.06 (1H, m, CH), 1.34 (6H, m, C(CH₃)₂) ppm. Элементный анализ %: C 71.45, H 4.76, N 11.08. Рассчитано %: C 71.42; H 4.79; N 11.10.

Пример 7.

8-этил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11526110

Брутто формула C₁₄H₁₀N₂O₂; Т.пл. 273-275 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 252; ИК спектр, см^-1 2568, 2107, 1744; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9,87 (1H, s, NH), 8.67 (1H, s, CH), 7.84 (1H, s, CH), 7.31 (1H, d, CH), 7.20 (1H, d, CH), 2.64 (2H, q, CH₂), 1.35 (3H, t, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 70.57, H 4.20, N 11.72. Рассчитано %: C 70.58, H 4.23, N 11.76.

Пример 8.

5,8-диметил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626056

Брутто формула C₁₄H₁₀N₂O₂; Т.пл. 299-302 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 238; ИК спектр, см^-1 2568, 2107, 1744; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.64 (1H, s, CH), 7.81 (1H, s, CH), 7.33 (1H, d, CH), 7.22 (1H, d, CH), 3.79 (3H, s, NCH₃), 2.45 (3H, s, C-CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 70.59, H 4.25, N 11.80. Рассчитано %: C 70.58, H 4.23, N 11.76.

Пример 9.

8-гидрокси-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626057

Брутто формула C₁₂H₆N₂O₃; Т.пл. 329-333 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 226; ИК спектр, см^-12563, 2479, 2110, 1746; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9,63 (1H, s, NH), 8.60 (1H, s, CH), 7.80 (1H, s, CH), 7.24 (1H, d, CH), 7.16 (1H, d, CH) ppm. Элементный анализ %: C 63.73, H 2.64, N 12.37. Рассчитано %: C 63.72, H 2.67, N 12.38.

Пример 10.

5-ацетитил-3-циано-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-8-ил ацетат 11626058

Брутто формула C₁₆H₁₀N₂O₅; Т.пл. 286-288 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 310; ИК спектр, см^-1 2113, 1794, 1787, 1746; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.79 (1H, s, CH), 8.18 (1h, d, CH), 7.86 (1H, d, CH), 7.31 (1H, s, CH), 2.51 (3H, s, CH₃), 2.26 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 61.87, H 3.22, N 9.08. Рассчитано %: C 61.94, H 3.25, N 9.03.

Пример 11.

8-трифторметокси-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626062

Брутто формула C₁₃H₅FN₂O₃; Т.пл. 288-290 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 294; ИК спектр, см^-1 2597, 2110, 1787, 1245; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9.88 (1H, s, NH), 8.69 (1H, s, CH), 7.72 (1H, s, CH), 7.53 (1H, d, CH), 7.35 (1H, d, CH) ppm. Элементный анализ %: C 53.00, H 1.15, N 9.55. Рассчитано %: C 53.08, H 1.17, N 9.52.

Пример 12.

N-(5-ацетил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-ил)бензамид 11626210

Брутто формула C₂₀H₁₄N₂O₄; Т.пл. 241-243 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 346; ИК спектр, см^-1 2578, 1787, 1779, 1746; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9.50 (1H, s, NH), 8.38 (1H, s, CH), 7.74-7.20 (9H, m, 9 CH), 2.54 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 69.29, H 4.02, N 8.13. Рассчитано %: C 69.36, H 4.07, N 8.09.

Пример 13.

N-(2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-ил)бензамид 11626211

Брутто формула C₂₀H₁₄N₂O₄; Т.пл. 331-332 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 346; ИК спектр, см^-1 2572, 2555, 1780, 1747; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9.37 (1H, s, NH), 8.37 (1H, s, CH), 7.80-7.20 (9H, m, 9 CH) ppm. Элементный анализ %: C 70.92, H 3.93, N 9.16. Рассчитано %: C 71.05, H 3.97, N 9.21.

Пример 14.

8-метокси-5-метил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626212

Брутто формула C₁₄H₁₀N₂O₃; Т.пл. 308-311 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 254; ИК спектр, см^-1 2113, 1780, 1231, 984; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.66 (1H, s, CH), 7.33 (1H, s, CH), 6.92 (1H, d, CH), 6.63 (1H, d, CH), 3.85 (3H, s, OCH₃), 3.79 (3H, s, NCH₃) ppm. Элементный анализ %: C 66.11, H 3.94, N 10.99. Рассчитано %: C 66.14, H 3.96, N 11.02.

