СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО СРЕДСТВА ИЗ ЛАБАЗНИКА ВЯЗОЛИСТНОГО FILIPENDULA ULMARIA (L) MAXIM Российский патент 2007 года по МПК A61K36/73 A61P37/04 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения средств из растительного сырья.

На фоне сложившейся неблагоприятной экологической обстановки значительно возросло количество заболеваний, основным патогенетическим звеном которых являются нарушения со стороны иммунной системы организма. В этой связи в настоящее время ведутся активные исследования в плане поиска новых иммуностимулирующих лекарственных средств.

Однако большинство этих препаратов являются индивидуальными химическими веществами, которые нередко грубо вмешиваются в деятельность иммунной системы и вызывают целый ряд побочных эффектов. Поэтому неслучайно, что в поле зрения ученых все чаще стали попадать лекарственные растения как источник мягких иммуномодулирующих средств. Одним из таких растений является различные виды лабазника.

В народной медицине издавна использовали подземную и надземную части лабазника в качестве вяжущего, мочегонного, противовоспалительного и ранозаживляющего средства.

Традиционной и наиболее распространенной лекарственной формой из растительного сырья являются, как правило, спиртовые настойки и жидкие экстракты. Обе формы являются препаратами мягкого действия. Они не обладают способностью к комуляции (накапливанию в организме), поэтому курс лечения длителен, порядка 1-2 мес. Таким образом, наряду с лекарствами больной получает дозу спирта, что является противопоказанием для больных, особенно для детей. В связи с этим становится актуальной проблема получения сухих экстрактов из растений.

Известен способ приготовления отвара цветов лабазника, который обладает иммуномодулирующим действием. Способ заключается в приготовлении отвара из цветов лабазника путем 40-минутного кипячения на водяной бане - 1 весовая часть сырья на 20 частей воды (Лекарственные растения. 1992 г.).

Известна сухая спиртовая вытяжка 40% этиловым спиртом из высушенной измельченной надземной части лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L) Maxim) при соотношении сырье экстрагент 1:9. Известна сухая спиртовая вытяжка 70% этиловым спиртом высушенной измельченной надземной части лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L) Maxim) при соотношении сырье - экстрагент 1:9.

Высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного заливали 40% этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагента 1:9, настаивали 14 суток, полученную настойку фильтровали через 4 слоя марли, после чего упаривали досуха или высушенную измельченную надземную часть лабазника вязолистного заливали 70% этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагенга 1:9, настаивали 14 суток, полученную настойку фильтровали через 4 слоя марли, после чего упаривали досуха.

Данный способ наиболее близок по технической сущности к предлагаемому изобретению и поэтому взят нами за прототип. Недостатком данного прототипа является неполное извлечение биологически активных веществ, и поэтому данный прототип обладает невысоким иммуномодулирующим действием.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка технологичного и экономичного способа получения комплекса из цветов и/или бутонов лабазника с повышенным содержанием биологически активных веществ и обладающего повышенным иммуностимулирующим действием.

Поставленная задача достигается также тем, что предлагается способ получения сухого концентрата из цветов лабазника, обладающего иммуномодулирующим действием.

Способ заключается в следующем.

Бутоны и цветы лабазника измельчают и экстракцию осуществляют этиловым спиртом методом мацерации поэтапно, последовательно от 20 до 70% спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1:7-10 в присутствии карбоната кальция (0,5 г на 100 г сырья), нейтрализующего свободные органические кислоты Дробная экстракция этанолом обеспечивает полноту извлечения и увеличивает выход комплекса дубильных веществ и флавоноидов, а также фенолкарбоновых кислот. Первый этап экстракции осуществляется трехразовой экстракцией по 30-70 минут 50-70% этиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1:7-10.

Второй этап экстракции осуществляется экстракцией 20-50% спиртом в течение 20-60 мин. Спиртовые извлечения объединяют, процеживают. Спиртовую фракцию упаривают в вакууме при давлении 5·10^-3 1,5·10^-3 мм рт.ст. до содержания влаги в целевом продукте не более 5% от общей массы. Дробная экстракция 20-70% этанолом обеспечивает полноту экстракции и увеличивает выход комплекса дубильных веществ, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот.

