Штамм бактерий AeRococcUS VIRIDaNS для получения клонов с оксидазной и редуктазной активностью Советский патент 1988 года по МПК C12N1/20 

4

О Од

Изобретение относится к м йкро.биологии и касается получения KvjTbTyp с повьшенной способностью к jn популяции и повышенной биологической активностью. Цель изобретения - получение штамма бактерий для получения клонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидазной и редуктазной активностью. В качестве культуры для селекции клонов с повышенной биологической активностью используется штамм Aerococcus (Мусосос- CUS hyperoxydans) ВНИИА - 1730 (Коллекция микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков), который дает клоны с повышенной оксидазной и редуктазной активностью. 5 табл.

СП

О)

Изобретение относится к микробиологии и касается получения штамма, который может быть использован для селекции клонов с повьппенной оксидаз ной и редуктазной активностью .

Целью изобретения является получение штамма бактерий для получения клонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидазной и редуктазной активностью.

Штамм Aerococcus viridans (Мусо- COCCUS hyperoxydans) ВНИИА № 1730 (GK 308) получен в результате отбора негемолитической колонии на 3%-ном кровяном мясо-пептонном агаре среди колоний естественного рассева Мусо- COCCUS hyperoxydans 167VR. Из отобранной негемолитической колонии получена чистая культура при ее пересеве на мясо-пептонный агар, содержащий 10% лошадиной сыворотки.

Штамм Aerococcus viridans (Мусо- COCCUS hyperoxydans) GK308 депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ антибиотиков под номером 1730. Штамм имеет характерные свойства.

Морфологические признаки. Полиморфен. Основные структуры - кокки удлиненной овоидной формы, грамположи- тельные, неподвижные, -При электронно микроскопическом исследовании видны нежные капсулы и внутри клеток круп- ные включения неправильной формы. При выращивании на средах, обогащенных лошадиной сывороткой, клетки однородно вытянуты и не отличаются по- лиморфностью. При выращивании штамма на мясо-пептонном агаре и средах, обедненных белком, клетки отличаются значительной полиморфностью: изменяется форма клеток, их расположение. Клетки приобретают неправильную кок- ковидную форму, овоидную, гантеле- видную, булавовидную, зернистую фор- му. Клетки могут располагаться беспорядочно, скоплениями, в виде частокола, розеток, могут располагаться по кольцу.

Размножение: поперечное деление,

дробление.

Культуральные свойства. Скудно растет на мясо-пептонном агаре в вид мелких (0,5-.1,0 мм в диаметре) плос- них бесцветных колоний круглой формы плотной консистенции. Поверхность тусклая, сухая, края ровные сглажен- , ные к поверхности среды. Структура

гомогенная или Зернистая. Наблюдается врастание в среду.

Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 10% лошадиной сыворотки с формированием изолированных или сливающихся колоний размером 2- 3 мм в диаметре, круглой формы, слизистой консистенции, блестящие.

Хорошо растет на мяцр-пептонном агаре с добавлением 0,2% лизоцима. Характеристика роста такая же, как на мясо-пептонном агаре с добавлением лошадиной сыворотки.

На 3%-ном кровяном мясо-пептонном агаре рост скудный без проявления гемолиза и изменения цвета окружающей среды.

Теллуристый калий, добавленный в мясо-пептонный агар в концентрациях 0,01-0,05%, не угнетает рост штамма.

Селенисто-кислый натрий, добавленный в среду в концентрации 0,05%, подавляет рост штамма.

При росте в мясо-пептонном бульоне с добавлением 10% лошадиной сыворотки штамм формирует придонный и пристеночный осадок с одновременным гомогенным помутнением среды.

Штамм хорошо сохраняется на твердых питательных средах: мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном агаре с 10% лошадиной сыворотки и соответствующих жидких питательных средах в течение 2-3 мес при 4°С. Штамм хорошо хранится в лиофильно-высушенном состоянии, не теряя своей жизнеспособности, по имеющимся данным, в течение 6 лет.

Физиологические и биохимические признаки. В качестве источников углерода штамм утилизирует: глюкозу, ара- бинозу, рамнозу, сорбит, лактозу, инозит, ксилозу, дульцит, маннит, сахарозу. Не утилизирует мальтозу.

ДНК штамма содержит 35-42% Г+Ц. Нет цитохром-оксидазной системы и гемсодержащих каталазы и пероксидазы.

Хорошо восстанавливает теллур из . теллуристого калия и не восстанавливает селен из селено-кислого натрия.

