Способ определения митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов Российский патент 2017 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области биологии и медицины (физиологии, патофизиологии и т.д.), а именно к измерению характеристик крови (лейкоцитов) в организме (лабораторная оценка свойств клеток периферической крови человека и животных с диагностическими и научно-исследовательскими целями).

Известно, что все клетки организма способны к контактному (адгезивному) и дистантному химическому (опосредованному гуморальными факторами) взаимодействию. Среди механизмов межклеточного контактного взаимодействия клеток, в частности клеток крови, имеет место способность этих клеток к адгезии к окружающим их объектам. Специфические адгезивные взаимодействия между клетками обеспечиваются взаимным распознаванием адгезивных рецепторов и соответствующих им лигандов (субстратных адгезионных молекул - САМ), экспрессированных на их поверхности (Быков В.Л. Цитология и общая гистология. - СПб.: СОТИС, 1998, стр. 111).

Адгезивность клеток крови отражает в определенной степени их функциональное состояние при различных патологических процессах (лихорадка, воспаление, инфекционный процесс, некроз и др.). Процентное соотношения адгезированных и неадгезированных лейкоцитов в различные периоды болезни дают представления о динамике процессов (воспалительного, лихорадочного, инфекционного, иммунного и др.), влияющих на адгезивные свойства отдельных видов лейкоцитов (патент RU 2145084 G01N 33/48, G01N 33/49, опубл. 27.01.2000).

Известен метод подсчета агломерированных лейкоцитов в мазке крови больных инфарктом миокарда при просмотре препарата по диагонали (М.И. Китаев, В.М. Евстропов, В.Н. Клейменов. Лимфоцитарно-гранулоцитарное взаимодействие в феномене аллергической агломерации лейкоцитов (аллергенолейкергии) у больных инфарктом миокарда / Здравоохранение Киргизии, 1986, №1, стр. 43-45).

Известен способ определения адгезивности клеток периферической крови (патент RU 2145084, G01N 33/48, G01N, 33/49 опубл. 27.01.2000), включающий регистрацию лейкоцитов с учетом их агрегабильности, подсчет лейкоцитов с учетом их местонахождения в мазке и взаимосвязи с другими клетками.

Известно, что фитогемааглютинин (ФГА) взаимодействует почти со всеми углеводными компонентами гликопротеинов, поэтому его можно считать общим реагентом на гликопротены клеточной мембраны (Хомутовский О.А., Луцик М.Д., Передерей О.Ф. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран, Киев, 1986. 144 с.). ФГА усиливает адгезионную активность клеток (Хомерики С.Г., Кубатиев А.А., Шляпников В.П. Лектининдуцированная агрегация нейтрофильных гранулоцитов до и после облучения гелий-неоновым лазером // Гематол. и трансфузиол., 1993. №7, стр. 26-28). Изменения в системе циклических нуклеотидов и конформационная перестройка мембраны с усилением экспрессии ответственных за образование Е-РОК мембранных рецепторов под действием ФГА приводит к трансформации количественного и качественного состава других компонентов рецепторного аппарата клетки, в частности, адгезионных молекул, Считают, что не только уровень спонтанной адгезии лимфоцитов крови, но и характер изменения их адгезионной активности в ответ на добавление ФГА является одним из параметров иммунореактивности организма.

Известен способ определения изменения агрегации с ФГА нейтрофилов (Медведев И.Н., Скорятина И.А. Агрегация нейтрофилов у больных артериальной гипертонией с дислипидемией, получавших флувастин // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке», 2011, №3, том 13, стр. 360). Методологически выявлено изменение показателей спонтанной адгезии лимфоцитов и их чувствительности к модулятору адгезии - ФГА у здоровых лиц и у больных лимфатизмом (Патент RU 2193193, G01N 33/48, опубл. 20.11.2002), а также - стимуляция адгезии нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов при их инкубации с ФГА как у здоровых детей, так и у больных гастродуоденитом детей (Е.Е. Краснова, В.В. Чемоданов, Е.Н. Клыкова. Использование методов оценки функций лейкоцитов для диагностики хронического воспаления при гастродуодените у детей // Вопросы современной педиатрии, Выпуск №2, том 4, 2005, стр. 35-40.).

У практически здоровых лиц оседание эритроцитов, в основе которой лежит процесс их агрегации, в присутствии ФГА существенно нарастает. Исследование ФГА-реактивности эритроцитов, как и других клеток в клинической практике важны для понимания молекулярных механизмов патогенеза, основанных на участии эндогенных лектинов, обеспечивающих межклеточную кооперацию, столь важную при адекватном специфическом иммунном ответе. (Минеев В.Н., Нестерович И.И., Андреева А.В. Характеристика мембранно-рецепторного комплекса эритроцитов с помощью фитогемагглютинина при бронхиальной астме // Медицинская иммунология, 2003, том 5, №5-6, стр. 547-554).

Гордеева Е.Н.; Чемоданов В.В.; Краснова Е.Е. (Патент RU 2255337, G01N 33/49, опубл. 06.27. 2005) при оценке резервов функционального состояния рецепторного аппарата, необходимого для усиления адгезии, методологически определили усиление спонтанной адгезии лейкоцитов и повышение ее чувствительности к модулятору клеточной адгезии - ФГА.

