Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену N системы MNSS эритроцитов человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

1

(21)4452305/30-13

(22)29.06.88

(46) 23.03.90. Бюл. № Л

(71)Всесоюзный гематологический научный центр

(72)Е.И.Дерюгина, Н.И.Дризе, Л.Н.Ле- менева, Е.Ю.Садовникова, Г.А.Удалов

и И.Л.Чертков

(53)578.085.23(088.8)

(56) Fraser R.H., Munro А.С., Williamson A.R, et al. J. Immunogenetics, 1982, v. 9, p. 295-301.

Fletcher A., Harbour C. J. Immunogenetics, 1984, v. 11, p. 121-126.

f

(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬ- НЫХ АНТИТЕЛ К ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКОМУ АНТИГЕНУ-N СИСТЕМЫ MNSS АРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического N-антигена в эритроцитах человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического анти- гена-N в эритроцитах и других клетках человека.

Целью изобретения является удешевление процесса получения монокло- нальных антител за счет создания нового штамма гибридных клеток животного Mus. musculus, секретирующего моноклоналнные антитела (ЮНАТ),спеЦелые изобретения является удешевление процесса получения моноклональ- ных антител за счет создания нового штамма гибридных клеток животного Mus. musculus, секретирующего моно- клональные антитела, специфически выявляющие N-антиген в эритроцитах человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы P3-X63-Ag 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON под воздействием полиэтиленгликоля М.В.3000 и дальнейшего культивирования в селективной ереде ГАТ. Соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1:3. Клетки пассируют каждые 2-3 дня. Секретируемые КОНАТ на третьи сутки достигают титра 1:64-1:256 (культуральная жидкость) и 1:1600-1:12800 (в асцитной жидкости) . Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 255D. МОНАТ могут быть использованы для выявления N-антигена в эритроцитах и других клетках человека. 1 табл.

цифически выявляющие N-антиген в эритроцитах и клетках тканей человека.

Штамм получают следующим образом.

Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus. rausculus N-86/2 получают в результате слияния мышиной миеломы P3-X63-Ag 8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фе- «отипа ON, под воздействием полиэтиленгликоля мол.мае. 3000 и дальнейшеЈ

IB

сд ел

3

СО

го культивирования в селективной среде ГАТ. При слиянии используют соотношение миеломньгх клеток и спленоци- тов 1:3 при общем количестве миелом- ных клеток 160-10 и клеток селезенки 450 10 . После слияния клетки культивируют из расчета 2-10 спленоци- тов на ячейку 96-луночной плоскодонной платы. Эффективность гибридизации 79%. Штамм получают в результате 4-кратного клонирования методом лимитирующих разведений при 100% антите- лообразующих клонов в двух последних клонированиях.

Штамм N-86/2 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий позвоночных под номером ВСКК(П) № 255D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные характеристики. Стационарная суспензионная культура клеток в жидкой среде содержит (3-4)-105 клеток/мл. Рассаживание 1:2-1:3 через 2-3 сут. Клонирование осуществляют на перитонеапьных макрофагах мыши. Среда для культивирования: ДМЕМ, 20% эмбриональной телячьей или оленьей сыворотки, 4 мМ L- глютамина, 2 мМ пирувата натрия, 2.0 мМ HEPES-буфера, 5-10 5М 2-мер- каптоэтанола, 10% среды, концидиони- рованной спленоцитами мыши (4-10 /мл в полной питательной среде, 10 сут) и антибиотики, 37 С, 95-100% влажности, 6% С0г в воздухе.

Культивирование гибридных клеток в организме животного: мыши линии BALB/c или их F,-гибриды с мышами линий WR или DBA/2; пристан по 0,25 мл в/бр за 7-30 сут до введения клеток по (2-5)-10 на мышь. Среднее время роста гибридомы в форме асцитной опухоли 12 сут.

Морфология клеток: штамм представ лен слабоприкреплягсщимисг к субстрату клетками с обычной для антителооб разующих гибридных клеток морфологией.

Видовая принадлежность штамма до- казана цитогенетическим методом. Ка- риотип соответствует виду Mus. muscu lus. Число хромосом составляет 81-90 генетические маркеры 2 большие мета- центрические хромосомы.

