ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ ДНК ГЕНА ХОМЯКА EF-1α Российский патент 2005 года по МПК C12N15/11 C12N15/67 C12N15/85 C07K14/47 

Предпосылки к созданию изобретения

Транскрипция любого из установленных генов эукариот осуществляется с участием одной из трех РНК-полимераз, каждая из которых действует на определенную подгруппу генов. В то время как транскрипция рибосомальных РНК проходит с участием РНК-полимеразы I, а малые рибосомальные РНК и тРНК транскрибируются РНК-полимеразой III, кодирующие белок ДНК-последовательности и основная часть малых ядерных РНК транскрибируются с участием РНК-полимеразы II. Для каждого типа генов при осуществлении транскрипции необходимо взаимодействие соответствующей полимеразы с промоторными генными последовательностями и образование устойчивого комплекса инициации транскрипции. В общем виде, для осуществления транскрипции от любой из трех полимераз необходимо также взаимодействие некоего фактора связывания с промоторной последовательностью и рекогниция фактора связывания вторым фактором, который тем самым обеспечивает взаимодействие полимеразы с генной последовательностью. И если этот механизм включает минимум условий для осуществления транскрипции с участием РНК-полимераз I и III, то процесс, приводящий к транскрипции с участием РНК-полимеразы II, является более сложным.

По-видимому, из-за большого разнообразия генных последовательностей, транскрибированных РНК-полимеразой II, и в связи с тем, что типы регуляции для этих генов высоковариабельны в пределах одной клетки и при переходе от одной клетки к другой, на транскрипцию с участием РНК-полимеразы II оказывают влияние многочисленные факторы транскрипции в комплексе инициации в дополнение к взаимодействиям других связывающих белков с регуляторными последовательностями ДНК, не являющимися промоторами. Эти другие связывающие белки могут активировать транскрипцию выше основного уровня или подавлять ее полностью. Репрессорное связывание может быть также оценено как способ предотвращения активации с учетом наблюдений о том, что основной уровень транскрипции у высших эукариот обычно очень низкий. С другой стороны, активация обычно является конечным откликом на какой-либо физиологический сигнал, и для образования активного комплекса инициации транскрипции требуется или удаление репрессорного связывающего белка, или изменение в структуре хроматина.

В коре образования транскрипционного комплекса находится, являсь при этом необходимым условием для основных уровней экспрессии генов, промоторная последовательность, называемая ТАТА-боксом, располагающаяся против хода транскрипции от начального сайта транскрипции полимеразы II. ТАТА-бокс является сайтом связывания для вездесущего фактора транскрипции, обозначаемого TFIID, однако, как уже упоминалось, у большинства генов на транскрипцию от промоторной последовательности оказывают сильное влияние дополнительные регуляторные последовательности ДНК, которые могут либо усиливать, либо подавлять транскрипцию генов. Элементы ДНК такого типа находятся в вариабельных положениях по отношению к кодирующим последовательностям гена и к ТАТА-боксу. Эти дополнительные регуляторные элементы транскрипции часто функционируют как тканеспецифичные или клеточноспецифичные.

При экспрессии рекомбинантных белков особенно важен выбор регуляторной ДНК, которая включает промоторную ТАТА-последовательность и дополнительные регуляторные элементы, совместимые с механизмом транскрипции клетки-хозяина. По этой причине обычно отдают предпочтение регуляторной ДНК, которая является эндогенной по отношению к клетке-хозяину. В качестве альтернативы значительные успехи достигнуты при использовании регуляторной ДНК, полученной из вирусных геномных последовательностей, для оценки широты распространения вирусов вообще и для демонстрации активности вирусной регуляторной ДНК в различных типах клеток. Хорошо изучены и широко используются для экспрессии рекомбинантного белка вирусные регуляторные ДНК, включая, например, ранний промотор/энхансер гена вируса SV40 (Dijekema EMBO J.4, 761, 1985), повторяющаяся ДНК с длинным окончанием вируса саркомы Рауса (Gorman и др., Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 79, 6777, 1982 b), фрагменты бычьего вируса папилломы (Sarver и др., Mol. Cell. Biol., 1, 486, 1981) и элементы промотора/энхансера человеческого цитомегаловируса (Boshart и др., Cell, 41, 521, 1985). Несмотря на большое разнообразие типов клеток, для которых было продемонстрировано функционирование вирусных регуляторных ДНК, не исключено, что существуют невирусные промоторные/энхансерные элементы ДНК, допускающие повышенный уровень транскрипции рекомбинантных белков посредством более эффективного использования механизмов транскрипции клетки-хозяина.