Пример 15.

8-хлор-5-метил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626213

Брутто формула C₁₃H₇ClN₂O₂; Т.пл. 308-311 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 258; ИК спектр, см^-1 2111, 1746, 1231, 971; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.66 (1H, s, CH), 7.39 (1H, s, CH), 7.22 (1H, d, CH), 7.18 (1H, d, CH), 3.79 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 60.28, H 2.72, N 10.84. Рассчитано %: C 60.37, H 2.73, N 10.83.

Пример 16.

8-нитро-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626214

Брутто формула C₁₂H₅N₃O₄; Т.пл. 310-313 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 210; ИК спектр, см^-1 2569, 2109, 1741, 1239; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9.88 (1H, s, NH), 8.85 (1H, s, CH), 8.69 (1H, s, CH), 8.13 (1H, d, CH), 7.48 (1H, d, CH) ppm. Элементный анализ %: C56.45, H 1.92, N 16.46. Рассчитано %: C 56.48; H 1.97; N 16.47.

Пример 17.

5-этил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626215

Брутто формула C₁₄H₁₀N₂O₂; Т.пл. 303-305^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 238; ИК спектр, см^-1 2108, 1749, 1233; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.61 (1H, s, CH), 7.43 (1H, d, CH), 7.35 (1H, d, CH), 7.26 (1H, t, CH), 7.18 (1H, t, CH), 4.06 (2H, q, CH₂), 1.43 (3H, t, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 70.52, H 4.20, N 11.80. Рассчитано %: C 70.58, H 4.23, N 11.76.

Пример 18.

5-этил-8-метил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626216

Брутто формула C₁₅H₁₂N₂O₂: Т.пл. 307-310^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 252, ИК спектр, см^-1 2113, 1750, 1236. ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.61 (1H, s, CH), 7.22 (1H, s, CH),7.02 (1H, d, CH),6.74 (1H, d, CH),4.06 (2H, q, CH₂),2.45 (3H, t, CH₃),1.43 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 71.42, H 4.80, N 11.94. Рассчитано %: C 71.42, H 4.79, N 11.10

Пример 19.

5-аллил-8-метил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626217

Брутто формула C₁₆H₁₂N₂O₂; Т.пл. 300-302 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 264; ИК спектр, см^-1 2110, 1743, 1230, 972; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.59 (1H, s, CH), 7.36 (1H, s, CH), 7.04 (1H, d, CH), 6.88 (1H, d, CH), 6.70 (1H, m, CH), 5.28-5,22 (2H, m, =CH₂), 4.78 (2H, m, CH₂), 2.45 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 72.63, H 4.57, N 10.63. Рассчитано %: C 72.72, H 4.58, N 10.60.

Пример 20.

5-аллил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626218

Брутто формула C₁₅H₁₀N₂O₂; Т.пл. 317-320 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 250; ИК спектр, см^-1 2114, 1750, 1227, 985; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.59 (1H, s, CH), 7.45 (1H, d, CH), 7.31 (1H, d, CH), 7.17 (1H, t, CH), 7.48 (1H, t, CH), 6.70 (1H, m, CH), 5.28 (2H, m, =CH₂), 4.78 (2H, m, CH₂) ppm. Элементный анализ %: C 72.07, H 4.00, N 11.14. Рассчитано %: C 71.99, H 4.03, N 11.19.

Пример 21.

2-оксо-5-проп-2-ин-1-ил-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626219

Брутто формула C₁₅H₈N₂O₂; Т.пл. 321-323 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 248; ИК спектр, см^-1 2167, 2110, 1738, 1221; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.84 (1H, s, CH), 7.47 (1H, s, CH), 7.44 (1H, s, CH), 7.27 (1H, d, CH), 7.09 (1H, d CH), 4.82 (1H, s, CCH), 2.72 (2H, s, CH₂) ppm. Элементный анализ %: C 72.55, H 3.29, N 11.36. Рассчитано %: C 72.58, H 3.35; N 11.28.

Пример 22.

8-метил-2-оксо-5-проп-2-ин-1-ил-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626220

Брутто формула C₁₆H₁₀N₂O₂; Т.пл. 324-327 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 262; ИК спектр, см^-1 2163, 2111, 1747, 1232; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.84 (1H, s, CH), 7.32 (1H, s, CH), 7.06 (1H, d, CH), 6.84 (1H, d, CH), 4.82 (2H, s, CH₂), 2.72 (3H, s, CH₃), 2.45 (1H, s, CH) ppm. Элементный анализ %: C 73.25, H 3.79, N 10.74. Рассчитано %: C 73.27, H 3.84, N 10.68.

