СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованиям крови, и может быть использовано при изучении и лечении заболеваний воспалительного, аутоиммунного и дегенеративного генеза.

Способность лейкоцитов крови к адгезии (прилипанию) была известна давно. Однако значимость этого свойства долгое время недооценивалась.

В настоящее время адгезионным взаимодействиям различного типа клеток между собой, а также их взаимодействию с межклеточным матриксом отводится ведущая роль во многих процессах, развивающихся как в физиологических условиях, так и в условиях патологии. К их числу относятся такие, как активация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток, преодоление клетками гистогематических барьеров, передача всевозможных сигналов и другие. Прилипание (или распластывание клеток на субстрате) служит одним из проявлений их функциональной активации. В целостном организме адгезия клеток развивается по отношению к другим клеткам, эндотелию сосудов, межклеточному матриксу, а в условиях in vitro она воспроизводится в отношении неспецифических субстратов, в частности, к стеклу, к пластиковой поверхности, при этом предполагается, что данное явление отражает способность клеток к прилипанию к эндотелию.

В качестве материального субстрата, определяющего адгезивность клеток, в настоящее время рассматривают адгезивные молекулы (AM). Идентифицировано более 5 групп AM, в их числе интегрины, селектины, суперсемейство иммуноглобулинов и др. Применяемые для определения адгезивных молекул методы предполагают дифференцированное выявление отдельных форм AM и основаны на двух принципах.

Один из них связан с обнаружением мембранной формы AM, т.е. экспрессии определенного типа AM на поверхности клеток в выделенной взвеси лейко- или лимфоцитов. Оно проводится с помощью моноклональных антител (МКА). Другая форма существования молекул адгезии - растворимая (рАМ).

В настоящее время разработаны тест-системы для выявления рАМ (Фирма “R&D systems” USA). Однако их высокая стоимость чрезвычайно ограничивает возможность их использования как в клинических, так и экспериментальных условиях. Тест-системы отечественного производства, предназначенные для определения растворимых форм AM, до сих пор не производятся.

Наиболее близким техническим решением к изобретению является способ определения адгезивных свойств лейкоцитов, основанной на подавлении прилипания лейкоцитов после их контакта со специфическими антигенами - реакции подавления прилипания лейкоцитов, что позволяет определять клеточную реактивность (Д.Д.Харкевич и соовт. Микромодификация теста торможения прилипания лейкоцитов с использованием пластиковых микропланшет. Вопросы онкологии, т.31, №7, с. 17, 1985).

Этот способ включает в себя следующие операции: забор крови с гепарином, получение взвеси лейкоцитов путем отстаивания крови, центрифугирование для выделения лейкоцитов, отмывание последних от примеси эритроцитов и сыворотки, приготовление взвеси лейкоцитов, забор из нее определенного объема, инкубация взвеси лейкоцитов в лунках пластиковых микропланшет, а также подсчет количества клеток после инкубации. Данным способом адгезивные свойства лейкоцитов определяются лишь после их контакта со специфическими антигенами. Он не предполагает учета и вычисления отношения числа адгезивных клеток к неадгезивным в составе исследуемого образца лейкоцитов. Кроме того, не учитывается влияние аутосыворотки на адгезию лейкоцитов в виде возможного усиления адгезии лейкоцитов крови.

Техническим результатом изобретения является расширение функциональных возможностей способа и повышение его информативности за счет получения дополнительных показателей. А именно, показателей, позволяющих учитывать и вычислять отношение числа адгезивных клеток к неадгезивным в составе исследуемого образца лейкоцитов, а также учитывать влияние аутосыворотки на адгезию лейкоцитов.

Он достигается тем, что в известном способе, заключающемся в заборе гепаринизированной крови, отстаивании ее до получения плазмы к с лейкоцитами и центрифугировании для выделения последних, которые отмываются от примеси эритроцитов и сыворотки, а также в подсчете клеток в пробе из взвеси лейкоцитов после инкубации (В) в течение 1,5 часов при 37°С в лунках пластикового микропланшета, дополнительно готовят еще две пробы, одну из них используют для подсчета общего числа лейкоцитов до инкубации (А), вторую подвергают инкубации в том же режиме с добавлением аутосыворотки и считают количество клеток после инкубации (С), об адгезивных свойствах лейкоцитов крови судят по индексу спонтанной адгезии (Д), где , а эффект усиления адгезии клеток под воздействием аутосыворотки определяют по значению при К≥30%, где В - С - число клеток, подвергшихся дополнительной адгезии из-за добавления аутосыворотки.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ.

Вначале осуществляют забор гепаринизированной крови, затем отстаивают ее до получения плазмы с лейкоцитами. Последнюю центрифугируют для выделения лейкоцитов, которые отмывают от примеси эритроцитов и сыворотки. Далее готовят взвесь лейкоцитов, из которой берут 3 пробы в виде определенного объема. В первой пробе производят просчет общего числа лейкоцитов до инкубации (А). Вторую пробу инкубируют в течение 1,5 часов при t=37°С в лунке пластикового микропланшета и подсчитывают число неадгезивных клеток (В) - число клеток, остающихся после инкубации. Третью пробу лейкоцитов ставят с добавлением аутосыворотки, инкубируют при тех же условиях, после чего подсчитывают число неадгезивных клеток (С), что позволяет определить число лейкоцитов, подвергшихся дополнительной адгезии под влиянием аутосыворотки (В-С).

Индекс спонтанной адгезии Д отражает экспрессию мембранной формы AM на лейкоцитах и его вычисляют по формуле .