Оптимальная температура роста З7 с, температурный интервал роста 20-40°С, время роста 20-24 ч (зависит от вида питательной среды). Перекись водорода не продуцирует. Не является in vitro антагонистом бактерий.

Отношение к антибиотикам: резистентен к стрептомицину - минимальная

подавляющая концентрация антибиотика (МЖ) равняется 61,Д4 мкг/мл; к лизо- циму (МПК-ЗООО мк-г/мл); диоксидину (МПК - 500 мкг/мл);, димексиду (МПК - 3000 мкг/мл). К остальным препаратам чувствителен.

Изменчивость. Штамм обладает повышенной изменчивостью морфологии клеток при выращивании на питательных средах, обедненных белком.

При высеве популяции штамма на . питательную среду (мясо-пептонный агар) вьфастают колонии - ревертанты клоны из которых близки по морфологи- ческим свойствам к исходному штамму

клеток на мясо- агаре

лошадиткиоста на:

Кокки, располагающиеся тетрадами и скоплениями, неправильной формы, грамположительныеМорфология та же

Рост хороший, ко лонии (1-2 мм в диаметре) с ровными краями, ВЫнесливаюнесливаю

пуклые,

щиеся

Рост скудный.

Мелкие точечные

колонии

Рост хороший в виде пристеночного и придонного осадка

Рост хороший S, крупные (2-3 мм в диаметре) колонии красного цвета Рост хороший, колонии среднего размера (1-2 мм в диаметре), неокрашенныеРост отсутствует

Рост обильньш.

Mycococcus hyperoxydans 167УК, но отличаются по преимущественному выражению оксидазной или редуктазной активности.

Колонии-ревертанты вырастают на среде на 5-10-е сутки. При повторных пересевах рост клонов стабилизируется в течение первых же пересевов и равен 24-Д8 ч. I

В табл.1 приведена сравнительная характеристика штамма Aerococcus vi- ridans (Mycococcus hyperoxydans) GK 308 и исходного штамма Mycococcus hvperoxydans 16,7 VR

Таблица 1

Кокки, вытянутые кокки, овоиды, гантелевидные, булавовидные клетки, зерна,грампо- ложительные Однородные вытянутые кокки, овоиды

РОСТ скудный, в виде напета точечные уплощенные колонии с тенденцией врас- тания в среду

Рост обильный, сливной. Крупные (2-3 мм в диаметре) колонии с ровными краями Рост хороший в виде гомогенного помутнения, пристеночного и придонного осадка Рост скудньш, точечные бесцветные колонии

Рост средний, колонии среднего размера (Os,5-1,5 мм в диаметре, неокрашенные)

Рост хороший Колонии черного цвета (1-2 мм в диаметре) Рост очень скудный.

Крупные колонии (2-3 мм в диаметре), зеленящие кровяной агар

сти 40%:

вы

аст

н

ин

ин

1%- й ом

е

Рост Рост

Устойчив

Устойчив

500 500

3,84 2000 250 61,44 3,84 3,84 30,72 30,72 500 500

. 15,36 500 500 1000

30,72 750

Нет

5,5 - 6,0 Не разжижает

Не гидролизует Не гидролизует

+ + + + + + +

Про; олжение табл.1 3

Точечные .колонии. Зеленение среды отсутствует

Рост Рост

Нет

Нет

0,12 0,12 0,12 61,44 3000 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 250 1,92 2000

Нет

5,8 - 6,1 Не разжижает

Не гидролизует Не гидролизует

+ + + + + + +

+ + +

+ +

+

Маннит

Сахароза + Содержание Г+Ц в ДНК, штаммов, % 30-42

Штамм GK 308 при выращивании на мясо-пептонном агаре с добавлением 10% лошадиной сыворотки дает обильный рост, значительно превышающий рост известного штамма.

В табл.2 представлены сравнительные данные о способности роста штаммов 167VR и GK 308 при росте на разных питательных средах,

Таблица2

0,810,1 0,3±0,05

0,0810,01 3,1 ±0,2

0,0310,006 2,3.10,31

1,3 +0,1 0,1610,02

Данный штамм является продуцентом, широкого спектра клонов с разной выраженностью оксидазной и редуктазной

Редуктазный

Не выражен 1 ЛО

Оксидазно- редуктазный

1406156

8 Продолжение табл.1

+ +

35 - 42

активности. Разная оксидазная и ре- дуктазная активность получаемых клонов отражается на их свойствах. Чисг тые культуры с преимущественной оксидазной активностью характеризуются усилением продукции перекиси водорода, превышающей этот признак известного штамма (до ,9,8 мМ вместо 2,1 мМ соответственно), повьщ1енным антагонизмом против патогенных бактерий.