Пример 23.

метил (3-циано-2-оксопирано[3,2-b]индол-5(2Н)-ил)ацетат 11626223

Брутто формула C₁₅H₁₀N₂O₄; Т.пл. 314-316 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 282; ИК спектр, см^-1 2110, 1785, 1740, 1238; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.78 (1H, s, CH), 7.52 (1H, s, CH), 7.51 (1H, s, CH), 7.34 (1H, d, CH), 7.13 (1H, d, CH), 4.96 (2H, s, CH₂), 3.60 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 63.76, H 3.54, N 10.01. Рассчитано %: C 63.83, H 3.57, N 9.92.

Пример 24.

метил (3-циано-8-метил-2-оксопирано[3,2-b]индол-5(2Н)-ил)ацетат 11626224

Брутто формула C₁₆H₁₂N₂O₄; Т.пл. 320-322 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектр (ЭУ) ESI-MS/MS – 296; ИК спектр, см^-1 2111, 1780, 1747, 1241; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.78 (1H, s, CH), 7.38 (1H, s, CH),7.11 (1H, d, CH), 6.90 (1H, d, CH), 4.96 (2H, s, CH₂), 3.60 (3H, s, OCH₃), 2.45 (3H, s, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 64.79, H 4.00, N 9.42. Рассчитано %: C 64.86, H 4.08, N 9.45.

Пример 25.

5-(цианометил)-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626225

Брутто формула C₁₄H₇N₃O₂; Т.пл. 300-303 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 249; ИК спектр, см^-1 2122, 2111, 1740, 1233; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.85 (1H, s, CH), 7.68 (1H, d, CH), 7.39 (1H, d, CH), 7.20 (1H, 7, CH), 7.56 (1H, 7, CH), 5.47 (2H, s, CH₂) ppm. Элементный анализ %: C 67.39, H 2.78, N 16.95. Рассчитано %: C 67.47, H 2.83, N 16.86.

Пример 26.

5-гексил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626226

Брутто формула C₁₈H₁₈N₂O₂; Т.пл. 275-277 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 294; ИК спектр, см^-1 2112, 1740, 1231, 993; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.66 (1H, s, CH), 7.47 (1H, d, CH), 7.29 (1H, d, CH), 7.13 (1H, t, CH), 7.46 (1H, t, CH), 4.13 (2H, t, CH₂), 1.87-1,25 (8H, m, 4CH₂), 0.88 (3H, t, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 73.39, H 6.17, N 9.45. Рассчитано %: C 73.45, H 6.16, N 9.52.

Пример 27.

метил 2-(3-циано-2-оксопирано[3,2-b]индол-5(2Н)-ил)пропионат 11626227

Брутто формула C₁₆H₁₂N₂O₄; Т.пл. 328-330 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 296; ИК спектр, см^-1 2111, 1781, 1751, 1240; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.78 (1H, s, CH), 7.49 (1H, d, CH), 7.32 (1H, d, CH), 7.14 (1H, t, CH), 7.47 (1H, t, CH), 5.25 (1H, q, CH), 3.64 (3H, s, OCH₃), 1.88 (3H, d, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 64.60, H 4.02, N 9.53. Рассчитано % : C 64.68, H 4.08, N 9.45.

Пример 28.

[(3-аминокарбонил)-2-оксопирано[3,2-b]индол-5(2Н)-ил]уксусная кислота 11626229

Брутто формула C₁₄H₁₀N₂O₅; Т.пл. 335-338 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 286; ИК спектр, см^-1 2587, 1793, 1747, 1226. ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.90 (2H, br s, NH₂), 8.50 (1H, s, CH), 7.57 (1H, d, CH), 7.32 (1H, t, CH), 7.24 (1H, d, CH), 7.11 (1H, t, CH), 4.82 (2H, s, CH₂) ppm. Элементный анализ %: C 57.69, H 3.46, N 9.77. Рассчитано %: C 58.75, H 3.52, N 9.79.

Пример 29.