Продуктивность штамма. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом: анти-N антитела, агглютинирующие эритроциты человека,

5

0

5 0

Q

5

Q

5

5

содержащие N-антиген. Метод тестирования - агглютинация в солевой среде или на плоскости.

Характеристика биосинтеза полезных продуктов: титр антител в культураль- ной жидкости в реакции солевой агглютинации в круглодонных микроплатах 1:64-1:256, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации на плоскости 1:1600-1:12800. Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 13 пассажей в культуре и 2 пассажей в мыши.

Криоконсервирование клеток. Ростовая среда, 10% ДМСО, 40% любой сыворотки, сутки при -70 С, затем - жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания по трипановому синему 56%. После размораживания культивирования ведут в 24-ячеечных платах по 0,5-10 клеток в ячейку на фидере из перитонеальных макрофагов мыши (2-105/ячейку).

Контаминация. Не обнаружена бактериями, грибами и микоплазмами. Вирусы не тестированы.

Пример. Активность в серологических реакциях.

Образцы индуцированной клетками штамма N-86/2 асцитной жидкости мышей исследуют по известным методам со стандартными эритроцитами в реакции агглютинации на плоскости и в реакции агглютинации в солевой среде в 96-луночных микроплатах. Под титром антител подразумевают такое их последнее разведение, при котором в ячейке микроплаты наблюдают агрегаты эритроцитов, а на плоскости крупные ягг лютинаты начинают образовываться не позднее 2 мин. Под авидностью антител подразумевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

Результаты исследования титра (активности) и авидности МОНАТ, секре- тируемых клетками штамма N-86/2 и направленных к антигену-N системы MNS5 эритроцитов человека, представлены в таблице.

Результаты, приведенные в таблице, показывают, что МОНАТ N-86/2,

5

как и поликлональные антитела гете- роиммунной кроличьей антисыворотки, обладают условной специфичностью, т.е. преимущественно реагируют с эритроцитами фенотипа N, но вызывают положительную реакцию агглютинации (в меньшем титре) при исследовании эритроцитов фенотипа М. И в том, и в другом случае перекрестная активность с М эритроцитами обусловлена наличием N-подобной детерминанты в молекуле гликофорина В, экс- прессированного как на К, так и на N-эритроцитах. В связи с этим, получение специфических гетероиммунных анти-N антисыворотки требует интенсивной абсорбции реагента эритроцитами, не содержащими N-антиген, а получение специфичного моноклонального анти-N реагента требует лишь разведения исходного продукта до тех значений, при которых реакция агглютинации с М-эритроцитами отсутствует в течение определенного, заранее обозначенного времени (2 мин).

517396

Таким образом, МОНАТ, секретиру- емые штаммом N-86/2 в асцитной форме, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 1000-5000 раз иметь высокоактивный стандартный реагент анти-N для выявления N-антигена в эритроцитах и других клетках человека. Получение анти-N моноклонального реагенЮ та на основе МОНАТ, продуцируемых перививаемыми гибридными клетками штамма N-86/2 в брюшинной полости мыши, менее трудоемко, чем получение гетероиммунной кроличьей сыворотки,

15 не требует дополнительной абсорбции эритроцитами и дает более стандартные результаты.

Формула изобретения

20

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus ВСКК(П) № 255D, используемый для получения моноклональных антител к группоспеци- фическому N-антигену системы MNS эритроцитов человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического N-антигена в эритроцитах человека. Целью изобретения является удешевление процесса получения моноклональных антител за счет создания нового штамма гибридных клеток животного MUS MUSCULUS, секретирующего моноклональные антитела, специфически выявляющие N-антиген в эритроцитах человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-Х63-А. 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON под воздействием полиэтиленгликоля М.В.3000 и дальнейшего культивирования в селективной среде ГАТ. Соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1:3. Клетки пассивируют каждые 2-3 дня. Секретируемые монАТ на третьи сутки достигают титра 1:64-1:256 (культуральная жидкость) и 1:1600-1:2800 (в асцитной жидкости). Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 255Д. МонАТ могут быть использованы для выявления N - антигена в эритроцитах и других клетках человека. 1 табл.