ШТАММ AEROCOCCUS VIRIDANS N 167 - ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ: ВОДОРОД ПЕРОКСИДА, СУПЕРОКСИДА, ЛАКТАТОКСИДАЗЫ, СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И GSH-ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма микроорганизма рода Aerococcus, а именно A.viridans №167.

Микроорганизмы рода Aerococcus имеют низкую патогенность, и инфекции, вызванные ими у человека, регистрируют довольно редко; обычно это лица, которые страдают разной патологией или иммунодефицитом. Возможность проявлять патогенные свойства некоторых из этих микроорганизмов открыта только в последнее десятилетие.

В иностранной литературе 1994-2000 годов появилось небольшое количество данных про новый патогенный вид A.urinae, который вызывает инфекции мочевых путей, эндокардиты и сепсисы, часто с летальным исходом у людей преклонного возраста и пациентов со склонностью.

Следует отметить, что интерес к аэрококкам связан не только с патогенным видом A.urinae. Всесторонне изучается как в нашей стране, так и за рубежом представитель нормальной микрофлоры человека - Aerococcus viridans, который имеет широкий спектр биохимической активности. Кроме того, Aerococcus viridans изучается в качестве суперпродуцента L-альфа-глицерофосфат оксидазы [2] и L-лактат оксидазы [3], в связи с чем разрабатываются среды культивирования и исследуются свойства ферментов.

Известен штамм Aerococcus viridans GK 308 - ВНИИА - 1730 (Коллекция микроорганизмов научно-исследовательского института антибиотиков, г.Москва). Штамм Aerococcus viridans GK 308 - ВНИИА №1730 получен в результате отбора негемолитической колонии на 3%-ном кровяном мясо-пептонном агаре из колоний естественного рассева дикого типа Aerococcus viridans. Из отобранной негемолитической колонии получена чистая культура при ее пересеве на мясо-пептонный агар, который содержит 10% лошадиной сыворотки.

Штамм Aerococcus viridans GK 308 депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ антибиотиков (г.Москва) под номером 1730. Штамм имеет характерные свойства.

Морфологические признаки. Полиморфен. Основные структуры - кокки удлиненной овальной формы, грамм-положительные, неподвижные. При электронно-микроскопическом исследовании видны нежные капсулы и внутри клеток большие включения неправильной формы. При выращивании на средах, обогащенных лошадиной сывороткой, клетки однородно вытянуты и не отличаются полиморфизмом. При выращивании штамма на мясо-пептонном агаре и средах, обедненных белком, клетки отличаются значительным полиморфизмом: изменяется форма клеток, их расположение. Клетки приобретают неправильную коккоподобную форму, овоидную, гантелеподобную, булавоподобную, зернистую форму. Клетки могут располагаться беспорядочно, скоплениями, в виде "частокола", "розеток", могут располагаться по кольцу.

Размножение: поперечное деление, дробление.

Культуральные свойства. Скудно растет на мясо-пептонном агаре в виде мелких (0,5-1,0 мм в диаметре) плоских бесцветных колоний круглой формы, плотной консистенции. Поверхность сухая, края ровные, сглаженные к поверхности среды. Структура гомогенная или зернистая. Наблюдается врастание в среду.

Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 10% лошадиной сыворотки с формированием изолированных колоний или слившихся, размером 2-3 мм в диаметре, круглой формы, слизистой консистенции, блестящих.

Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 0,2% лизоцима. Характеристика роста такая же, как на мясо-пептонном агаре с добавлением лошадиной сыворотки.

На 3%-ном кровяном мясо-пептонном агаре рост скудный, без проявления гемолиза и изменения цвета окружающей среды.

Телуристый калий, добавленный в мясо-пептонный агар в концентрациях 0,01-0,05%, не угнетает рост штамма.

Селенисто-кислый натрий, добавленный в среду в концентрации 0,05%, подавляет рост штамма.

При росте в мясо-пептонном бульоне с добавлением 10% лошадиной сыворотки штамм формирует придонный и пристеночный осадок с одновременным гомогенным помутнением среды.