метил 2-(3-циано-2-оксопирано[3,2-b]индол-5(2Н)-ил)бутаноат 11626230

Брутто формула C₁₇H₁₄N₂O₄; Т.пл. 301-303 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 310; ИК спектр, см^-1 2113, 1786, 1751, 1222; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.80 (1H, s, CH), 7.47 (1H, d, CH), 7.40 (1H, d, CH), 7.29 (1H, t, CH), 7.11 (1H, t, CH), 4.94 (1H, q, CH), 3.83 (3H, s, OCH₃), 2.17 (2H, m, CH₂), 1.17 (3H, t, CH₃) ppm. Элементный анализ %: C 65.74, H 4.51, N 9.08. Рассчитано %: C 65.80, H 4.55, N 9.03.

Пример 30.

5-(4-цианобензил)-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626231

Брутто формула C₂₀H₁₁N₃O₂; Т.пл. 297-300 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 325; ИК спектр, см^-1 2132, 2110, 1749, 1221. ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.67 (1H, s, CH), 7.53-7.14 (8H, m, 8CH), 5.52 (2H, s, CH₂) ppm. Элементный анализ %: C 73.79, H 3.43, N 12.98. Рассчитано %: C 73.84, H 3.41, N 12.92.

Пример 31.

2-(3-циано-2-оксопирано[3,2-b]индол-5(2Н)-ил)-N-(4-метоксифенил)ацетамид 11626232

Брутто формула C₂₁H₁₅N₃O₄. Т.пл. 312-315 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 373; ИК спектр, см^-1 2110, 1777, 1749, 1228; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 9.24 (1H, br s, NH), 8.62 (1H, s, CH), 7.53-6,82 (8H, m, 8CH), 4.17 (2H, s, CH₂), 3.75 (3H, s, CH₃)Элементный анализ %: C 67.52, H 3.98, N 11.31. Рассчитано %: C 67.56, H 4.05, N 11.25.

Пример 32.

5-бензил-2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил 11626233

Брутто формула C₁₉H₁₂N₂O₂; Т.пл. 298-301 ^oC (скорость 10 ^oC/min); Масс-спектры (ЭУ) ESI-MS/MS – 300; ИК спектр, см^-1 2110, 1752, 1229; ¹H NMR (ДМСО-d₆) σ: 8.67 (1H, s, CH), 7.51-7,00 (9H, m, 9CH), 5.52 (2H, s, CH₂) ppm. Элементный анализ %: C 75.91, H 4.02, N 9.35. Рассчитано %: C 75.99, H 4.03, N 9.33.

Определение цитотоксичности и противотуберкулезной активности

Для определения цитотоксичности 35 синтезированных соединений, клетки эпителия легких А549 и клетки человеческой гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 были посеяны в 96-луночные планшеты при концентрации 10⁴ клеток / мл в DMEM (без фенолового красного) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS); содержащую клеток среду использовали в качестве контроля ингибирования 100%. Клетки инкубировали в присутствии соединений, в 5% СО2 в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °С в течение 3-х дней, добавляли резазурин и определяли жизнеспособность клеток по окрашиванию через 6 часов.

Определение противотуберкулезной активности синтезированных соединений проводилось путем оценки величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) при помощи резазуринового метода по протоколу, разработанному ранее [Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2720-2]. Индикатор резазурин (7-гидрокси-3Нфеноксазин-3-он-10-оксид) представляет собой слабофлюоресцентный краситель синего цвета (Bueno et al., 2002), при восстановлении превращающийся в розовый, сильно флюоресцирующий резофурин. Поскольку метаболическая активность клеток коррелирует с восстановлением резазурина в резофурин (сопровождающим дыхание клеток), изменение окраски с синей на розовую может быть легко детектировано флюориметрически. Благодаря своей высокой чувствительности, оценка жизнеспособности клеток даже такого медленнорастущего организма, как M. tuberculosis, может быть проведена всего за 7-8 дней. Постановка тестирования активности различных химических соединений в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis в формате 96-луночного планшета при помощи резазуринового микроанализа (РЕМА) позволяет проводить быстрое высокопроизводительное тестирование противотуберкулезной активности соединений.

Полученные данные приведены в таблице 2.