Следовательно, в этой области существует необходимость в идентификации промоторных/энхансерных последовательностей регуляторной ДНК для усиления экспрессии рекомбинантного белка и обеспечения высокого выхода целевого белкового продукта. Особенно важной является необходимость идентификации таких промоторных/энхансерных регуляторных ДНК, которые наиболее эффективно могут использоваться в клетках млекопитающих для усиления воспроизведения in vitro рекомбинантных белков, гликозилирующихся по механизму, сходному с механизмом гликозилирования белков при экспрессии белка in vivo. Менее вероятно, что экспрессированные таким способом и введенные в терапевтических или профилактических целях белки окажутся антигенными, более вероятно, что они окажутся физиологически активными. Регуляторные последовательности ДНК такого типа пригодны для внедрения в клетки-хозяева для усиления экспрессии генов, эндогенных по отношению к этим клеткам, или генов, введенных ранее в геном клетки-хозяина с помощью хорошо известных приемов, широко используемых в практике.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение связано с очищенными и выделенными полинуклеотидами из клеток хомяка, которые регулируют транскрипцию генов.

Полинуклеотиды включают последовательности регуляторных ДНК в 5’-положении к участкам трансляции гена яичника китайского хомяка EF-1α . Предпочтительные ДНК по изобретению обозначены как регуляторные ДНК CHEF1 и включают ДНК примерно в 3,7 т.н., с протяженностью от сайта рестрикции SpeI до инициирующего метионинового кодона (ATG) белка ef-1α . Изобретение охватывает также полинуклеотиды с менее чем 3,7 т.н., способные усиливать транскрипцию оперативно связанного гена. Активные фрагменты ДНК по изобретению, характеризующиеся способностью регулировать (т.е., усиливать) транскрипцию генов, легко идентифицируются с помощью делеционных исследований, широко применяемых специалистами. Регуляторные ДНК по изобретению включают полинуклеотиды, выделенные из природных источников, таких как культивированные клетки, а также полинуклеотиды, полученные энзиматическим или химическим синтезом. Так, в одном из примеров своего осуществления изобретение обеспечивает способ получения ДНК CHEF1 из библиотеки генов. В качестве альтернативы ДНК может быть получена энзиматическим синтезом с использованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР) или только химическим синтезом, в котором последовательно связываются одиночные нуклеотиды, или перекрывающиеся олигонуклеотиды гибридизуются и лигируются. Последовательность ДНК из наиболее предпочтительных примеров осуществления изобретения расположена в последовательности с идентификационным номером 1 (SEQ ID NO:1). Кроме того, в изобретении использованы последовательности ДНК, которые при определенных условиях гибридизуют с ДНК, находящейся в SEQ ID NO:1. Определенные условия включают промывание при температуре около 65° С в буфере, содержащем примерно 2xSSC (хлорид натрия-цитрат натрия) и примерно 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), или другие равноценные условия.

Кроме того, изобретение охватывает плазмидную ДНК, включающую регуляторные полинуклеотиды CHEF1. Плазмиды по данному изобретению могут также включать последовательности ДНК, кодирующие целевой белок или РНК, оперативно связанную с полинуклеотидными последовательностями CHEF1. Кроме того, изобретение охватывает клетки-хозяева, трансформированные, трансфицированные и/или электропорированные с применением полинуклеотидов или плазмид по изобретению. Плазмидная ДНК по изобретению может быть интегрирована в геном клетки-хозяина или может существовать в закрытой кольцевой форме. Предпочтительные плазмиды по данному изобретению, наиболее подходящие для встраивания целевых последовательностей ДНК, включают плазмиды pDEF14 и pDEF2. Бактериальные клетки, трансформированные с помощью плазмид pDEF14 и pDEF2, были заложены на хранение 9 апреля 1997 года и 4 марта 1997 года соответственно в Американскую коллекцию типов культур, (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) под регистрационными номерами 98389 и 98343 соответственно.

