ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2003 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к терапии воспалительных заболеваний, и может быть использовано в качестве противовоспалительного средства.

Известны противовоспалительные синтетические препараты, например, ацетилсалициловая кислота, индометацин [5]. Однако до настоящего времени использование современных противовоспалительных синтетических средств для фармакологической коррекции воспалительного процесса ограничено из-за плохой переносимости, большого количества побочных эффектов.

Наиболее близким (прототипом) является противовоспалительное средство - сгущенный 70%-ный спиртовый экстракт из цветков лабазника вязолистного [13].

Проблема воспаления занимает существенное место в современной медицине. В связи с этим расширение арсенала средств, обладающих противовоспалительным действием, наиболее выраженными биологическими эффектами, из растительного сырья является актуальной задачей.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств из природного сырья, обладающих высокой фармакологической активностью.

Поставленная задача достигается тем, что противовоспалительное средство содержит 40%-ную спиртовую вытяжку из высушенных измельченных листьев и стеблей лабазника вязолистного при соотношении в весовых частях сырье : экстрагент 1:10.

В народной медицине лабазник вязолистный широко используется в качестве вяжущего средства при кровотечениях (маточных, легочных, желудочно-кишечных), поносах, дизентерии, геморрое, а также как мочегонное, потогонное, противоревматическое и ранозаживляющее средство [6, 7, 9, 11]. Впервые показано, что 40%-ная спиртовая вытяжка из листьев и стеблей лабазника вязолистного (в предлагаемом соотношении) оказывает противовоспалительное действие. Авторы не нашли в проанализированной литературе сведений о противовоспалительном свойстве 40%-ного спиртового извлечения из листьев и стеблей лабазника вязолистного.

Из литературных данных известно, что сгущенный 70%-ный спиртовый экстракт из цветков лабазника вязолистного обладает противовоспалительным действием [13] . Однако использование листьев и стеблей лабазника вязолистного в качестве противовоспалительного средства является фактором не очевидным, так как химический состав листьев и стеблей лабазника отличен от химического состава цветков.

Количественный и качественный состав действующих веществ, находящихся в разных органах лабазника вязолистного, подтвержден литературными данными [1, 4, 8, 9] . Данные отличия касаются качественного полифенольного состава листьев и стеблей лабазника. К ним относятся разный состав флавоноидов (в цветках - кверцетин, спиреозид, 3-глюкопиранозид кверцетина, неидентифицированный гликозид кемпферола; в листьях - гиперозид, авикулярин, дипентозид кверцетина, лютеолин, кемпферол, цианидин и неидентифицированный гликозид кверцетина) и различное содержание фенолкарбоновых кислот (в цветках - галловая, салициловая кислоты; в листьях - кофейная, эллаговая, n-кумаровая, феруловая кислоты). При этом процентное содержание флавоноидов в листьях и стеблях лабазника вязолистного практически в 2 раза превышает таковое в цветках. Отличия в химическом составе касаются и тех биологически активных веществ, которые обнаружены только в листьях и стеблях (катехины и кумарины), а не в цветках лабазника.

Нами был также проведен хроматографический анализ 40%-ного спиртового экстракта из листьев и стеблей лабазника вязолистного, который показал, что в качестве главной составной части в него входят фенольные гликозиды - спиреин, гаултерин, монотропитин и изосалицин, оказывающие в организме животного выраженное противовоспалительное действие. Содержание суммы фенолгликозидов в 40%-ной спиртовой вытяжке из листьев и стеблей лабазника в пересчете на спиреин и гаултерин не менее 2%, суммы флавоноидов (гиперозида, авикулярина, дипентозида кверцетина, лютеолина, кемпферола, цианидина, неидентифицированного гликозида кверцетина) 12,8-15,7%.

Из литературных данных известно, что в листьях и стеблях фитопрепарата содержатся дубильные вещества - 3,63-16,85%, катехины, кумарины, фенолкарбоновые кислоты и небольшое количество аскорбиновой кислоты (6 мг в пересчете на 100 г воздушно-сухих листьев и стеблей), что также оправдывает его применение в качестве противовоспалительного средства [3, 9, 14].

Нами экспериментально установлена возможность использования 40%-ной спиртовой вытяжки из высушенных измельченных листьев и стеблей лабазника в качестве противовоспалительного средства в медицине. Предлагаемое решение соответствует критериям изобретения "изобретательский уровень". Предлагаемое изобретение является новым и его возможно использовать в практическом здравоохранении. Таким образом, предлагаемое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Предлагаемое противовоспалительное средство получают следующим образом. Собранные в июле листья и стебли лабазника вязолистного высушивают, измельчают до 3 мм. Взвешенное количество измельченного сырья экстрагируют 40%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1:10, настаивают при комнатной температуре 10 суток при периодическом помешивании, затем вытяжку фильтруют, сырье хорошо отжимают, измеряют объем полученного извлечения, шрот еще раз промывают экстрагентом в количестве, равном недостающему объему извлечения, и обе порции объединяют.