Таким образом, представленные литературные данные свидетельствуют о наличии известных технологий (способов) изучения влияния митогенов (в частности ФГА) на адгезию клеток. Однако в доступной литературе мы не обнаружили описаний методов и способов, позволяющих характеризовать влияние митогенов (в частности ФГА) на адгезивность лейкоцитов, хотя известны способы определения самой адгезивности клеток: способ определения адгезивности клеток периферической крови (патент RU 2145084, G01N 33/48, G01N 33/49, опубл. 27.01.2000) и способ определения адгезивности клеток крови (патент RU 2542450 G01N 33/48, G01N 33/53, G01N 33/49, опубл. 20.02.2015).

Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения является способ определения адгезивности клеток крови (патент RU 2542450 G01N 33/48, G01N 33/53, G01N 33/49 опубл. 20.02.2015), включающий выделение и количественную стандартизацию лейкоцитов, учет адгезивности клеток по их агрегабельности между собой, по месторасположению и составу взаимодействующих клеток.

Однако известный способ не позволяет определять изменение адгезивности под действием митогена (митогениндуцированную адгезивность).

Задачей данного изобретения является повышение достоверности и эффективности способа, расширение его возможностей.

Сущность изобретения заключается в том, что способ определения митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов, включающий отбор проб крови, выделение лейкоцитов, инкубирование, фиксацию и окраску клеток, а также учет адгезивности клеток по их агрегабельности между собой, по месторасположению и составу взаимодействующих клеток, дополнительно определяют жизнеспособность лейкоцитов, клетки инкубируют с фитогемагглютинином и без него, в препаратах подсчитывают число агрегированных клеток, образующих клеточные агрегационные агломераты в количестве: трех клеток - показатель агломератов типа А1 - в контроле и А2 - в опыте, четырех клеток - показатель агломератов типа Б1 - в контроле и Б2 - в опыте, пяти клеток - показатель агломератов типа В1 - в контроле и В2 - в опыте, а также общее количество клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов, - показатель Т1 - в контроле и Т2 - в опыте, определяют лейкоцитарные индексы митогениндуцированной адгезивности в процентах: индекс митогениндуцированной адгезивности А (ИМАА): (А2-А1)/А1×100; индекс митогениндуцированной адгезивности Б (ИМАБ): (Б2-Б1)/Б1×100; индекс митогениндуцированной адгезивности В (ИМАВ): (В2-В1)/В1×100; тотальный - общий индекс митогениндуцированной адгезивности (ТИМА): (Т2-Т1)/Т1×100, сравнивают количественные значения лейкоцитарных индексов митогениндуцированной адгезивности у больных с контрольными значениями этих показателей у практически здоровых лиц, и при ИМАА от 18 до 19,1%, ИМАБ от 15,7 до 16,2%, ИМАВ от 8,3 до 13,3%, ТИМА от 16,2 до 17,4% делают вывод о снижении митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов на фоне уменьшения исходной адгезивности.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов согласно предлагаемому техническому решению, лейкоцитарную суспензию количественно стандартизируют и проводят инкубирование этих клеток без митогена и с митогеном, определяют индекс митогениндуцированной адгезивности данных клеток, что дает возможность охарактеризовать митогениндуцированную адгезивность лейкоцитов.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Из гепаринизированной крови выделяют лейкоциты с использованием раствора 10% раствора желатина в отношении 9:1, инкубируют 45 мин при 37°C, отбирают полученную лейковзвесь, дважды отмывают средой 199, оценивают жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим (0,1% раствор на фосфатном буфере pH 7,2-7,4), в количестве приблизительно 3×10⁶ клеток инкубируют на покровном стекле в среде 199, в течение 2 часов без добавления ФГА (исходная адгезивность - контроль) и с добавлением 2,5 мкг/мл ФГА (адгезивность, индуцируемая ФГА - опыт). Препарат фиксируют глутаровым альдегидом, этиловым спиртом, промывают в двух сменах дистиллированной воды и окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза. Под световым микроскопом подсчитывают 200 клеток с пометкой, регистрируют как свободнолежащие, так и агрегированные клетки, образующие клеточные агрегационные агломераты различных типов в количестве: трех клеток (показатель агломератов типа А), четырех клеток (показатель агломератов типа Б), пяти клеток (показатель агломератов типа В) и общее количество клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов (показатель Т).

Для оценки контрольных и опытных результатов данные показатели обозначают соответственно: А1 и А2, Б1 и Б2, В1 и В2, Т1 и Т2.

Определяют лейкоцитарные индексы митогениндуцированной адгезивности в процентах: индекс митогениндуцированной адгезивности А (ИМАА): (А2-А1)/А1×100; индекс митогениндуцированной адгезивности Б (ИМАБ): (Б2-Б1)/Б1×100; индекс митогениндуцированной адгезивности В (ИМАВ): (В2-В1)/В1×100, тотальный (общий) индекс митогениндуцированной адгезивности (ТИМА): (Т2-Т1)/Т1×100.