Чистые культуры с преимущественно вьфаженной редуктазной активностью характеризуются слабой продукцией перекиси водорода (до 0,01 мМ) и вместо с тем сильной антагонистической активностью против патогенных бактерий.

Повышенная изменчивость штамма GK 308 проявляется в появлении разного типа колоний при его рассеве на питательной среде для индикации оксидазной и редуктазной активности микроорганизмов, продуцирующих перекись водорода.

В табл.3 представлены данные о частоте колоний разного типа в естественном рассеве исходного 167VR и предлагаемого GK 308 штаммов.

ТаблицаЗ

Характерный рост для основной массы популяции1 .,2.10

3,2 -10 -1 -10

1406156

Окраски вокруг

Бесцветные колонии с черной зоной окраски вокруг

Черные коло- НИИ без зоны окраски вокруг

Черные коло- НИИ с черной зоной окраски вокруг.

Пример 1.. Культуру Аегосос- CUS viridans (Mycococcus hyperoxy- dans) GK 308 выращивают на мясо-пеп- тонном агаре с 10% лошадиной сыворотки. Суспензию суточной культуры проращивают в жидкой питательной среде в стационарных условиях при 38 С в течение 10 ч при начальной концентрации клеток 1-10 -1-10 на 1мл среды.

Производят высев проращиваемой суспензии на питательную среду для индикации оксидазной и редуктазной активности микроорганизмов, продуцирующих перекись -водорода. Посевы инкубируют в течение 6 суток при . После инкубации отбирают выросшие колонии с преимущественно выраженной оксидазной или редуктазной активностью. Для получения клонов колонии отсевают на скошенный мясо-пептонный агар и посевы инкубируют в течение 36 ч при . Полученные клоны подвергают исследованию.

Для изучения вида преимущественно активности полученных клонов производят посев штрихом суспензий суточных культур (10 клеток на 1 мл физиологического раствора натрийхлорида) на питательную среду для индикации окси дазной и редуктазной активности микроорганизмов, продуцирующих перекись водорода. Посевы инкубируют в термостате в течение 36 ч при 37 С, после чего производят результатов. . Клоны с преимуи1ественной оксидазной активностью дают рост средней интен10Продолжение табл.3

1-10- -1-10 1 -Ю

1

ТО

1-5

сивности с окрашиванием в черньй цвет штриха растущей биомассы и питательной среды вокруг. Клоны с преимущественной редуктазной активностью дают хороший рост с интенсивным красньш окрашиванием штриха биомассы.П р и м е р 2. Исследуют уровень продукции перекиси водорода у полученных клонов. Штамм GK 308 перекись водорода не продуцирует.

В табл.4 представлены данные о продукции перекиси водорода, известным штаммом 167 VK и клонами, полученными из штамма GK 308.

Т а б л и ц а 4

5

0

167 VR

GK 308

Оксидазный

клон

Редуктазный

клон

Оксидазно-редуктазный

клон

Оксидазный 2,1 10,3 Не выражен О

Оксидазный 9,8+2,3 Редуктазный 0,1 ±0,01 Оксидазно- 0,5 ±0,02- редуктаз- 1,7 ±0,4 ный

П р и м е р 3. Определяют антагонистическую активность полученных клонов in vitro в отношении патогенных бактерий родов: Proteus, Pseudo- monas, Staphylococcus.

11

Для определения антагонистической активности полученных клонов производят штриховой посев суспензий их суточных кгультур (1 млрд. клеток на 1 мл физиологического раствора нат- рийхлорида) на поверхность мясо-пеп- тонного агара. Посевы ин kyбиpyют при 37°С 24 ч. В герметичных камерах, исключающих контаминацию окружающей среды, производят опыление посевов

Преимущества штамма Aerococcus viridans (Mycococcus hyperoxydans) GK 308 заключается в повьш1енной возможности селекции широкого спектра клонов с преимущественным выражением оксидазной или редуктазной активности, что позволяет рассматривать его

12

суспензиями тест-бактерий. После 24-часовой инкубации учитывают зоны подавления роста.

. . ,

В табл.5 приводится характеристика антагонистической активности полученных клонов в сравнении с известным штаммом 167 VR. Штамм GK 308 не обладает in vitro антагонистической активностью.

ТаблицаЗ

как базовый штамм для селекции биологически активных культур.

Формула изоб эетения

Штамм бактерий Aerococcus viridans ВНИИА № 1730 для получения клонов с оксидазной и редуктазной активностью,