Штамм хорошо сохраняется на твердых питательных средах: мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном агаре с 10% лошадиной сыворотки и соответствующих жидких питательных в средах течение 2-3 месяцев, при 4°С. Штамм хорошо сохраняется в лиофильно-высушенном состоянии, не утрачивая своей жизнеспособности, по имеющимся данным, на протяжении 6 лет.

Физиологические и биохимические признаки. В качестве источника углерода штамм утилизирует глюкозу, арабинозу, рамнозу, сорбит, лактозу, инозит, ксилозу, дульцит, манит, сахарозу. Не утилизирует мальтозу.

ДНК штамма содержит 35-42% Г+Ц. Не имеет цитохром-оксидазной системы и гемсодержащих каталазы и пероксидазы.

Хорошо восстанавливает теллур из теллуристого калия и не восстанавливает селен из селенисто-кислого натрия.

Оптимальная температура роста 37°С, температурный интервал роста 20-40°С, время роста 20-24 ч (зависит от вида питательной среды). Перекись водорода не продуцирует. Отношение к антибиотикам: резистентное к стрептомицину - минимальная ингибирующая концентрация антибиотика (МИК) равняется 61,44 мкг/мол; к лизоциму (МИК-3000 мкг/мол); диоксидину (МИК-500 мкг/мол); димексиду (МИК-3000 мкг/мол). К другим препаратам чувствительный.

Изменчивость. Штамм имеет повышенную изменчивость морфологии клеток при выращивании на питательных средах, обедненных белком.

Недостатком штамма Aerococcus viridans GK 308 является полное отсутствие антагонистической активности в отношении тест-культур микроорганизмов.

Задачей изобретения является получение культуры Aerococcus viridans с повышенной антагонистической активностью в отношении тест-культур микроорганизмов.

Новый штамм Aerococcus viridans №167 был выделен из грудного молока. По своим морфологическим, физиологическим и биохимическим свойствам полностью соответствует представителям рода Aerococcus вида viridans, а также имеет антагонистическую активность по отношению к различным штаммам микроорганизмов.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма.

Aerococcus viridans №167 - представитель микрофлоры организма человека. Он относится ко второму отделу грампозитивных субактерий, которые имеют клеточную стенку, или к Furmicutes. Входит в 17-ю группу грампозитивных кокков, которая содержит роды: Aerococcus, Coprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemmella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, RuminococcHs, Saccharococcus, Salinicoccus, Sarcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus.

На основе 16S ррнк секвенирования, биохимического и жирно-кислотного анализа, в результате исследования фенотипичного и генетического родства аэрококкоподобных микроорганизмов, выделенных от человека, дифференцировали три вида - A.viridans, A.urinae и A.christensenii sp. nov., изолированный из влагалища человека.

Клетки Aerococcus viridans №167 имеют неподвижные шарообразные клетки диаметром 1,0-2,0 мкм; в мазках из культур, выращенных на жидких средах, располагаются тетрадами. Факультативные анаэробы, но лучше растут в микроаэрофильных условиях. Образуют мелкие колонии, вызывая позеленение кровяного агара. Хемоорганотрофы с окислительным метаболизмом; углеводы ферментируют с образованием кислоты. Каталазо-негативные или слегка позитивные. Желатин не разжижают; нитраты не восстанавливают.

Температурный оптимум 37°С (также растут при 10°С, но не при 45°С). Принципы выделения аэрококков аналогичны таковым, как и при индикации стрептококковых инфекций; бактерии образуют беловато-серые колонии, образованные большими кокками, собранными или сшитыми в пары. Подобно энтерококкам, истощенные способны расти на средах, которые содержат 6,5% NaCl, но не растут при 10°С, а также чувствительны к бацитрацину. В таблице приведена характеристика штамма Aerococcus viridans №167.