Протокол оценки жизнеспособности клеток с помощью резазуринового микроанализа в формате 96-луночного планшета

Культура M. tuberculosis H37Rv была инокулирована в каждую лунку планшета (конечная концентрация 3 х 10⁴ клеток / мл), содержащую 100 мкл среды 7Н9. В верхний ряд лунок планшета добавляли каждое из тестируемых соединений в концентрации 25 мкг/мл (максимальная концентрация тестируемых соединений), далее по вертикали вниз плашки было сделано семь последовательных двукратных разведений для каждого из исследуемых соединений (25; 12,5; 6,2; 3,1; 1,5; 0,7; 0,35 мкг/мл), таким образом исследовались влияние на рост M. tuberculosis восьми различных концентраций каждого соединения. ДМСО (1%) и рифампицин (0,5 мкг / мл) использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Планшет инкубировали в течение 7 суток в статическом режиме при 37 °C, далее в каждую лунку добавляли 10 мкл стерильного 0,1%-го раствора резазурина (до конечной концентрации 0,025% вес/об) и инкубировали еще 16-18 часов (ночь) в аналогичных условиях, после чего на планшетном ридере TECAN Infinite M200 ("LifeSciences") измеряли уровень флюоресценции резазуринового метаболита резофурина (длина волны возбуждения и эмиссии 560 и 590 нм, соответственно). Данные временные параметры были подобраны опытным путем, исходя из минимального времени, за которое достижим стабильный и воспроизводимый результат детекции флюоресценции резофурина, и в соответствии с ранее опубликованным описанием резазуринового микроанализа [Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2720-2].

Средние значения флюоресценции и величины стандартных отклонений определялись исходя из 3 независимых изменений флюоресценции для каждой из исследуемых концентраций тестируемых соединений, соединение признавалось активным в данной концентрации, если среднее значение флюоресценции опытного образца превышало среднее значение флюоресценции отрицательного контроля на величину, равную трехкратному стандартному отклонению для среднего (из трех измерений) значения флюоресценции отрицательного контроля.

Полученные данные приведены в таблице 2.

Протокол оценки жизнеспособности клеток нереплицирующихся клеток штамма Mycobacterium tuberculosis ss18b с помощью резазуринового микроанализа в формате 96-луночного плaншета

Обнаружено, что все оригинальные производные пираноиндола, перечисленные в таблице 1, были высоко M. tuberculosis активны в отношении нереплицирующихся форм стрептомицин-обедненного штамма M. tuberculosis ss18b. Штамм ss18b микобактерий туберкулеза известен тем, что способен переходить в реплицирующееся в отсутствие стрептомицина. Причиной данного фенотипического проявления является инсерция цитозинового остатка в 16S рибосомальной рРНК (в участке, ответственном за устойчивость к стрептомицину) (Honore´, N., G. Marchal, and S. T. Cole. 1995. Novel mutation in 16S rRNA associated with streptomycin dependence in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 39:769–770). Важно, что в отсутствие стрептомицина клетки штамма 18b, хотя и не обладали способностью к делению, но и не теряли своей жизнеспособности даже на протяжении нескольких недель. Их способность к росту быстро восстанавливалась при введении стрептомицина в среду роста (Hashimoto, T. 1955. Experimental studies on the mechanism of infection and immunity in tuberculosis from the analytical standpoint of streptomycin-dependent tubercle bacilli. 1. Isolation and biological characteristics of a streptomycin-dependent mutant, and effect of streptomycin administration on its pathogenicity in guinea pigs. Kekkaku 30:4–8; 45–46).

Штамм 18b активно применялся при разработке моделей покоя in vivo на мышах и морских свинках с целью дальнейшего создания вакцин (Kashino, S. S., P. Ovendale, A. Izzo, and A. Campos-Neto. 2006. Unique model of dormant infection for tuberculosis vaccine development. Clin.Vaccine Immunol. 13:1014–1021; Kashino, S. S., D. R. Napolitano, Z. Skobe, and A. Campos-Neto. 2008. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10:1469–1476). В случае если животные получали инъекции стрептомицина, клетки штамма 18b размножались в легких и селезенке животных, и наоборот, в отсутствие стрептомицина переходили в неделящееся состояние, близкое к состоянию покоя. Таким образом, неделящиеся в условиях отсутствия стрептомицина клетки штамма 18b (streptomicyn-starved (ss) 18b) представляют собой модель микобактериального покоя in vivo и in vitro (Sala C, Dhar N, Hartkoorn RC, Zhang M, Ha YH, Schneider P, Cole ST. Simple model for testing drugs against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2010, 54, 4150-8).