Конкретный пример выполнения способа. Собранные в июле листья и стебли лабазника высушивают, измельчают до размера частиц 3 мм, 100 г измельченного сырья лабазника заливают до 1000 мл 40%-ным этиловым спиртом и настаивают в течение 10 суток при комнатной температуре, периодически помешивая, затем фильтруют через фильтровальную бумагу и измеряют объем извлечения. Он был равен 750 мл для листьев и стеблей лабазника вязолистного. Сырье хорошо отжимают, заливают шрот недостающим количеством экстрагента (250 мл) и еще раз отжимают, доводят извлечение до первоначального объема (1000 мл) 40%-ным этиловым спиртом. Спиртовые вытяжки хранят в прохладном темном месте.

Для доказательства противовоспалительного действия 40%-ной спиртовой вытяжки из высушенных измельченных листьев и стеблей лабазника вязолистного было проведено четыре исследования: первое - на модели острого асептического воспаления [18], второе - на модели формалинового воспаления [15], третье - на модели иммунологического воспаления [16], четвертое - на модели хронического пролиферативного воспаления [17]. Экспериментальные животные были распределены на три части: контрольная, группа сравнения, опытная. В группе сравнения в качестве препарата сравнения использовали 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника (прототип), ацетилсалициловую кислоту (300 мг/кг) или индометацин (6 мг/кг) [5]. В контрольной группе животные получали эквивалентный объем дистиллированной воды. В опытных группах животные получали 40%-ную спиртовую вытяжку из листьев и стеблей лабазника вязолистного в широком диапазоне доз. Исследование противовоспалительной активности проводили в эксперименте на беспородных мышах массой 18-20 г и крысах линии Wistar массой 150-180 г. Животных содержали на обычном пищевом рационе в условиях вивария. Эвтаназию производили, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденных Министерством Здравоохранения России, путем дислокации шейных позвонков.

Полученные результаты обрабатывали статистически, используя параметрический (критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) методы, метод углового преобразования Фишера [2].

В экспериментальных исследованиях для изучения противовоспалительных средств наиболее широко применяется модель острого воспалительного отека, вызванного каррагенином, которая позволяет объективно оценить противоэкссудативное действие препаратов и предсказать их клиническую эффективность [12] . Для изучения влияния предлагаемого нами средства из листьев и стеблей лабазника вязолистного на течение острого асептического воспаления в качестве препаратов сравнения были взяты 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника (прототип), ацетилсалициловая кислота.

Конкретный пример выполнения первого эксперимента.

В ходе выполнения эксперимента 40%-ное спиртовое извлечение из листьев и стеблей лабазника вязолистного, 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника (прототип) (250 мг/кг), ацетилсалициловую кислоту (300 мг/кг) или воду (контроль) вводили через зонд в желудок профилактическим курсом в течение 5 дней однократно, последний раз - за один час до воздействия на животных. Настойку из листьев и стеблей изучаемого растения вводили в широком диапазоне доз: 15,0; 10,0; 5,0; 2,5; 1,25; 0,7 мл/кг.

Острое асептическое воспаление вызывали введением под плантарный апоневроз левой задней лапки мыши 0,05 мл 1%-ного раствора каррагенина на изотоническом растворе хлорида натрия. Через 3,5 часа животных забивали, отрезали обе задние лапки по коленный сустав, взвешивали [18]. Об эффективности препаратов судили по проценту снижения отека.

В результате проведенного исследования было показано, что 40%-ная спиртовая вытяжка из высушенных измельченных листьев и стеблей лабазника во всех изученных дозах ослабляет флогогенное действие каррагенина. В группе контрольных животных на пике каррагенинового воспаления (через 3,5 часа после действия флогогена) развившийся отек достигал 152,6% от исходного уровня, многократно превышая таковой у мышей, получавших ацетилсалициловую кислоту и исследуемые фитопрепараты (табл. 1). При этом наибольший антиэкссудативный эффект проявлялся у животных, принимавших аспирин (снижение экссудации на 38,1%). Однако настойка лабазника не уступала по своему противовоспалительному действию ацетилсалициловой кислоте (табл. 1). Так, настойка фитопрепарата в дозах 0,7; 1,25; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0 мл/кг достоверно уменьшала выраженность отека на 24,5; 22,2; 19,2; 37,4; 20,5 и 35,9% соответственно по сравнению с мышами, получавшими только воду. Взятый в качестве препарата сравнения 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника только на 15,7% снижал степень выраженности отека (табл. 1).

