СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 A61P37/04 

Изобретение относится к области медицины, точнее к иммунологии, и касается средств, обладающих иммуностимулирующим действием, применяемых для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостаточностью иммунной системы при хронических рецидивирующих заболеваниях воспалительного характера, в случаях недостаточной эффективности антибактериальной и противовоспалительной терапии.

Известны средства синтетического и природного происхождения, применяемые для стимуляции иммунной системы. К ним относятся вещества микробного (бактериального и грибкового) происхождения (продигиозан, пирогенал, рибомунил, нуклеинат натрия); вещества растительного происхождения (тонзилгон, иммунал, различные препараты эхинацеи). Иммунорегуляторные пептиды естественного происхождения: препараты из вилочковой железы (тималин, тактивин, тимоптин, вилозен); препараты из селезенки (спленин); препараты из костного мозга: миелопид. Цитокины (натуральные и рекомбинантные). Синтетические и химически чистые иммуномодуляторы: аналоги препаратов эндогенного происхождения (тимоген, иммунофан, ликопид); лекарственные препараты (даларгин, левамизол, дибазол, дитиокарб, полиоксидоний) [2, 3, 5, 7, 8, 9].

Наличие побочных эффектов у большинства перечисленных препаратов в виде озноба, повышения температуры тела, головной боли, диспепсических нарушений, болезненности в месте парентерального введения препарата, отрицательное влияние при беременности, астме, аллергических заболеваниях в значительной мере ограничивают применение многих лекарственных средств с иммуностимулирующим действием.

Наиболее близким к заявленному средству является средство растительного происхождения, обладающее иммуностимулирующим действием, настойка эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea (L) Moench (Asteraceae)) (прототип) [1].

Разработка новых природных иммуномодуляторов, обладающих низким побочным действием, актуальна.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала малотоксичных средств, обладающих иммуностимулирующим действием, для иммунопрофилактики и лечения острых и хронических воспалительных процессов, иммунодефицитных состояний различного происхождения и прочих состояний, связанных с пониженным уровнем активности иммунной системы, не имеющих побочных эффектов и обладающих более пролонгированным стимулирующим действием.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве средства, обладающего иммуностимулирующим действием, используют высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L) Maxim (ЛB 1); сухую водную вытяжку высушенной измельченной надземной части лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L) Maxim при соотношении сырье : экстрагент 1:9 (ЛВ 2); сухую спиртовую вытяжку 40 процентным этиловым спиртом высушенной измельченной надземной части лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L) Maxim при соотношении сырье : экстрагент 1:9 (ЛВ 3); сухую спиртовую вытяжку 70 процентным этиловым спиртом высушенной измельченной надземной части лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L) Maxim при соотношении сырье : экстрагент 1:9 (ЛВ 4).

Лабазник вязолистный (таволга вязолистная) - Filipendula ulmaria (L) Maxim. Семейство розоцветных. Многолетнее травянистое растение с ползучим корневищем и высокими твердыми ребристыми стеблями, высотой до 150 см. Листья плотные, прерывисто-перистые, сверху зеленые, снизу беловойлочные. Цветки желтовато-белые, собраны в густое метельчатое соцветие. Цветет в июне-июле.

Распространен в лесной и лесостепной зонах и в горно-лесном поясе повсеместно. Растет в сырых лесах и колках, по уремам, берегам рек и болот, на влажных лугах [4, 6].

Растение содержит эфирное масло, состоящее из салицилового альдегида и гелиотропина, аскорбиновую кислоту, каротин, гликозид спиреин, ванилин, терпены, свободную салициловую кислоту, антоциановые, флавоновые, дубильные вещества пирокатехиновой и пирогалловой групп, фитонциды [1, 4, 6].

Новым в предлагаемом изобретении является то, что выявлено новое свойство надземной части лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L) Maxim), а именно - его иммуностимулирующее действие. Он оказывает более продолжительное стимулирующее влияние на показатели специфического гуморального иммунного ответа и неспецифическую резистентность организма в сравнении с широко используемой в практической медицине эхинацеей пурпурной.