Пример 1.

100 г бутонов и цветов лабазника, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 10 мм, заливают 1000 мл 50% спирта и добавляют 0,5 г карбоната кальция, оставляют для настаивания в течение 30 мин. Через 30 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды.. Затем сырье заливают 20% спиртом и настаивают в течение 20 мин. Извлечения объединяют и процеживают через ватно-марлевый тампон, высушивают в вакууме и размалывают в шаровой мельнице.

Пример 2.

100 г бутонов и цветов лабазника, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 10 мм, заливают 1000 мл 60% спирта и добавляют 0,5 г карбоната кальция, оставляют для настаивания в течение 30 мин. Через 30 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды. Затем сырье заливают 40% спиртом и настаивают в течение 20 мин. Извлечения объединяют и процеживают через ватно-марлевый тампон, высушивают в вакууме и размалывают в шаровой мельнице.

Пример 3.

100 г бутонов лабазника, измельченных до размера частиц диаметром 10 мм, заливают 1000 мл 60% спирта и добавляют 0,5 г карбоната кальция и оставляют для настаивания в течение 50 мин. Через 50 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды. Затем сырье заливают 40% спиртом и настаивают в течение 40 мин. Извлечения объединяют, процеживают через ватно-марлевый тампон и высушивают в вакууме и размалывают в шаровой мельнице.

Пример 4.

100 г бутонов лабазника, измельченных до размера частиц диаметром 10 мм, заливают 1000 мл 70% спирта, и добавляют 0,5 г карбоната кальция и оставляют для настаивания в течение 50 мин. Через 50 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды. Затем сырье заливают 50% спиртом и настаивают в течение 40 мин. Извлечения объединяют, процеживают через ватно-марлевый тампон и высушивают в вакууме и размалывают в шаровой мельнице.

Пример 5.

100 г бутонов и цветов лабазника, измельченных до размера частиц диаметром 10 мм, заливают 1000 мл 70% спирта и добавляют 0,5 г карбоната кальция, оставляют для настаивания в течение 70 мин. Через 70 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды. Спиртовые извлечения сливают. Затем сырье заливают 50% спиртом и настаивают в течение 60 мин. Извлечения объединяют, процеживают через ватно-марлевый тампон и высушивают в вакууме.

Пример 6.

100 г бутонов и цветов лабазника, измельченных до размера частиц диаметром 10 мм, заливают 700 мл 50% спирта и добавляют 0,5 г карбоната кальция, оставляют для настаивания в течение 70 мин. Через 70 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды. Спиртовые извлечения сливают. Затем сырье заливают 20% спиртом и настаивают в течение 60 мин. Извлечения объединяют, процеживают через ватно-марлевый тампон и высушивают в вакууме.

Пример 7.

100 г цветов лабазника, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 10 мм, заливают 1000 мл 60% спирта и добавляют 0,5 г карбоната кальция, оставляют для настаивания в течение 30 мин. Через 30 мин извлечение сливают в сборник, а процесс настаивания повторяют дважды.. Затем сырье заливают 40% спиртом и настаивают в течение 20 мин. Извлечения объединяют и процеживают через ватно-марлевый тампон, высушивают в вакууме и размалывают в шаровой мельнице.

Изучение зависимости выхода целевых веществ от количества и времени настаивания показало, что повторение экстракций дает возможность снизить время экстракции.

Авторами были проведены исследования по количественному содержанию суммы флавоноидов в сухом концентрате из бутонов и цветов лабазника, полученной по известному методу и по предлагаемому. Так, по известному способу содержание флавоноидов в целевом продукте составляет 27,07%, а по предлагаемому способу содержание флавоноидов достигает 67,17%.

Анализ на содержание флавоноидов.

1. Качественное обнаружение.

0,05 г полученного сухого извлечения растворяют в 10 мл 40% этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2% раствора алюминия хлорида, появляется желтое окрашивание.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и 10 мг кристаллического магния, нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, появляется оранжево-красное окрашивание.

2. Количественное определение флавоноидов.