Изобретение охватывает также линейную векторную ДНК, содержащую полинуклеотиды последовательности CHEF1. Векторы по изобретению могут быть получены из вирусных источников или синтезированы in vitro. Кроме того, изобретение охватывает клетки-хозяева, трансфицированные или электропорированные с применением линейных векторных последовательностей. ДНК этого типа применимы, в частности, для экспрессии гетерологичных генных последовательностей, оперативно связанных с ДНК-последовательностями CHEF1, или для сайт-направленной гомологичной рекомбинации, при которой последовательности CHEF1 могут быть включены в геном клетки-хозяина для того, чтобы модулировать экспрессию оперативно связанной последовательности.

Кроме того, изобретение охватывает молекулы химерной рекомбинантной ДНК, в которых ДНК-последовательность CHEF1 оперативно связана (т.е. промотирует транскрипцию) с генной последовательностью, кодирующей целевой белковый продукт. Обычно химерными считаются молекулы, содержащие домены, которые ассоциируются с последовательностями дикого типа не в нормальных условиях; в настоящем изобретении химерная ДНК может содержать часть или всю регуляторную ДНК-последовательность CHEF1 в ассоциации с ДНК-последовательностью, отличающейся от кодирующего белок хомяка гена EF-1α . Белки, кодируемые химерными молекулами, включают физиологически активные белки, части или субъединицы активных белков, а также маркерные или репортерные белки. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие белковый продукт, могут быть получены из комплементарных ДНК (кДНК), геномных ДНК, синтетических ДНК или ДНК, полученных путем комбинаций этих типов молекул. Белковые продукты могут быть эндогенными (т.е., присутствующими в геноме клеток яичника китайского хомяка СНО в норме, в отсутствие введения ДНК путем трансформации, трансфекции и т.п.) по отношению к клеткам СНО. Кроме того, белковые продукты могут быть кодированы экзогенными источниками, причем экзогенный источник, например синтезированная ДНК, может отличаться от генома клеток СНО. Предпочтительные химерные молекулы по изобретению включают молекулы, в которых ДНК CHEF1 оперативно связана с ДНК, кодирующей: а) тяжелую цепь анти-ICАМ3 антитела ICM3, б) легкую цепь ICM3, в) тяжелую цепь анти-CD11/CD18 антитела hu23F2G, г) легкую цепь hu23F2G, д) хитиназу, е) ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов (PAF-AH), ж) полученный на основе макрофагов хемокин (MDC). Бактериальные клетки-хозяева, трансформированые с плазмидной ДНК, включая химерные молекулы, были заложены на хранение 1 апреля 1997 года в Американскую коллекцию типов культур под регистрационными номерами (а) 98381, (б) 98382, (в) 98383, (г) 98384, (д) 98385, (е) 98386 и (ж) 98387 соответственно.

Кроме того, изобретение связано с клетками-хозяевами, трансформированными или трансфицированными с помощью ДНК-последовательностей CHEF1 по данному изобретению. Предпочтительными клетками-хозяевами являются полученные от китайского хомяка (Cricetutus griseus) клетки, в которых, как предполагается, регуляторная ДНК CHEF1 обеспечивает высокие уровни экспрессии белка. Однако изобретение охватывает и другие типы клеток, полученные от альтернативных видов, включая, например, армянских хомяков (Cricetulus migratoris) или сирийских (золотых) хомяков (Mesocricetus auratus), а также клетки животных других биологических видов. Клетки могут быть получены из легкого, яичника, брюшины, мышц, поджелудочной железы, почек, меланомы или из соматических источников, а также из всего плода или эмбриона. Клетки-хозяева по изобретению, перечисленные выше, а также другие типы клеток, например миеломная клеточная линия, в которой, как предполагается, регуляторная ДНК CHEF1 обеспечивает высокие уровни транскрипции, могут быть получены от Американской коллекции типов культур или в качестве альтернативы культивированы непосредственно от источников животного происхождения.