Интересно, что неделящиеся клетки M. tuberculosis в модели ss18b in vitro обладали крайне низкой чувствительностью к таким антибиотикам, как ингибиторы ферментов клеточной стенки изониазид и бензотиазинон, активным в отношении делящихся клеток штамма 18b (в присутствии стрептомицина). Активность рифампицина, моксифлоксацина и бедаквилина в отношении делящихся и неделящихся клеток штамма 18b была близкой по своему значению (Sala C, Dhar N, Hartkoorn RC, Zhang M, Ha YH, Schneider P, Cole ST. Simple model for testing drugs against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2010, 54, 4150-8). Сходные значения по активности различных антибиотиков были получены в отношении неделящихся клеток штамма 18b in vivo в модели хронического туберкулеза у мышей (Sala C, Dhar N, Hartkoorn RC, Zhang M, Ha YH, Schneider P, Cole ST. Simple model for testing drugs against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2010, 54, 4150-8). Культура M. tuberculosis 18b (нереклицирующаяся культура, 14 дней инкубации в отсутствие стрептомицина) была инокулирована в каждую лунку планшета (конечная концентрация 3 х 10⁴ клеток / мл), содержащую 100 мкл среды 7Н9. В верхний ряд лунок планшета добавляли каждое из тестируемых соединений в концентрации 10 мкг/мл (максимальная концентрация тестируемых соединений), далее по вертикали вниз плашки было сделано семь последовательных двукратных разведений для каждого из исследуемых соединений (5,0; 2,5; 1,25; 0,625; 0,31; 0,16 мкг / мл), таким образом исследовались влияние на рост M. tuberculosis восьми различных концентраций каждого соединения. ДМСО (1%) и рифампицин (0,5 мкг / мл) использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Планшет инкубировали в течение 7 суток в статическом режиме при 37 °C, далее в каждую лунку добавляли 10 мкл стерильного 0,1%-го раствора резазурина (до конечной концентрации 0,025% вес/об) и инкубировали еще 16-18 часов (ночь) в аналогичных условиях, после чего на планшетном ридере TECAN Infinite M200 ("LifeSciences") измеряли уровень флюоресценции резазуринового метаболита резофурина (длина волны возбуждения и эмиссии 560 и 590 нм, соответственно). Данные временные параметры были подобраны опытным путем, исходя из минимального времени, за которое достижим стабильный и воспроизводимый результат детекции флюоресценции резофурина, и в соответствии с ранее опубликованным описанием резазуринового микроанализа [Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2720-2].

Средние значения флюоресценции и величины стандартных отклонений определялись исходя из 3 независимых изменений флюоресценции для каждой из исследуемых концентраций тестируемых соединений, соединение признавалось активным в данной концентрации, если среднее значение флюоресценции опытного образца превышало среднее значение флюоресценции отрицательного контроля на величину, равную трехкратному стандартному отклонению для среднего (из трех измерений) значения флюоресценции отрицательного контроля.

Полученные данные приведены в таблице 2.

Протокол оценки жизнеспособности клеток нереплицирующихся клеток штамма Mycobacterium tuberculosis в условиях дефицита калия

Проведено исследование выбранных соединений лидеров 2-тиопиридинов in vitro на модели латентного туберкулеза в условиях дефицита калия [Salina E, Ryabova O, Kaprelyants A, Makarov V. New 2-thiopyridines as potential candidates for killing both actively growing and dormant Mycobacterium tuberculosis cells. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 55-60] и использованием статистического метода «наиболее вероятных чисел» (НВЧ) [de Man JC. The probability of most probable numbers. J Appl Microbiol 1975; 1: 67-78]. Кратко, 2 х 10⁷ покоящихся "некультивируемых" микобактерий (КОЕ = 0) обрабатывали 25 мкМ каждого из наиболее активных соединений в течение 7 дней. Затем для определения числа потенциально реактивируемых покоящихся клеток готовили 10-кратные серийные разведения культур микобактерий туберкулеза в среде нормального состава (содержащих калий) в трех повторностях в 48-луночных планшетах. Планшеты инкубировали статически при 37 °С в течение 30 дней, лунки с видимым ростом бактерий учитывались как положительные. Количество реактивированных бактерий было рассчитано с использованием стандартного статистического метода [de Man JC. The probability of most probable numbers. J Appl Microbiol 1975; 1: 67-78]. Число реактивировавшихся покоящихся "некультивируемых" бактерий (значения НВЧ) после обработки соединениями сравнивали с числом реактивировавшихся клеток контрольного образца, необработанного соединениями, и вычисляли бактерицидный эффект каждого соединения против покоящихся клеток M. tuberculosis как отношение этих двух величин.