Из литературных данных известно применение препаратов лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim) в виде отвара из корней и цветков в качестве антисептического, противовоспалительного, мочегонного, вяжущего средства при экземе, нейродермите, подагре, ревматизме, отеках, плеврите [1, 3], в виде примочек и полосканий при стоматитах, гингивитах, парадонтозе [3]. Отвар используется при гинекологических заболеваниях, при лечении гнойных ран, язв [1, 4]. В клинической медицине применяется как составная часть микстуры Здренко, назначаемой при папилломатозе мочевого пузыря и анацидном гастрите, тахикардии [I]. Показана высокая антиоксидантная активность отвара цветков лабазника вязолистного (Fihpendula ulmdria (L.) Maxim) [М.Л.Поспелова, 2000]. Иммуностимулирующие свойства лабазника вязолистного не описаны.

Основными зарегистрированными препаратами лабазника являются: лабазника вязолистного цветки (гемостатическое, противогеморроидальное, диуретическое средство), регистрационный номер 88/229/7; лабазника шестилепестного корневище и корень (составная часть микстуры Здренко, гемостатическое, противогеморроидальное, диуретическое средство), регистрационный номер 74/270/6.

Авторами не найдено в проанализированной литературе данной совокупности существенных признаков использования в качестве иммуностимулирующего средства надземной высушенной измельченной части лабазника вязолистного, сухой водной и спиртовой вытяжки.

Сравнение заявленного средства: ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4 с известными показывает, что впервые предложено использование извлечений из высушенной измельченной надземной части лабазника вязолистного в качестве иммуностимулирующего средства.

Таким образом, заявляемое средство, обладающее иммунностимулирующим действием, соответствует критериям изобретения "Новизна" и "Изобретательский уровень", так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "Промышленно применимо", так как оно с успехом может использоваться в практическом здравоохранении.

Иммунотропная активность заявленного средства: ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4, была изучена в эксперименте на животных, и показано его иммуностимулирующее действие в сравнении с иммуностимулирующим действием настойки эхинацеи пурпурной. Исследовалась активность извлечений из надземной части лабазника вязолистного, полученных следующими способами:

Пример 1. надземную часть лабазника вязолистного высушивали и измельчали до мелкодисперсного порошка (ЛВ 1);

Пример 2. высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного кипятили в дистиллированной воде при соотношении сырья и экстрагента 1:9 на водяной бане в течение 15 мин, затем остужали в течение 45 мин, фильтровали через 4 слоя марли, после чего упаривали досуха (ЛВ 2);

Пример 3. высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного заливали 40 процентным этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагента 1:9, настаивали 14 суток, полученный экстракт фильтровали через 4 слоя марли, после чего упаривали досуха (ЛВ 3);

Пример 4. высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного заливали 70 процентным этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагенга 1:9, настаивали 14 суток, полученный экстракт фильтровали через 4 слоя марли, после чего упаривали досуха (ЛВ 4).

Материал и методы.

Эксперименты выполнены на 180 мышах обоего пола линии CBA/CaLac 1 категории (конвенциональные линейные мыши) (сертификат имеется), полученные из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). До и в период эксперимента мыши находились в стандартных пластиковых клетках (по 10-12 особей) с мелкой древесной стружкой на стандартном рационе. Все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.

Экспериментальную модель цитостатической иммунодепрессии создавали с помощью стандартного препарата циклофосфана (производство Саранского комбината "Биохимик"), который растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили мышам однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе (250 мг/кг). Модель экспериментального стресса воспроизводили путем 16-часовой иммобилизации в полых замкнутых цилиндрах.