При изучении предлагаемым способом лейкоцитов у практически здоровых лиц (доноры, n=14) нами определены среднестатистические величины данных показателей (см. таблицу).

Пример 1

Забираем для обследования кровь у больного с наличием воспалительного процесса и лихорадки (воспаление легких). Выделяем лейкоциты с использованием раствора желатина, оцениваем их жизнеспособность в тесте с трипановым синим. Количество жизнеспособных клеток составляет 96%. В количестве 3×10⁶ клетки инкубируем на покровном стекле в среде 199 в течение 2 часов без добавления ФГА (контроль) и с добавлением 2,5 мкг/мл ФГА (опыт). Препарат фиксируем глутаровым альдегидом, этиловым спиртом, промываем в двух сменах дистиллированной воды и окрашиваем азур-эозином по Романовскому-Гимза. Под световым микроскопом подсчитываем 200 клеток с пометкой, регистрируем как свободнолежащие, так и агрегированные клетки, образующие клеточные агрегационные агломераты различных типов: в контроле (исходная адгезивность - без ФГА):

А1 = 68, Б1 = 43, В1 = 15, Т1 = 126;

в опыте (с ФГА):

А2 = 81, Б2 = 50, В2 = 17, Т2 = 148.

Рассчитываем лейкоцитарные индексы митогениндуцированной адгезивности: ИМАА = 19,1%, ИМАБ = 16,2%, ИМАВ = 13,3%, ТИМА = 17,4%. Делаем вывод о снижении митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов на фоне повышенной исходной адгезивности.

Пример 2

Забираем для обследования кровь у больного с герпетической инфекцией. При исследовании предлагаемым способом определяем: в контроле (исходная адгезивность - без ФГА)

А1 = 61, Б1 = 38, В1 = 12, Т1 = 111;

в опыте (с ФГА):

А2 = 72, Б2 = 44, В2 = 13, Т2 = 129.

Рассчитываем лейкоцитарные индексы митогениндуцированной адгезивности: ИМАА = 18%, ИМАБ = 15,7%, ИМАВ = 8,3, ТИМА = 16,2%. Делаем вывод о снижении митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов на фоне уменьшения исходной адгезивности.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять не только изменения митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов при различных патологических состояниях, но и характеризовать ее специфику относительно изменений исходной адгезивности лейкоцитов в клеточных агрегационных агломератах различных типов (А,Б,В), а также характеризовать изменения самой исходной адгезивности в клеточных агрегационных агломератах различных типов.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов. Для этого проводят отбор проб крови, выделение лейкоцитов, инкубирование, фиксацию и окраску клеток. Также проводят учет адгезивности клеток по их агрегабельности между собой, по месторасположению и составу взаимодействующих клеток. Дополнительно определяют жизнеспособность лейкоцитов. Для этого клетки инкубируют с фитогемагглютинином и без него. Затем в препаратах подсчитывают число агрегированных клеток, образующих клеточные агрегационные агломераты. Определяют лейкоцитарные индексы митогениндуцированной адгезивности в процентах и сравнивают количественные значения лейкоцитарных индексов митогениндуцированной адгезивности у больных с контрольными значениями этих показателей у практически здоровых лиц. Изобретение позволяет оценить митогениндуцированную адгезивность лейкоцитов у пациентов. 1 табл., 2 пр.

Способ определения митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов, включающий отбор проб крови, выделение лейкоцитов, инкубирование, фиксацию и окраску клеток, а также учет адгезивности клеток по их агрегабельности между собой, по месторасположению и составу взаимодействующих клеток, отличающийся тем, что дополнительно определяют жизнеспособность лейкоцитов, клетки инкубируют с фитогемагглютинином и без него, в препаратах подсчитывают число агрегированных клеток, образующих клеточные агрегационные агломераты в количестве: трех клеток - показатель агломератов типа А1 - в контроле и А2 - в опыте, четырех клеток - показатель агломератов типа Б1 - в контроле и Б2 - в опыте, пяти клеток - показатель агломератов типа В1 - в контроле и В2 - в опыте, а также общее количество клеток, участвующих в образовании агрегатов данных типов, - показатель Т1 - в контроле и Т2 - в опыте, определяют лейкоцитарные индексы митогениндуцированной адгезивности в процентах: индекс митогениндуцированной адгезивности А (ИМАА): (А2-А1)/А1×100; индекс митогениндуцированной адгезивности Б (ИМАБ): (Б2-Б1)/Б1×10; индекс митогениндуцированной адгезивности В (ИМАВ): (В2-В1)/В1×100; тотальный - общий индекс митогениндуцированной адгезивности (ТИМА): (Т2-Т1)/Т1×100, сравнивают количественные значения лейкоцитарных индексов митогениндуцированной адгезивности у больных с контрольными значениями этих показателей у практически здоровых лиц, и при ИМАА от 18% до 19,1%, ИМАБ от 15,7% до 16,2%, ИМАВ от 8,3% до 13,3%, ТИМА от 16,2% до 17,4% делают вывод о снижении митогениндуцированной адгезивности лейкоцитов на фоне уменьшения исходной адгезивности.