Второй эксперимент был выполнен на модели формалинового воспаления.

Конкретный пример выполнения второго эксперимента.

Формалиновый отек вызывали субплантарным введением под плантарный апоневроз правой задней лапки крысам 0,1 мл 2%-ного раствора формалина [15]. Исследуемый растительный препарат, препарат сравнения - ацетилсалициловую кислоту или воду (контрольная группа) вводили через зонд в желудок лечебным курсом до полного исчезновения воспалительной реакции поврежденной конечности, первое введение - за 1 час до инокуляции воспалительного агента. В качестве критерия оценки использовали выраженность гиперемии в условных единицах в нашей модификации:
0,5 баллов - локальная слабая гиперемия воспаленной конечности;
1,0 балл - легкая гиперемия (розового цвета) всей конечности;
2,0 балла - умеренная гиперемия (красного цвета) всей конечности;
3,0 балла - сильная гиперемия (темно-красного цвета) всей конечности.

Величину отека определяли с помощью плетизмометра, измеряющего объем жидкости, вытесненной при погружении в нее конечности. Отеки и гиперемия фиксировались в динамике каждые 2 дня. Процент прироста отека рассчитывали по формуле [10]:

Максимальное развитие отека, о котором судили по приросту воспаленной конечности крыс в процентах, зафиксировано у животных всех групп на 1-е сутки после введения флогогена. В группе контрольных животных на пике воспаления (1-е сутки) формалиновый отек достигал 35% от исходного уровня. При этом у животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, наблюдался самый большой объем лапы, достоверно превышающий таковой в контроле в 1,4-1,5 раза (через 3 часа, на 1-е и 2-е сутки). В последующие дни показатели прироста объема конечности крыс этой группы не отличались от таковых в контроле (табл. 2).

40%-ная спиртовая вытяжка из листьев и стеблей растения в дозах 0,35; 0,7 и 1,25 мл/кг сдерживала развитие отека, начиная уже со 2-х суток, в 1,6-1,7 раза по сравнению с контролем, продолжая уменьшаться в среднем в 2-3 раза в последующие сутки. У крыс, получавших настойку в дозе 0,35 мл/кг, уже на 9-е сутки наблюдалась нормализация объема конечности до уровня нормы; в дозах 0,7; 1,25 и 2,5 мл/кг - на 11-е сутки, в то время как в контроле отек спадал только к 15-м суткам. У животных, получавших исследуемый фитопрепарат в дозе 2,5 мл/кг, была зафиксирована лишь тенденция к снижению процента прироста воспаленной конечности на всем протяжении эксперимента (табл. 2).

Гиперемия была наиболее выражена через 24 часа во всех исследуемых группах, но уже на 2-е сутки уменьшалась в 1,5-3 раза. Однако на 5-е сутки после введения раздражителя вновь наблюдался пик гиперемии, который снова снижался к 7-м суткам (табл. 3). На фоне терапии аспирином и настойкой из листьев и стеблей лабазника значительное ослабление гиперемии (для аспирина в 2 раза, для фитопрепарата в дозах 0,35; 0,7; 1,25 и 2,5 мл/кг - в 1,4-2 раза) наблюдалось уже через 3 часа и в последующие дни наблюдения (табл. 3). Причем полное исчезновение гиперемии происходило у крыс, принимавших 40%-ную спиртовую вытяжку из листьев и стеблей лабазника в дозе 0,7 мл/кг - к 11-м суткам, в дозе 0,35 мл/кг - к 13-м суткам, а в дозах 1,25 и 2,5 мл/кг - к 15-м суткам. В группе контрольных животных гиперемия проходила только к 19-м суткам эксперимента (табл.3).

Кроме того, начиная с 5-х суток после индукции воспаления, у крыс появлялся некроз поврежденной конечности, который полностью исчезал в контроле только к 22-му дню исследования. При оценке процента животных с некрозом оказалось, что наиболее эффективным оказался фитопрепарат в дозах 0,35 и 0,7 мл/кг, где с 5-х и 11-х суток у 20% крыс отсутствовало повреждение лапы, у остальных полностью проходило к 19-м суткам эксперимента. Настойка в дозах 1,25 и 2,5 мл/кг действовала в более поздние сроки развития формалинового воспаления, когда только на 15-е сутки происходило снижение до 20 и 25% животных с некротизированными конечностями и отсутствием их на 19-е сутки (табл. 4).