Около 0,05 г сухого концентрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл 50%-ного этанола и доводят объем раствора до метки 50% этанолом перемешивают (раствор А). 5 мл (точный объем) раствора А количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, добавляют 3 мл 2% раствора хлористого алюминия, доводят объем до метки 50% этанолом, перемешивают. Через 30 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 385 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 5 мл раствора А, доведенного 50% этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на абсолютно сухой препарат в % вычисляют по формуле:

,

где =361±2,2 - удельный показатель поглощения комплекса при длине волны 385 нм.

D - оптическая плотность исследуемого раствора;

m - масса сырья в граммах;

w - влажность в %.

Установлено наличие дубильных веществ в полученной сумме экстрактивных веществ.

При добавлении по каплям 1 мл раствора желатина к водно-спиртовому извлечению образуется муть, исчезающая при избытке желатина, при этом образуется желеобразный осадок и раствор заметно осветляется.

Установлено наличие фенолокислот в полученной сумме экстрактивных веществ. Хроматографирование водно-спиртового извлечения на бумаге марки FN-214 в системе растворителей; 15 уксусная кислота и н-бутанол-уксусная кислота-вода, обработка хроматограммы в парах аммиака и просмотр в УФ-свете позволило идентифицировать с аутентичными образцами хлорогеновую кислоту и галловую кислоту.

Для изучения иммунологической активности сухого концентрата были проведены эксперименты на мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г и линии BALB|c с массой тела 18-20 г. Животным в течение 12 дней вводили сухой экстракт через зонд в дозе 50 мг/кг.

Влияние веществ на клеточный иммунитет оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана. Проводили иммунизацию мышей эритроцитами барана. Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена по индексу воспаления (ИВ).

Оценку гуморального звена иммунной системы осуществляли методом локального гемолиза в специальных камерах по Каннингейму с подсчетом относительного количества антителообразующих клеток (АОК). Иммунизацию проводили внутрибрюшинным введением взвеси эритроцитов барана. Через 96 часов после иммунизации (пик развития LGM-ответа) оценивали активность первичного иммунного ответа по числу антитело образующих клеток (АОК) в гомогенате селезенки и по титру антител в сыворотке крови. Для этого клетки селезенки иммунизированных животных совместно с эритроцитами барана и комплементом помещали в агаровый гель. Клетки в условиях in vitro продолжают синтезировать антитела, которые лизируют эритроциты, и вокруг этих клеток образуются видимые макроскопические зоны гемолиза. Подсчитывая эти зоны, можно определить, какое число АОК приходится на 10⁶ ядросодержащих клеток и на всю селезенку.

При сравнительном анализе настойки, полученной методом прототипа и предлагаемым методом, выявлено увеличение числа антителообразующих клеток.

Таким образом, предлагаемый способ получения сухого концентрата из бутонов и цветов лабазника позволяет увеличить выход биологически активного комплекса и повысить иммуномодулирующую активность концентрата.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения иммуностимулирующего средства. Способ получения средства иммуностимулирующего действия из лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L) Maxim., методом мацерации спиртом, при этом бутоны и/или цветы лабазника экстрагируют поэтапно, причем на первом этапе сырье подвергают трехкратной экстракции этиловым спиртом определенной концентрации при определенных условиях в присутствии карбоната кальция, а на втором этапе этиловым спиртом определенной концентрации при определенных условиях, далее полученные фракции объединяют, процеживают и упаривают в вакууме и при определенном давлении. Вышеописанный способ позволяет получить средство с повышенным содержанием биологически активных веществ и повышенным иммуностимулирующим действием. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения средства иммуностимулирующего действия из лабазника вязолистного Filipendula ulmaria (L) Maxim методом мацерации спиртом, отличающийся тем, что бутоны и/или цветы лабазника экстрагируют поэтапно, причем на первом этапе сырье подвергают трехкратной экстракции 50-70%-ным этиловым спиртом по 30-70 мин каждая и соотношении сырье-экстрагент 1:7-10 в присутствии карбоната кальция, а на втором этапе - 20-50%-ным спиртом в течение 20-60 мин, далее полученные фракции объединяют, процеживают и упаривают в вакууме и при давлении от 5·10^-3 до 1,5·10^-3 мм рт. ст.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что карбонат кальция добавляют в количестве 0,5 г на 100 г сырья.