Рекомбинантные молекулы по изобретению, включающие регуляторную ДНК-последовательность CHEF1, обеспечат повышенные уровни экспрессии мРНК оперативно связанных гетерологичных (т.е. не находящихся в геноме хозяина без введения полинуклеотидов трансфекцией, трансформацией и т.п.) полинуклеотидов. В зависимости от природы полинуклеотида, связанного с полинуклеотидными последовательностями CHEF1, усиленная транскрипция в конечном итоге приведет к повышенным уровням полипептидов или повышенным уровням различных типов РНК в тех случаях, когда связанный полинуклеотид кодирует, например, транспортную РНК, рибосомальную РНК, малую ядерную РНК и т.п. Типы РНК могут также включать антисмысловую РНК комплементарную мРНК, транскрибированную от эндогенной или экзогенной генной последовательности. Усиленная полипептидная трансляция неизбежно зависела бы от наличия соответствующего трансляционного сигнала в мРНК.

Кроме того, изобретение обеспечивает методы, с помощью которых ДНК-последовательность CHEF1 включается в специфические сайты геномной ДНК клеток-хозяев для повышения уровней транскрипции эндогенной генной последовательности. Для включения всей ДНК CHEF1 или ее части может быть использована гомологичная рекомбинация. В модифицированных таким способом клетках-хозяевах ДНК CHEF1 оперативно связана с кодирующими ДНК последовательностями. Смотри, например, публикацию международной заявки WO 94/12650, публикацию международной заявки WO 92/20808 и международной заявки WO 91/09955. В конечном итоге, изобретение охватывает измененные геномные последовательности ДНК, в которые включена регуляторная ДНК-последовательность CHEF1.

В качестве альтернативы изобретение охватывает клетки-хозяева, в которых экзогенная ДНК включена в смежное положение и в оперативный участок по отношению к присутствующей в геноме ДНК CHEF1. Клетки-хозяева этого типа включают линию клеток СНО, и внедренная последовательность заменяет либо ДНК, кодирующую EF-1α , либо внедряется между регуляторной ДНК CHEF1 и ДНК, кодирующей EF-1α . Изобретение охватывает также и другие отличающиеся от клеток линии СНО клетки-хозяева, в которых ДНК CHEF1 уже включена в геном, а дополнительная ДНК включается в оперативно связанный участок.

Кроме того, изобретение обеспечивает методы усиления транскрипции целевого гена, включая этап введения в клетку-хозяина полинуклеотида, содержащего хомячковую регуляторную последовательность EF-1α , таким образом, что регуляторная последовательность интегрируется в геномную ДНК хозяина в опреративно связанный участок по отношению к целевому гену. Помимо этого изобретение охватывает способ усиления транскрипции целевого гена, включающего этап введения в клетку-хозяина полинуклеотида, содержащего хомячковую регуляторную последовательность EF-1α и последовательность, являющуюся мишенью, упомянутая последовательность-мишень построена таким образом, что позволяет регуляторным последовательностям интегрировать в положение, оперативно связанное с целевым геном, кодирующим белок, отличающийся от белка, кодируемого EF-1α . Способы по изобретению включает средство усиления транскрипции генов, которые являются эндогенными по отношению к клеткам линии СНО, а также способы усиления транскрипции генов, которые являются экзогенными по отношению к клеткам линии СНО.

Рекомбинантные молекулы по изобретению могут использоваться для получения трансгенных животных, когда химерная рекомбинантная ДНК, включающая ДНК CHEF1, оперативно связанную с целевой ДНК-последовательностью, вводится в развивающуюся зародышевую или соматическую клетку животного. Химерные рекомбинантные молекулы могут вводиться, например, микроинъекцией, и если она осуществляется с использованием зародышевых клеток, то в результате все клетки животного могут содержать рекомбинантную ДНК по данному изобретению. В качестве альтернативы химерная рекомбинантная ДНК по изобретению может вводиться в клетки эмбриона, в этом случае ДНК по изобретению может включиться в большинство клеток полученного животного.