Третий эксперимент - изучение противовоспалительного действия 40%-ного спиртового извлечения из листьев и стеблей лабазника вязолистного на модели иммунологического воспаления. Многочисленные исследования посвящены изучению действия синтетических противовоспалительных средств при адъю-вантной болезни, являющейся одной из наиболее адекватных моделей коллагенозов человека [7].

Конкретный пример выполнения третьего эксперимента.

Иммунное воспаление вызывали полным адъювантом Фрейнда (0,1% взвесь в вазелиновом масле микобактерий БЦЖ, убитых нагреванием). Флогоген вводился крысам под плантарный апоневроз задней правой лапки однократно в дозе 0,1 мл [16] . Исследуемый фитопрепарат, препараты сравнения - ацетилсалициловую кислоту (200 мг/кг) и индометапин (6 мг/кг) или воду (контрольная группа) начинали вводить внутрижелудочно за сутки до инокуляции адъюванта и продолжали применять лечебным курсом на протяжении всего развития воспалительного процесса. Определение величины воспаленного сустава проводили с помощью плетизмометра. В качестве критерия оценки, так же как и при формалиновом воспалении, использовали выраженность гиперемии в условных единицах, а также % прироста отека, рассчитываемый по формуле 1. Отеки и гиперемия фиксировались в динамике каждые 2 дня.

Проведенные исследования показали, что прирост пораженного сустава был выражен у контрольных животных уже через 3 часа после введения адъюванта с последующим нарастанием в 1-3-е сутки эксперимента (табл. 5). При этом у животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, индометацин и 40%-ную спиртовую вытяжку из листьев и стеблей растения в дозах 0,35 и 2,5 мл/кг, через 3 часа после инъекции флогогена происходило снижение экссудативной реакции в очаге воспаления в 1,2; 2,3; 2,5 и 1,8 раза соответственно. Однако на 1-е сутки эксперимента наблюдался провоспалительный эффект у животных, получавших аспирин и настойку в дозе 1,25 мл/кг (в 1,4 раза увеличивался объем лапы). На 3-е сутки только настойка лабазника в дозе 2,5 мл/кг достоверно подавляла развитие отека в 1,7 раза. Наиболее эффективными дозами настойки изучаемого фитопрепарата, которые с 6-х по 13-е сутки снижали отек воспаленной конечности в 2-3 раза, оказались 0,35 и 0,7 мл/кг. Под влиянием фитопрепарата в дозах 1,25 и 2,5 мл/кг у животных, начиная с 8-х по 13-е сутки, также происходило снижение интенсивности отека в 1,5-2,7 раза (табл. 5). Препарат сравнения индометацин достоверно угнетал прирост воспаленного сустава у крыс на 6-10-е сутки - в 1,5-2,3 раза, но 60% животных этой группы погибло на 13-е сутки. Другой препарат сравнения ацетилсалициловая кислота снижала объем воспаленной конечности на 10-е, 13-е и 15-е сутки в 1,7-1,8 раза (табл. 5).

Под действием аспирина и индометацина гиперемия была выражена значительно слабее уже на 1-е сутки, полностью исчезая к 6-м суткам исследования, в то время как в контроле она сохранялась до 10 дней. 40%-ная спиртовая вытяжка из листьев и стеблей лабазника в дозах 0,35 и 0,7 мл/кг достоверно снижала выраженность гиперемии в 2 раза только на 6-е сутки, а к 8-м суткам она полностью исчезала. В более высоких дозах (1,25 и 2,5 мл/кг) настойка из листьев и стеблей изучаемого растения была не эффективна (табл. 6).

Для изучения действия 40%-ного спиртового извлечения из листьев и стеблей лабазника вязолистного на течение пролиферативной фазы воспаления нами был выполнен четвертый эксперимент на модели "ватной гранулемы" [17] в нашей модификации. В качестве препаратов сравнения в данном эксперименте для всех групп животных были взяты 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника вязолистного (прототип), ацетилсалициловая кислота и индометацин.

Конкретный пример выполнения четвертого эксперимента.