В работе использовали настойку эхинацеи пурпурной на 40% этиловом спирте (НЭП) "Эхинацея-Галено Фарм" (ОАО "Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга") (прототип), в качестве препарата сравнения. Перед введением экспериментальным животным настойку разводили дистиллированной водой в 2 раза и выпаривали до первоначального объема для удаления спирта. Настойку эхинацеи пурпурной и предлагаемое средство ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4, полученное в соответствие с примерами 1, 2, 3 и 4, вводили животным через зонд в желудок в течение 5 дней со дня экспериментального воздействия в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в дистиллированной воде в объеме 0,2 мл. Контрольным животным вводили соответствующий объем дистиллированной воды.

При изучении гуморального иммунного ответа мышей иммунизировали минимальной дозой эритроцитов барана (ЭБ) - 5× 10⁶ /мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения НЭП или ЛВ 1, 2, 3 и 4. На 7 сутки после иммунизации определяли абсолютное (× 10⁶/орган) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cuningham [10] и тигр (Log₂) антител (AT) в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА).

Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов определяли по [11]. После декапитации мышам внутрибрюшинно вводили 5 мл физиологического раствора и производили забор содержимого. Концентрацию живых клеток доводили до 0,75× 10⁶ клеток/мл. Полученную суспензию разливали в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм, инкубировали 1 час при 37° С, затем сливали надосадок и приливали раствор нейтрального красного, приготовленный из 1 части насыщенного раствора нейтрального красного и 99 частей раствора Хенкса. После инкубации в течение 1 часа при 37° С надосадок сливали и в каждую чашку добавляли по 3 мл лизирующего раствора (8 мл 0,2 М раствора Nа₂НРО₄·_{12Н2О соединяли с 12 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты, с помощью 1 N раствора NaOH доводили рН до 4,2; к 24 частям полученного нитратного буфера добавляли 76 частей 96% этанола) и перемешивали. Раствор сливали в кюветы шириной 0,5 см и измеряли оптическую плотность на фотоколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, выражая активность перитонеальных макрофагов в единицах оптической плотности х1000.}

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ "Statistica" с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования.

При исследовании абсолютного количества антителообразующих клеток в селезенке мышей, получавших ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4 в норме и после экстремальных воздействий (иммобилизационный стресс, циклофосфан), было выявлено, что ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4 на 7 сутки наблюдений приводил к нормализации абсолютного количества АОК у животных, иммунизированных ЭБ на фоне стрессового воздействия или введения цикдофосфана, в отличие от экспериментальных групп, не получавших предлагаемого средства (Табл.1).

Введение экстракта НЭП (прототип) привело к увеличению изучаемого показателя на 7 сутки наблюдений, но абсолютное количество АОК в этих экспериментальных группах было статистически ниже, чем при введении предлагаемого средства (Табл.1).

Содержание сывороточных гемагглютанинов класса М при введении предлагаемого средства на 7 сутки наблюдений снижалось в группе животных, иммунизированных ЭБ после иммобилизционного стресса, в сравнении с соответствующей группой, не получавшей препарат (Табл.2). Данный факт свидетельствует о смещении переключения синтеза IgМ на IgG на более ранние сроки, что косвенно подтверждается нарастанием на 7 сутки исследований титра гемагглютининов класса G до уровня соответствующего значения в контрольной группе (Табл.3). После введения предлагаемого средства мышам, получившим циклофосфан, наблюдалось увеличение тигра IgM-антител в сравнении с соответствующей контрольной группой (Табл.2). Титр сывороточных гемагглютининов класса М при введении НЭП группе животных после применения циклофосфана было на 7 сутки исследований достоверно ниже, чем в группах животных, получавших предлагаемое средство: ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4.

Динамика содержания ммуноглобулинов класса G в сыворотке крови животных, получавших НЭП, была сходной с динамикой данного показателя в группах животных после курсового введения предлагаемого средства.

При сравнении показателей фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов при введении как НЭП (прототип), так ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3 и ЛВ 4 (заявленное средство) на 7 сутки наблюдений было выявлено стимулирующее влияние всех препаратов на изучаемый показатель в группах, перенесших иммобилизационный стресс, либо введение циклофосфана в сравнении с соответствующими контрольными группами без введения препарата.