Полученные данные приведены в таблице 2.

Номер соединения Цитотоксичность
IC₅₀,
мкг/мл MIC₉₉, µg/mL
H37Rv MIC₉₉, µg/mL
ss18b LOG бактерицид-ный эффект в отношении дормантных не культивируемых бактерий A549
легкие HepG2
печень 1. 11126066 64 >25 0.78 0.78 2.97-3.22 2. 11126067 >100 >25 25 25 НТ 3. 11526065 >100 >100 25 >25 НТ 4. 11526066 >100 >100 25 >25 НТ 5. 11526067 32 8 25 25 НТ 6. 11526108 32 8 1,6 3,2 2.91-3.22 7. 11526109 32 8 1,5 1,5 2.97-3.22 8. 11526110 32 8 1,6 1,6 2.91-3.22 9. 11626056 >100 >100 0,3 0,6 3.91-4.14 10. 11626057 32 8 25 >25 НТ 11. 11626058 >100 >100 25 25 НТ 12. 11626059 64 32 6,2 6,2 НТ 13. 11626060 64 32 6,2 12,5 НТ 14. 11626062 32 8 3,6 3,6 НТ 15. 11626210 >100 >100 25 25 НТ 16. 11626211 >100 >100 25 >25 НТ 17. 11626212 >100 >100 12,5 12,5 2.94-4.00 18. 11626213 >100 >100 25 25 НТ 19. 11626214 >100 >100 25 >25 НТ 20. 11626215 32 16 6,2 6,2 НТ 21. 11626216 >100 >100 25 25 2.94-4.00 22. 11626217 >100 >100 25 >25 НТ 23. 11626218 >100 >100 25 >25 НТ 24. 11626219 >100 >100 25 25 НТ 25. 11626220 >100 >100 25 25 НТ 26. 11626223 >100 >100 6,2 12,5 НТ 27. 11626224 64 32 3,1 3,1 НТ 28. 11626225 >100 >100 25 25 НТ 29. 11626226 >100 >100 25 >25 НТ 30. 11626227 >100 >100 25 >25 НТ 31. 11626229 >100 >100 25 25 НТ 32. 11626230 32 8 12,5 12,5 НТ 33. 11626231 32 16 6,2 6,2 НТ 34. 11626232 64 32 25 >25 НТ 35. 11626233 >100 >100 25 25 НТ

Изобретение относится к соединениям, а именно к пираноиндолам общей формулы 1, где R¹ означает Н, HO, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, AcO, Cl, CF₃, CF₃O, NO₂, MeO; R² означает Н, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, Ac, CH₂Ph, CH₂Ph-4-CN, CH₂Ph-4-OMe; R³ означает Н, NHCH₃, NHC₃H₅; R⁴ означает CN, CONH₂, COOC₂H₅, NHCOPh, за исключением соединений 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил, 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-этоксикарбонил и 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбамид. Технический результат: получены новые соединения, которые могут найти применение в медицине в качестве противотуберкулезных лекарственных средств. 4 н.п. ф-лы, 2 табл., 32 пр.

1

1. Соединение общей формулы 1

1,

где

R¹ означает Н, HO, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, AcO, Cl, CF₃, CF₃O, NO₂, MeO;

R² означает Н, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, Ac, CH₂Ph, CH₂Ph-4-CN, CH₂Ph-4-OMe;

R³ означает Н, NHCH₃, NHC₃H₅;

R⁴ означает CN, CONH₂, COOC₂H₅, NHCOPh,

за исключением соединений 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил, 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-этоксикарбонил и 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбамид.
2. Соединение согласно формуле (1) где R¹ = R² = CH₃, R³ = H, R⁴ = CN.
3. Применение соединений по формуле (1) по п. 1

1,

где

R¹ означает Н, HO, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, AcO, Cl, CF₃, CF₃O, NO₂, MeO;

R² означает Н, CH₃, C₂H₅, C₃H₇, Ac, CH₂Ph, CH₂Ph-4-CN, CH₂Ph-4-OMe;

R³ означает Н, NHCH₃, NHC₃H₅;

R⁴ означает CN, CONH₂, COOC₂H₅, NHCOPh,

для профилактики и/или лечения туберкулезной инфекции у человека.
4.  Применение соединения по п. 2 для профилактики и/или лечения туберкулезной инфекции у человека, вызванной Mycobacterium tuberculosis.