ДНК CHEF1 используют также для идентификации родственных регуляторных последовательностей ДНК, которые могут способствовать повышенной генной экспрессии помимо той, которая возможна для последовательности CHEF1. Подобным образом, знание ДНК-последовательностей CHEF1 позволяет конструировать синтетические ДНК или путем синтеза de novo, или путем однократной либо многократной модификации последовательностей CHEF1, причем получаемые синтетические ДНК содержат последовательности, подобные CHEF1, но способные промотировать более высокие уровни транскрипции генов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 описывает клонирование хомячкового гена EF-1α и родственной последовательности CHEF1 регуляторной ДНК. Пример 2 связан с субклонированием и анализом регуляторной последовательности CHEF1. В примере 3 приведена характеристика промоторного полинуклеотида CHEF1, в примере 4 приведено описание конструкции различных экспрессионных векторов, которые включают ДНК CHEF1. Пример 5 описывает анализ методом трансфекции, использованный для определения эффективности регуляторной ДНК CHEF1. Пример 6 приводит подробности сравнения уровней экспрессии рекомбинантного белка с использованием или регуляторной ДНК CHEF1, или промотора цитомегаловируса (CMV). В примере 7 исследованы различия регуляторной способности ДНК CHEF1 различной протяженности.

Пример 1

Клонирование последовательности CHEF1

Для выделения хомячкового гомолога человеческого гена EF-1α скринировали библиотеку геномной к ДНК яичника китайского хомяка (СНО-К1) (Stratagene, La Jolla, CA).

Библиотеку СНО-К1, продукт частичного расщепления с помощью рестриктазы Sau3A в клонирующем векторе λ FIX®II, получали от фирмы Stratagene (La Jolla, CA) в штаммах клетки-хозяина XL-1-Blue MRA и XL1-Blue MRA (P2). Клетки-хозяева получали в соответствии с предложенным производителем протоколом со следующими модификациями.

Краткое изложение методики: клетки из первичной культуры в глицерине переносили в виде слоя в планшеты со средой LB, не содержащей антибиотика. Единичные колонии собирали для инокуляции жидкой среды LB и выращивали до достижения поздней логарифмической фазы и оптической плотности при 600 нм, OD_600, равной примерно 0,9. В этот момент клетки или закладывались на хранение в соответствии с предложенным производителем протоколом, или немедленно использовались, как описано ниже.

При получении культур для посева единичные колонии, извлеченные из планшетов, как описано выше, использовали для инокуляции; клетки выращивали в 50 мл среды LB, уравновешенной 0,5 мл 1 М раствора сульфата магния и 1 мл 10% мальтозы в деионизированной воде. После выращивания в течение ночи при 30° С клетки собирали с помощью центрифугирования в настольной центрифуге (2000 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре) и вновь суспендировали в 10 мМ сульфате магния при значении OD₆₀₀, составляющем 0,5.

Фаг λ , предоставленный производителем, разбавляли в буфере SM (получен из 1 л основного раствора, содержащего 5,8 г хлорида натрия, 2,0 г моногидрата сульфата магния, 50 мл 1 М трис-HCl, рН 7/5, и 5 мл 2% (вес/объем) желатина) с кратностью 10-10⁵, 2 мкл каждого разбавления прибавляли к 400 мкл клеток-хозяев в 10 мМ сульфате магния (OD₆₀₀≈_{0,5). Полученную смесь инкубировали в течение 15 минут при 37°С для того, чтобы дать возможность фагу прикрепиться к клеточному слою, прибавляли агар (0,75% агароза LBM при 48° С), каждую смесь наносили дважды на пластинки с агарозой LBM. Результаты выражали в виде титра 3× 10⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мкл фагового раствора.}