Таким образом, введение предлагаемого средства ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3, ЛВ 4 привело к более выраженной и продолжительной стимуляции гуморального иммунного ответа, чем при введении НЭП (прототип). При этом ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3 и ЛВ 4 практически близки по уровню оказываемого воздействия на специфический гуморальный ответ. Влияние на неспецифическую резистентность организма (фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов) ЛВ 1, ЛВ 2, ЛВ 3 и ЛВ 4 (заявленное средство) было сопоставимо с эффектом НЭП (прототип).

Литература.

1. Завражнов В.И., Китаева Р.И., Хмелев К.Ф. Лекарственные растения: Лечебное и профилактическое использование. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1993. - 480 с.

2. Лесков В.П., Чередеев А.Н., Горлина Н.К., Новоженов В.Г. Клиническая иммунология для врачей. М., 1997. - 124 с.

3. Машковский М.Д. Лекарственный средства. В 2-х частях.- 12-е изд., переработанное и дополненное. М.: Медицина, 1993.

4. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск: Наука, 1991. - 431 с.

5. Новиков Д.К., Деркач Ю.Н., Новиков П.Д. Иммунотропные лекарства // В мире лекарств. - 1999. - №2. - С.48-57.

6. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Hydrangeaceae - Haloragaceae, - Л.: Наука, 1987. - 326 с.

7. Утешев B.C., Сергеев А.С., Коростелев С.А. Анализ современных направлений в создании иммунотропных средств // Эксперим. и клинич. фармакол. - 1995. - №3. - С.3-7.

8. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотропных лекарственных средствах // Иммунология. - 1996. - №6. - С.4-9.

9. Ширинский B.C. Вторичные иммунодефициты - проблемы диагностики и лечения. Новосибирск, 1997. - 111 с

10. Cuningham A.I. // Nature. - 1965. - V.207. - Р.4313.

11. Vrav B., Hoebeke J., Saint-Girillain M. e.a. // Scand. J. Immunol. - 1980. - Vol.11 - P.147-153.

Таблица 1ГруппыАОКИнтактный контроль2,28± 0,18Иммунизация ЭБ11,69± 0,29* * * Иммобилизация + иммунизация3,87± 0,24* # # # Циклофосфан + иммунизация4,54± 0,53* # # # НЭП + иммунизация11,98± 0,13* * * НЭП + иммобилизация + иммунизация6,54± 0,52* * * # # $НЭП + циклофосфан + иммунизация9,24± 0,98* * * # $$ЛВ1 + иммунизация9,33± 0,67* * * ЛВ1 + иммобилизация + иммуиизация10,58± 0,78* * ЛВ1 + циклофосфан + иммунизация9,09± 0,75* * * ЛВ2 + иммунизация10,79± 0,99* * * ЛВ2 + иммобилизация + иммунизация9,33± 0,67* * * ЛВ2 + циклофосфан + иммунизация8,63± 1,01* * * # # ЛВ3 + иммунизация9,14± 0,17* * * ЛВ3 + иммобилизация + иммунизация10,24± 0,58* * ЛВ3 + циклофосфан + иммунизация12,75± 0,81* * * $$$ЛВ4 + иммунизация13,12± 0,97* * * ЛВ4 + иммобилизация + иммунизация10,89± 0,84* * ЛВ4 + циклофосфан + иммунизация9,98± 0,81* * * $Примечание (здесь и далее в табл.2, 3). * - достоверность различий с фоновой группой; # - с контрольной группой ЭБ, $ - с соответствующей контрольной группой (группой иммунизированной ЭБ на фоне введения препарата).