Таблица
Характеристика штамма Aerococcus viridans №167Свойства штаммаAerococcus viridans №167Морфология клеток при росте на мясо-пептонном агаре (МПА)Кокки, которые располагаются тетрадами и скоплениями, неправильной формы, грампозитивныМорфология клеток на МПА с 10% лошадиной сывороткиМорфология та жеХарактер роста на МПАРост хороший, колонии (1-2 мм в диаметре) с ровными краями, выпуклые, не сливаютсяХарактер роста на МПА с 10% лошадиной сывороткиРост скудный. Мелкие точечные колонииХарактер роста на мясо-пептоновом бульоне (МПБ)Рост хороший, в виде пристеночного и придонного осадкаМПА с 0,05% селенисто-кислого натрияРост хороший. Большие (2-3 мм в диаметре) колонии красного цветаМПА с 0,01% теллуристого калияРост хороший, колонии среднего размера (2-3 мм в диаметре), бесцветныеМПА с 0,05% теллуристого калияРост отсутствуетМПА с 3% кровиРост густой. Большие колонии (2-3 мм в диаметре), которые зеленят кровяной агарСпособность расти в присутствия 40% желчиРостпри рН 9,6Ростпри 45°СРост отсутствуетСтойкость к выдерживанию: при 60°С 30 минСтойкий

В 15%-ном растворе Н₂O₂СтойкийАнтибиотики:Минимальная ингибирующая концентрация (мкг/мл)Пенициллин0,12Оксацилин0,12Метицилин0,12Стрептомицин3,84Лизоцим1,92Биклиноциклин0,12Карбеницилин3,84Целоспор3,84Кефлин1,92Цефалотин1,92Полимиксин30.72Рифампицин1,92Нитроксолин1,92Грамурин1000Диоксидин1000Невиграмон30,72Димексид750Хиноксидин500

Аскорбиновая кислота1000Борная кислота4000Хлорамин500Восстановления 1%-ной метиленовой синьки в молокеНетЖелатинаНе разжижаетГидролиз аргининаНе гидролизуетГидролиз крахмалаНе гидролизуетУтилизация углеводов: Арабиноза+Рамноза+Инозит+Ксилоза+Сорбит+Дульцит+Глюкоза+Лактоза+Мальтоза+Манит-Сахароза+Содержание Г+Ц в ДНК штаммов %30-42

Итак, подводя итоги, можно дать следующую характеристику штамма Aerococcus viridans №167.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Грампопозитивные кокки, неподвижные, 1-2 мкм в диаметре, которые располагаются парами или нерегулярными скоплениями. Клеточная стенка состоит из двух электронноплотных и одного менее плотного промежуточного слоя. Толщина цитоплазматической мембраны 200-400 А. Цитоплазма клеток имеет гетерогенный характер. Она заполненная мелкими гранулами, полирибосомами, сконцентрированными вокруг мезосом или ядерных образований.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Колонии аэрококков на плотном питательном агаре круглые, 0,5-1,0 мм в диаметре, полупрозрачные, белые или серые, иногда бусинкоподобные. На кровяном агаре колонии аэрококков имеют большие размеры, окружены зоной позеленения, возможно, в результате действия лактат-оксидазы. При росте в питательном бульоне образуется гомогенное помутнение, которое имеет тенденцию превращаться в зернистый осадок.

Установлена зависимость роста аэрококков от наличия в среде биотина, пантотеновой и никотиновой кислот. Штамм не требует для своего роста витамины группы "В": тиамина, рибофлавина, пиридоксина, фолиевой и флавоновой кислот. Tween-80 заменяет потребность в биотине. Для роста аэрококков требуются экзогенные пурины. Гуанин и ксантин взаимозаменяемы с аденином. Штамм не имеет потребности в экзогенных пиримидинах. Потребность в аминокислотах вариабельна. Потребность для роста в биотине, никотиновой, пантотеновой кислотах, пуринах и независимость от содержания в среде витаминов группы "В" отличает аэрококки от других грампозитивных кокков, например педиококков, которые нуждаются в фолиевой кислоте, или стрептококки в тиамине.

БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

При культивировании на молоке с 1,0% метиленовым синим не восстанавливают последний, подкисляют молоко при отсутствии свертывания, желатин не разжижают, аргинин, крахмал, эскулин не гидролизуют. Аэрококки продуцируют кислоту, но не газ, при культивировании на средах с глюкозой, мальтозой, лактозой, манитолом, сахарозой. Ацетоин не образуют, рафинозу не сбраживают, каталазу не продуцируют, коагулазу не образуют. При культивировании в глюкозном (1%) бульоне конечное рН 5,1-5,8, рост микроаэрофильный. При аэробном росте продуцируют перекись водорода.

Каталазная активность аэрококков может иметь негеминовый характер. Аэрококки содержат фермент, который защищает их от супероксидных радикалов - супероксидную дисмутазу, кофактором которой является марганец. По кислородной устойчивости аэрококки занимают второе место после S.faecalis и находятся перед Е.соli.

Максимальная продукция перекиси водорода у культур аэрококков отмечается в ранний период логарифмической фазы роста культуры. У аэрококков - сильных продуцентов перекиси водорода - стационарная фаза развития культуры непродолжительная. Отмечается их высокая чувствительность к антибиотикам.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ

Клеточная стенка аэрококков содержит глюкозу, галактозу, галактозамин и не содержит рамнозу, глицерол или рибитол. Определено одинаковое содержание Г+Ц пар в ДНК аэрококков и педиококков, равное 41-43%. Содержание Г+Ц пар у ДНК аэрококков колебалось в границах 39,5-42,0%. У аэрококков, выделенных из грудного молока, содержание Г+Ц пар было 39,9-42,0%, из коровьего 39,5-41,6.

Антагонистическую активность штамма Aerococcus viridans №167 проверяют в отношении 9 тест-штаммов методом штриха на плотной питательной среде в чашке Петри. Ампулу с культурой разводят 0,9% раствором натрия хлорида из расчета содержания 2·10⁸ аэрококков в 1 мл и засевают штрихом по диаметру чашки с МПА, которая содержит 1% глюкозы и 0,4 мг/мл калия йодида. После инкубации посевов в термостате при температуре (36±1)°С в течение 48 часов перпендикулярно выросшей культуре аэрококков подсевают петлей Генле того же диаметра культуру тест-штаммов. После инкубации при температуре (36±1)°С 24 часа зоны задержки роста тест-культуры измеряют от края штриха к началу роста тест-культуры.

Зоны угнетения роста тест-штаммов должны быть не менее 5 мм для Pseudomonas aeruginosa 1312 и не менее 10 мм для всех других культур.

Тест-штаммы.

Культуры тест-штаммов получают из ИИСК им. Л.А.Тарасевича. Суточные культуры тест-штаммов Staphylococcus aureus 209 р, Proteus vulgaris 401, Proteus mirabilis H 2091, Klebsiella pheumoniae 320, Pseudomonas aeruginosa 1312, Shigella sonnet, Shigella flexneri 1046, Salmonella typhimurium 5710, Vibrio Nag p 6078, которые выросли на протяжении 24 часов на скошенном МПА, смывают 0,9% раствором натрия хлорида и готовят микробную суспензию 5 Од. стандарта (ОСА 42-28-59-85).

Продукты, синтезируемые штаммом, указаны на схеме, которая приведена на чертеже.

Возможность получения штамма подтверждается следующими сведениями о депонировании штамма.

Штамм Aerococcus viridans №167 (коллекция микроорганизмов филиала Национального Депозитария патогенных для человека микроорганизмов на базе Харьковского института микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова при АМН Украины - инв.№ 1006 от 15 февраля 2002 г.).

Штамм Aerococcus viridans №167 - продуцент биологически активных веществ: водород пероксида, супероксида, лактатоксидазы, супероксиддисмутазы и GSH-пероксидазы. Данный штамм имеет повышенную антагонистическую активность в отношении тест-культур микроорганизмов. 1 ил., 1 табл.

Штамм Aerococcus viridans №167 инв. №1006, депонированный в Филиале Национального Депозитария патогенных для человека микроорганизмов на базе Института Микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова при АМН Украины, г.Харьков, - продуцент биологически активных веществ: водород пероксида, супероксида, лактатоксидазы, супероксиддисмутазы и GSH-пероксидазы.