Свежие клетки-хозяева получали, как описано выше, перед скринированием библиотеки. Приблизительно 50000 БОЕ фага прибавляли к 600 мкл клеток-хозяев (при OD₆₀₀≈_{0,5) с 6,5 мл 0,75% агарозы LBM при 48° С. Смесь наносили на пластины с агарозой и инкубировали в течение примерно 8 часов при 37° С. Затем пластины охлаждали в течение 5 часов при 4° С для того, чтобы предотвратить прилипание верхнего слоя агарозы к нитроцеллюлозной мембране. На пластины помещали мембраны ВА-85 с размером пор 0,45 мкм (фирма S+S, Keene, NH), перенос осуществляли в течение двух минут. Мембраны удаляли с пластин и перенесенную ДНК (Т-ДНК) денатурировали в смеси 1,5 М хлорид натрия, 0,5 М гидроксид натрия в течение двух минут. Фильтры нейтрализовали в течение 5 минут в смеси 1,5 М хлорид натрия, 1,0 М трис-НСl (рН 8,0), блотировали на бумагу Ватман 3-ММ и сушили в вакууме при 80° С в течение примерно 1,5-2 часов.}

Человеческую последовательность кДНК EF-1α (Uetsuki и др., J. Biol. Chem., 264, 5791-5798, 1989) с 95% идентичностью к кодирующему участку СНО EF-1α , как было показано ранее (Hayashi и др., J. Biochem., 106, 560-563, 1989), использовали в качестве зонда для скрининга библиотеки и получали, как описано ниже. Зонд в 1,4 т.н. человеческого гена EF-1α получали из плазмиды М0107, вектора pRc/CMV (фирмы Invitrogen, San Diego, CA), содержащего человеческую кДНК EF-1α , включенную в сайт EcoRI. Для того чтобы подтвердить, что плазмида М0107 содержит ожидаемую человеческую кДНК, включенную ДНК секвенировали с 3’- и 5’-праймерами вектора.

94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC SEQ ID NO:2

94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA SEQ ID NO:3

Первые 263 п.н. вставки были более чем на 90% идентичны опубликованной человеческой кодирующей последовательности EF-1α , и, поскольку точное определение последовательности на 3’-конце было затруднено, с ожидаемой последовательностью можно было совместить небольшие участки. Вместе эти совмещения указывали на то, что плазмида кодировала желаемую последовательность.

Человеческую вставку удаляли полностью из плазмиды путем расщепления рестриктазой EcoRI, полосу кДНК в 1.4 т.н. дважды очищали на геле, используя набор для гелевой экстракции QIAquick фирмы QIAGEN в соответствии с предложенным производителем протоколом. ДНК элюировали 50 мкл буфера ТЕ, полученный раствор концентрировали до объема 25 мкл с помощью концентратора Microcon-10 (фирмы Amicon, Beverly, МА), аликвоту метили с ³²Р-α -dTTP и ³²Р-α -dСТР, используя набор для мечения произвольно праймированных ДНК фирмы Boehringer Mannheim в соответствии с предложенным производителем протоколом. Меченый зонд очищали, используя вращающуюся колонку G50 для удаления не включившихся нуклеотидов и сравнения очищенного зонда с аликвотой до вращения, в которой включение радиоактивной метки составило 46%, при счете 5× 10⁵ имп./мин/мкл.

Нитроцеллюлозные мембраны, полученные, как описано выше, зондировали следующим образом. Основной прегибридизационный/гибридизационный буферный раствор включал 22,5 мл буфера 20× SSC, 30,0 мл 50х раствора Денхардта, 3,0 мл 1 М фосфатного буфера (рН 6,8) (69 мл 1 М NаН₂РO₄, 31 мл 1 М Na₂HPO₄), 0,75 мл 20% SDS, 78,75 мл дистиллированной воды. Для прегибридизации кипятили 1,4 мл (10 мг/мл) ДНК из молок лососевых (фирмы Stratagene) с 0,6 мл дистиллированной воды в течение 5 минут, затем прибавляли воду до 7 мл и 72 мл основного буферного раствора. Фильтры инкубировали при 65° С не менее 2 часов в прегибридизационном буфере.

Для гибридизации смешивали 30 мкл зонда, 200 мкл (10 мг/мл) ДНК из молок лососевых и 770 мкл дистиллированной воды, кипятили в течение 5 минут, затем прибавляли до 36 мл основной буфер с 3 мл дистиллированной воды. Прегибридизационный раствор удаляли с фильтров, прибавляли гибридизационный буфер, фильтры инкубировали при 65° С в течение ночи. По окончании гибридизации фильтры промывали в течение трех часов при 65° С, трижды меняя буфер, содержащий 2xSSC и 0,1% SDS, после чего проводили авторадиографию в течение 48 часов.