Таблица 2ГруппыlgMИммунизация ЭБ2,75± 0,92Иммобилизация + иммунизация3,99± 0,52# # # Циклофосфан + иммунизация2,32± 0,32# НЭП + иммунизация3,05± 0,22НЭП + иммобилизация + иммунизация3,63± 0,92# $НЭП + циклофосфан + иммунизация2,92± 0,57$ЛВ1 +иммунизация2,95± 0,97ЛВ1 +иммобилизация + иммунизация3,00± 0,78# $ЛВ1 +циклофосфан + иммунизация2,25±0,75#ЛВ2 + иммунизация2,65± 0,65ЛВ2 + иммобилизация + иммунизация2,95± 0,47# $$ЛВ2 + циклофосфан + иммунюация2,50± 0,41ЛВ3 + иммунизация2,25± 0,22ЛВ3 + иммобилизация + иммунизация3,20± 0,16# $ЛВ3 + циклофосфан + иммунизация3,40± 0,38# # $$ЛВ4 + иммунизация2,00± 0,35# # ЛВ4 + иммобилизация + иммунизация3,00± 0,74# # $$ЛВ4 + циклофосфан + иммунизация2,65± 0,68$

Таблица 3ГруппыIgGИммунизация ЭБ11,57± 0,92Иммобилизация + иммунизация7,65± 0,28# # Циклофосфан + иммунизация6,52± 0,37# # НЭП + иммунизация10,52± 1,07НЭП + иммобилизация + иммунизация9,12± 0,80$НЭП + циклофосфан + иммунизация7,92± 0,49$ЛВ 1 + иммунизация10,02± 1,00ЛВ 1 + иммобилизация + иммунизация6,65± 0,88# # $ЛВ 1 + циклофосфан + иммунизация6,82± 0,65# # ЛВ2 + иммунизация9,02± 0,69# ЛВ2 + иммобилизация + иммунизация7,12± 0,57# # ЛВ2 + циклофосфан + иммунизация7,02± 1,01# # ЛВ3 + иммунизация11,82± 0,26ЛВ3 + иммобилизация + иммунизация11,12± 1,16$$ЛВ3 + циклофосфан + иммунизация9,92± 0,40$ЛВ4 + иммунизация10,72± 1,27ЛВ4 + иммобилизация + иммунизация9,92± 0,89$$ЛВ4 + циклофосфан + иммунизация7,92± 0,81# $

Таблица 4ГруппыФАПМИнтактный контроль91,2± 7,20Иммобилизация80,9± 8,20* * Циклофосфан51,2± 6,60* * * НЭП125,3± 3,10* НЭП + иммобилизация114,3± 6,54$$НЭП + циклофосфан103,2± 3,69$$$ЛВ1120,5± 8,36* * ЛВ1 + иммобилизация105,2± 9,6$$ЛВ1 + циклофосфан95,2± 5,77$$ЛВ296,2± 6,60ЛВ2 + иммобилизация115,6± 13,65* $ЛВ2 + циклофосфан90,3± 5,56* $ЛВ3150,8± 7,60* * ЛВ3 + иммобилизация138,1± 15,60ЛВ3 + циклофосфан128,8± 6,78* $$ЛВ4145,6± 8,65* * ЛВ4 + иммобилизация130,2± 10,62ЛВ4 + циклофосфан11б,3± 9,78* $$Примечание. * - достоверность различий с фоновой группой; # - с контрольной группой ЭБ, $ - с соответствующей контрольной группой (получавшей только препарат).

Изобретение относится к иммунологии и предназначено для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостаточностью иммунной системы при хронических рецидивирующих заболеваниях воспалительного характера, в случаях недостаточной эффективности антибактериальной и противовоспалительной терапии. Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, содержит высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L.), сухую водную или сухую спиртовую вытяжку лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L.) Maxim, полученную при определенном соотношении сырье : экстрагент. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, включающее вытяжку растительного сырья, отличающееся тем, что содержит сухую водную или сухую спиртовую вытяжку лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L.) Maxim, полученную при соотношении сырье:экстрагент 1:9.2. Средство, по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного.3. Средство, по п.1, отличающееся тем, что оно содержит 40%-ную спиртовую вытяжку.4. Средство, по п.1, отличающееся тем, что оно содержит 70%-ную спиртовую вытяжку.