ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/21 C12N15/03 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генетической инженерии для получения рекомбинантных белков.

Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных белков на основе промоторов фага лямбда. Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном с1857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32^оС, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42^оС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связаться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.

Вышесказанное относится и к несущему дефектный с1857 репрессор штамму E. coli pop2136, выбранному в качестве прототипа. Однако у этого штамма есть недостаток. Он содержит ген, кодирующий активную протеазу La. Известно, что повышение температуры роста клеток, необходимое для включения синтеза рекомбинантного белка, приводит также к индукции синтеза ряда белков E. coli, в том числе и протеазы La, что может приводить к деградации рекомбинантного белка.

Преимущество заявленного штамма заключается в том, что в результате замены активного гена протеазы La на дефектный ген снижена деградация синтезируемых рекомбинантных белков. В генах штамма введет также ген устойчивости к тетрациклину, удобный для позитивной селекции клеток.

Описание заявленного штамма
Видовое название культуры Escherichia coli. Наименование штамма PLT90. Родословная штамма производное E. coli K-12.

Генетическая характеристика. Штамм PLT90 бактерий Escherichia coli K-12 содержит дефектный ген lon, образованный вследствие инсерции транспозона Tn10. Генотип штамма PLT90: F^- lon: Tn10 (Tet^R) endA1 malPpa: [PR, c1857] Mal^-, λ imm) thi hsdR. Штамм устойчив к антибиотику тетрациклину и фагу лямбда.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.

Клетки PLT90 выращивают на среде LB или других богатых средах, используемых для культивирования Escherichia coli. Клетки растут на среде, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте при 37^оС на мясопептонном агаре, питательном агаре "Дифко" колонии гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, край ровный, прозрачные. Колонии клеток PLT90, выросшие на агаре при 30-32^оС, имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon-мутациями, растущих при пониженной температуре. При росте на жидких средах: мясопептонном бульоне, 2YT-бульоне образуют ровную интенсивную муть. Для длительного хранения штамма используют столбики 0,6% -ного агара, покрытого стерильным вазелиновым маслом, при 4^оС.

Физиолого-биохимическая характеристика. Клетки хорошо растут в пределах от 4 до 37^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Не сбраживают мальтозу. Уреазная активность не образуется.

Биотехнологическая характеристика. Трансформацию клеток PLT90 плазмидами, несущими рекомбинантные гены с промоторами фага лямбда, проводят стандартными для Escherichia coli методами. Полученные клоны клеток с плазмидами подращивают на среде LB при 30-32^оС. Препаративную ферментацию с целью наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами фага лямбда составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 5 х 10⁸ кл/мл.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ Генетика под номером В-5868.

П р и м е р 1. Получение штамма PLT90.

Штамм PLT90 синтезирован с помощью Р1 котрансдукции (Дж. Миллер. Эксперименты в молекулярной генетике, с.185-189, 1986) маркера TetR из штамма CAG-9276 (C600 galK^- lon:Tn10(Tet^R) в штамм pop2136.

Клетки CAG-9276 выращивают в бульоне LB с 5 mM CaCl₂ до плотности 2 х 10⁸ клеток/мл. К 1 мл культуры добавляют 10⁷ частиц фага Р1. Адсорбцию фага на клетках проводят в течение 20 минут при 37^оС, добавляют 2,5 мл мягкого R-агара с температурой 45^оС и выливают на чашку с 1,5% R-агаром. Через 8 часов инкубации при 37^оС собирают мягкий верхний агар, добавляют к нему 1 мл бульона и 5 капель хлороформа, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют. Надосадочная фракция представляет собой лизат фага Р1.

Для проведения трансдукции с помощью полученного фаголизата ресуспендируют 5 мл свежей ночной культуры pop2136 в 5 мл раствора, содержащего 0,1 М MgSO₄ и 5 мM CaCl₂, и подращивают при 32^оС в течение 15 мин. Клеточную культуру разливают по 0,1 мл в ряд пробирок. В пробирки добавляют по 0,1 мл из серии последовательных 10-кратных разведений Р1 фаголизата. Адсорбцию фага проводят в течение 20 мин при 32^оС. В каждую пробирку добавляют 0,2 мл нитрата Na и рассевают содержимое каждой пробирки, добавив в них по 2,5 мл мягкого LB-агара на чашки с 1,5%-ным LB-агаром, содержащие 10 мкг/мл тетрациклина. Чашки инкубируют при 30^оС в течение 48 ч. Выросшие колонии Tet^R клеток имеют характерный для lon-мутаций "слизистый" вид.

П р и м е р 2. Использование заявленного штамма.

Клетки PLT90 были трансформированы плазмидой, созданной на основе вектора pEX и определяющей синтез рекомбинантного белка размером 140 kD под контролем промотора фага лямбда. Этой же плазмидой были трансформированы клетки pop2136. Трансформированные клетки подращивали при 30^оС. Индукцию синтеза белка осуществляли повышением температуры роста клеток до 42^оС. Пробы для анализа белков отбирали через 1 ч и 16 ч после индукции. Клеточные белки были охарактеризованы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. В клетках PLT90 накапливается большое количество рекомбинантного белка, а в клетках pop2136 наряду с нормальным белком присутствует продукт его деградации.

Из данных примера 2 видно, что заявленный штамм может быть использован для трансформации рекомбинантными плазмидными ДНК, при этом в предлагаемом штамме в отличие от штамма-прототипа нет деградации рекомбинантного белка.

Таким образом, заявленный штамм бактерий E. coli PLT90 позволяет повысить уровень синтеза и качество целевого белка за счет снижения деградации.

Использование: биотехнология и генетическая инженерия. Сущность изобретения: получен штамм бактерий Escherichia coli, несущий дефектный ген протеазы La наряду с мутантным геном cI репрессора фага лямбда. Штамм обладает низким уровнем деградации белков, синтезируемых с использованием промоторов фага лямбда.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5868, используемый для получения рекомбинантных белков.