Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену М системы MNSS эритроцитов человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 C12P21/00 A61K39/395 

к лимфоцитам - 1:2 при общем количестве спленоцитов 370 Ю и клеток миеломы 18510 . Эф фективность гибридизации 90%.

Штамм получен в результате 3 крат- ного клонирования методом лимитирующего разведения при 100 антителопро- дуцирующих клонов в 2-х последних клонированиях.

Штамм М-86/1 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий позвоночных под № и характеризуется следующими признаками.

Культуральные характеристики. Стационарная суспензионная культура клеток в жидкой среде, содержащая 300- lOOxlO кл/мл.. Рассаживание 1:2-1:3 через 2-3 сут при снятии клеток рези новым полисменом. Клонирование осуществляется на перитонеальных макрофагах мыши,

Среда для культивирования - RPMI- 1640 или ДНЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, Ц мМ 1-глутамина, 1% пирувата натрия, 1-2% гепес-буфера 5x10 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина, 25 мкг/мл стрептомицина, 37°С, 95 влажности, 6% СО, в воздухе

Культивирование гибридных клеток а организме животного: мыши линии Balb/c, пристан по мл внутрибрю- шинно за 7-30 сут до введения клеток по кл/мышь. Среднее время роста гибридомы в асцитной форме 12 су г.

Морфология клеток: штамм представлен слабо прикрепляющимися к субстрату клетками с обычной для антитело- образующих клеток морфологией.

Видовая принадлежность штамма доказана цитогенетическим методом. Кариотип соответствует виду M.us. musculus. Модальное число хромосом 89, генетические маркеры - 2 мета- центрические хромосомы.

Сведения о комтаминации линии: не обнаружена контаминация бактериями, грибами и микоплазмой. Вирусы не тестированы.

Характеристика полезного вещества, продуциируемого штаммом: 1 gM анти-М антитела, агглютинирующие эритроциты человека, содержащие М антиген. Метод тестирования - агглютинация в солевой среде или на плоскости.

Характеристика биосинтеза полезных продуктов: титр антител культуральной жидкости в реакции солевой агглютинации в круглодонных микроплатах 1:256,

0

5

0

5

0

5

0

5

титр антител асцитной жидкости - 1:256 - 1:512x103.

Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 11 пассажей в культуре и 2 пассажей в мыши.

Криоконсервирование клеток: ростовая среда, 10% ДМСО, kO% эмбриональной телячьей сыворотки, режим 1 С/мин до -kO°C, 10°С/мин до -120°С, далее жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания по трипановому синему 70-72 %. После размораживания культивирование .ведут в ячеечных платах по 0,5x10 жизнеспособных клеток/ячейку на фидере из перитонеальных макро- фазов мыши (2x10 клеток/ячейку).

Образцы индуцированной клетками штамма М-86/1 асцитной жидкости мышей исследуют по общепринятым методам со стандартными эритроцитами в солевой среде в 9б-луночных платах (титр антител) и в реакции агглютинации на плоскости (авидность антител). Под авид- ностью антител подразумевается сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реак.сИи агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр) .

Результаты исследования активности (титра) и ааидности моноклональных антител, секретируемых клетками штамма М-86/1 и направленных к антигену М системы MNSs эритроцитов человека, представлены в таблице.

Результаты, приведенные в таблице, показывают, что моноклональные антитела асцитной жидкости штамма М-86/1, специфически реагируют с антигеном М в эритроцитах ММ и MN. При этом титр моноклональных антител, секретируемых штаммом М-86/1, в 8000 и 16000 раз выше титра антител гетероиммунной кроличьей сыворотки при определении титра в солевой среде и в 1бОО и 3200 раз при определении титра на плоскости по отношению к эритроцитам MN и ММ соответственно. Авидность моноклональных антител асцитной жидкости, разведенной в 100 раз, также значительно выше авидности антител гетероиммунной кроличьей сыворотки.

Таким образом, моноклональные антитела, секретируемые штаммом М-86/1 в асцитной форме, позволяют путем раз5152879

ведения асцитной жидкости в 100 раз иметь высокоактивный стандартный высокоспецифичный реагент анти-М для выявления антигена М в эритроцитах человека. Кроме того, получение моно- клональных анти-М антител с помощью штамма перевиваемых гибридных клеток штамма М-86/1 в брюшной полости мыши менее трудоемко, чем получение гете- JQ роиммунной кроличьей сыворотки, не требует дополнительной абсорбции

троцитами и дает более стандартные

результаты.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus BCKK(ll) 86-Л для получения моноклональных антител к группоспецифическому антигену М системы MNSs эритроцитов человека.

Изобретение относится к медицине, в частности к судебной медицине и иммунологии, и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена М в эритроцитах человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего высокоактивные и специфичные моноклональные антитела, выявляющие антиген М системы MNSS эритроцитов человека. Штамм получают путем слияния по методу Келера и Мильштейна клеток мышиной миеломы с клетками селезенки мышей, предварительно иммунизированных эритроцитами человека группы А (П) ММ. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под N 860. Моноклоальные антитела, секретируемые клетками штамма М-86/1 N 86Д при культивировании их в брюшной полости мыши, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 100 раз иметь высокоактивный, стандартный, специфичный реагент анти-М для выявления антигена М в эритроцитах человека. 1 табл.

1:16

1:16

1:25бххЮЗ

1:128x103

П р и М е ч а и и е, С эритроцитами MN, т,е, не содержащими антигена М,

ни гетероиммунная кроличья сыворотка, ни моноклональ- ные анти-М антитела агглютинации не дают.

1:it

6-8-10

9-12-15

1:100 1:12800 1:6400

1-2-3

1-2-3