Стерильный ватный тампон (массой 13 мг) имплантировали с помощью иглы для взятия крови крысам под кожу спины между лопатками. 40%-ную спиртовую вытяжку из листьев и стеблей лабазника в дозах 5,0; 2,5; 1,25; 0,7 мл/кг, 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника в дозе 250 мг/кг (прототип), ацетилсалициловую кислоту (200 мл/кг), индометацин (6 мг/кг) или воду (контроль) вводили внутрижелудочно ежедневно (со дня имплантации) в течение 7 дней. На 8-е сутки животных забивали, гранулему вычленяли, взвешивали в сыром и затем в высушенном виде. Показано, что наряду с противоэкссудативным влиянием настойка лабазника оказывает действие на пролиферативную фазу воспаления, замедляя развитие гранулемы. Так под ее влиянием масса сухой грануляционно-фиброзной ткани уменьшалась в 1,2-1,4 раза. Препараты сравнения - 70%-ный сгущенный спиртовый экстракт из цветков лабазника вязолистного (прототип), индометацин и ацетилсалициловая кислота в меньшей степени угнетали образование грануляционной ткани (на 14,0, 16,7 и 10,8% соответственно). Кроме того, настойка из листьев и стеблей лабазника в дозах 0,7; 2,5 и 5,0 мл/кг достоверно снижала в 1,6-1,7 раза объем экссудата (табл. 7).

Таким образом, предлагаемое нами средство обладает выраженной противовоспалительной активностью. При сравнении с 70%-ным сгущенным спиртовым экстрактом из цветков лабазника (прототип), известными противовоспалительными препаратами ацетилсалициловой кислотой и индометацином предлагаемое средство из листьев и стеблей лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim. ) не уступает по эффективности, а в ряде случаев и превосходит его (табл. 1, 2, 5, 7).

Источники информации
1. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. - Новосибирск: Наука, 1990. - 333 с.

2. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л., 1978 - 193 с.

3. Йорданов Д., Николов П., Бойчинов Асп. Фитотерапия. Лечение травами. - София, 1970. - 344 с.

4. Кучеров В.Е., Лазарева Д.Н. Целебные растения и их применение. - Уфа, 1993. - 288 с.

5. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Т. 2. - М., 1998. - 592 с.

6. Пастушенков Л. В., Пастушенков А.Л., Пастушенков В.Л. Лекарственные растения. - Л., 1990. - 383 с.

7. Подымов А.И., Суслов Ю.Д. Лекарственные растения Марийской АССР. Йошкар-Ола, 1990. - 192 с.

8. Рабинович М. И. Лекарственные растения в ветеринарии. - М., 1981. - 224 с.

9. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Hydrangeaceae - Haloragaceae. Л., 1987. - 326 с.

10. Саратиков А.С., Венгеровский А.И., Прищеп Т.П. Адъювантная болезнь. - Томск, 1983. - С. 173-175.

11. Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. - М., 1990. - 256 с.

12. Тринус Ф. П., Клебанов Б.М., Ганджа И.М., Сейфулла Р.Д. Фармакологическая регуляция воспаления. - Киев, 1987. - 142 с.

13. Фармакологические свойства галеновых препаратов из цветков Filipendula ulmaria (L.) Maxim. / Барнаулов О.Д., Болдина И.Г., Галушко В.В. и др. // Растит, ресурсы. - 1979. - Т. 15. - Вып. 3. - С. 399-407.

14. Шахмачев В.И. Лекарственные растения в урологии. - Чебоксары, 1995. - 208 с.

15. Domenjoz R Pharmacological evaluation of anti-inflammatory agents, a contribution to the pharmacology of phenylbutazone // Ann. Univ. Saraviensis Med. I. - 1953. - P. 317-325.

16. Freund 1. Advances Tuberc. Res., 1956. - 7. - P. 130-148.

17. Meier R. , Schuller Т., Dessaulles P. // Experimentia (Basel). - 1950. - 6. Р. 469.

18 Winter С.A., Risley, Nuss G.W. Carragenininduced edema in hind paw of rat as an assay for antiinflammatory drags // Proc. Soc. Expr. Biol. and Med. - 1962. - Vol. 111, 3. - P. 544-547.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к терапии воспалительных заболеваний, и может быть использовано в качестве противовоспалительного средства. Предложено противовоспалительное средство, представляющее собой 40%-ную спиртовую вытяжку из высушенных измельченных листьев и стеблей лабазника при соотношении сырье : экстрагент 1:10 вес.%. Противовоспалительное действие не уступает по эффективности известным противовоспалительным препаратам ацетилсалициловой кислоты и индометацину, а в ряде случаев и превосходит. 7 табл.

Противовоспалительное средство, содержащее вытяжку из высушенной и измельченной надземной части лабазника вязолистного, отличающееся тем, что оно содержит 40%-ную спиртовую вытяжку из листьев и стеблей лабазника вязолистного при соотношении сырье: экстрагент 1: 10 вес. %.