Другой параметр связан с учетом возможности выявления эффекта усиления адгезии клеток крови при инкубации в условиях добавления аутосыворотки. В случаях выявления указанного эффекта при постановки реакции получают уменьшение числа неприлипших клеток после инкубации. Разность между числом неприлипших клеток в пробе без аутосыворотки и их числом в пробе с добавлением аутосыворотки указывает на число клеток, подвергшихся дополнительной адгезии в связи с добавлением аутосыворотки (В-С), а их отношение к числу неприлипших клеток в третьей пробе (С), выраженное в процентах, указывает на степень усиления адгезии клеток под действием аутосыворотки (К).

Результат реакции, при котором величина К составляет 30% и более, выбран в качестве критерия эффекта усиления адгезии клеток. Такой результат отражает повышенный уровень рАМ в сыворотке крови.

Исследования, выполненные с помощью предложенного способа, позволили получить новую информацию, отражающую существенные различия величин Д и эффекта усиления адгезии у больных рассеянным склерозом (PC) по сравнению со здоровыми лицами, а также определить взаимосвязь этих параметров с особенностями течения заболевания.

Было обследован 81 больной PC и контрольная группа из 23 практически здоровых лиц.

В результате исследования был установлен диапазон колебаний значений Д, в контрольной группе его значения составляли от 9 до 38%, в группе больных PC - все значения были более высокими - до 63%, т.е. различие заключалось в преобладании высоких значений Д в группе больных PC. У 14,8% больных PC из числа лиц с высокими показателями адгезии обнаружены очень высокие значения Д (более 41%). У лиц контрольной группы такие показатели адгезивности не были зарегистрированы ни в одном наблюдении.

Таким образом, показатели Д более 38% следует расценивать как патологические.

Были обнаружены также достоверные различия показателей адгезивности лейкоцитов при сопоставлении подгрупп больных с различным характером течения PC, а также подгрупп с различной длительностью и тяжестью заболевания.

Эффект усиления адгезии клеток под действием аутосыворотки также несколько чаще отмечался по группе больных PC по сравнению с контрольной группой, однако, достоверность более высокой частоты выявления этого эффекта установлена лишь в подгруппах больных с первично прогредиентным течением PC, и у пациентов с тяжестью неврологического дефицита в 3,5-4,5 балла.

Полученные данные свидетельствуют о повышении уровня как мембранных, так и растворимых форм адгезивных молекул при PC. Эти результаты способствуют лучшему пониманию патогенеза заболевания, согласуются с опубликованными данными ряда зарубежных авторов о повышении содержания адгезивных молекул в крови больных PC, полученные с помощью других методов исследования, и должны учитываться при поиске и разработке новых адекватных терапевтических методов.

В патогенезе PC иммунным механизмам и молекулам адгезии отводится весьма важная роль. Вместе с тем, исследование адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови, в том числе, и с помощью предложенного способа может оказаться весьма полезным и дать новую информацию и при изучении заболеваний воспалительного, дегенеративного и иного генеза.

Преимуществом предлагаемого способа определения адгезивных свойств лейкоцитов крови, по сравнению с имеющимися иными способами определения мАМ и рАМ, является его простота, доступность и чрезвычайно низкая стоимость. Кроме того, предлагаемый способ дает информацию, отражающую суммарный уровень адгезивных молекул, в отличие от других методов, предполагающих дифференцированное выявление отдельных представителей различных классов AM, что более необходимо и оправдано в исследовательских целях.

Изобретение относится к медицине, в частности к исследованию крови, и может быть использовано при изучении и лечении заболеваний воспалительного, аутоиммунного и дегенеративного генеза. Способ заключается в заборе гепаринизированной крови, отстаивании ее до получения плазмы крови с лейкоцитами и центрифугировании для выделения последних, которые отмываются от примеси эритроцитов и сыворотки, а также в подсчитывании количества клеток в пробах из взвеси лейкоцитов после инкубации (В) в течение 1,5 часов при температуре 37°С в лунках пластикового микропланшета из взвеси лейкоцитов дополнительно готовят две пробы, одну из них используют для подсчета общего числа лейкоцитов до инкубации (А), вторую пробу подвергают инкубации в том же режиме с добавлением аутосыворотки и подсчитывают количество клеток, оставшихся после инкубации (С), об адгезивных свойствах лейкоцитов крови судят по индексу спонтанной адгезии (Д), где , а эффект усиления адгезии клеток под воздействием аутосыворотки определяют по значению при К≥30%, где В - С - число клеток, подвергшихся дополнительной адгезии из-за добавления аутосыворотки. Технический результат: расширение функциональных возможностей способа и повышение его информативности за счет получения дополнительных показателей, отражающих адгезивные свойства лейкоцитов крови.

Способ определения адгезивных свойств лейкоцитов крови, заключающийся в том, что осуществляют забор гепаринизированной крови, отстаивают ее до получения плазмы крови с лейкоцитами, которую затем центрифугируют для выделения лейкоцитов, последние отмывают от примеси эритроцитов и сыворотки, готовят взвесь лейкоцитов, из которой берут пробу, инкубируют ее в течение 1,5 ч при температуре 37°С в лунках пластикового микропланшета и подсчитывают количество клеток после инкубации (В), отличающийся тем, что из полученной взвеси лейкоцитов дополнительно готовят еще две пробы, одну из них используют для подсчета общего числа лейкоцитов до инкубации (А), вторую пробу подвергают инкубации в том же режиме с добавлением аутосыворотки и затем подсчитывают количество клеток, оставшихся после инкубации (С), о содержании адгезивных молекул на лейкоцитах крови судят по индексу спонтанной адгезии (Д), где

а эффект усиления адгезии клеток под воздействием аутосыворотки определяют по значению К≥30%, где

где В-С - число клеток, подвергшихся дополнительной адгезии из-за добавления аутосыворотки.