Идентифицировали 47 положительных колоний и переносили их в 1 мл буфера SM, содержащего 20 мкл хлороформа. Для удаления возможных псевдогенов, лишенных одного или более интронов, были сконструированы праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) так, чтобы каждый фланкировал два интрона: праймеры 95-136 (SEQ ID NO: 4) и 95-137 (SEQ ID NO: 5), перекрывающие интроны 2 и 3; праймеры 95-138 (SEQ ID NO: 6) и 95-139 (SEQ ID NO: 7), перекрывающие интроны 3 и 4; праймеры 95-140 (SEQ ID NO: 8) и 95-141 (SEQ ID NO: 9), перекрывающие интроны 4 и 5; праймеры 95-142 (SEQ ID NO: 10) и 95-143 (SEQ ID NO: 11), перекрывающие интроны 6 и 7.

95-136 (SEQ ID NO: 4) GCCACCTGATCTACAAATGT

95-137 (SEQ ID NO: 5) GAGATACCAGCCTCAAATTC

95-138 (SEQ ID NO: 6) ATGTGACCATCATTGATGCC

95-140 (SEQ ID NO: 8) GTTGGAATGGTGACAACATG

95-141 (SEQ ID NO: 9) CAGGTTTTAAAACACCAGTC

95-142 (SEQ ID NO: 10) AATGACCCACCAATGGAAGC

95-143 (SEQ ID NO: 11) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT

Предполагаемый размер продуктов ПЦР при использовании матричной ДНК СНО EF-1α . был обоснован размером и расположением интронов в опубликованной человеческой последовательности EF-1α . Каждая ПЦР включала 2 мкл фага, 2,5 мкл каждого праймера из соответствующей пары (100 мкг/мл), 2 мкл 2 мМ смеси dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфатов), 2,5 мкл 10х буфера для ПЦР (фирмы Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), 1,5 мкл 25 мМ хлорида магния, 0,125 мкл полимеразы Taq (5 единиц/мл) (фирмы Perkin Elmer) и 11,8 мкл дистиллированной воды. Амплификацию проводили в течение 4 минут при 94° С, затем 30 циклов по 1 минуте при 90° С, 2 минуты при 50° С и 4 минуты при 72° С. Продукты амплификации разделяли на 1,2% агарозном геле в буфере 1х ТАЕ. Было найдено, что из 47 бляшек 3 кодируют истинные гены (# 2, 7 и 40), содержащие все интроны, три положительных образца были подвергнуты третичному скринингу следующим образом. Культуры для посева получали, как описано выше, при разбавлении 10-10⁵ исходных культур, приготовленных для каждой из трех положительных бляшек. От 20 до 50 выделенных от каждой культуры бляшек скринировали методом ПЦР, получая следующие результаты. Клон #2 дал два положительных образца (обозначенных 2.12 и 2.17) из двадцати скринированных, клон #7 дал один положительный образец (обозначенный 7.44) из пятидесяти скринированных, клон #40 дал один положительный образец (обозначенный 40.24) из сорока скринированных. ДНК фага выделяли из каждого из четырех образцов следующим образом.

Клетки-хозяева линии XL-1-Blue MRA (P2) вносили в планшеты с агарозой LB и выращивали в течение ночи при 37° С. Собирали единичную колонию для того, чтобы инокулировать 50 мл среды LB (содержащей 0,2% мальтозу и 10 мМ сульфат магния), культуру выращивали в течение ночи при 30° С. Клетки собирали центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре, затем клетки вновь суспендировали в 50 мл 10 мМ сульфата магния. Вновь суспендированные клетки-хозяева (50 мкл) смешивали со 100 мкл основной культуры каждого положительного фага и инкубировали в течение 15 минут при 37° С, давая возможность фагу прикрепиться к клеткам. Прибавляли приблизительно 500 мкл среды LBM, смесь встряхивали в течение 2 часов при 37° С. Прибавляли дополнительные 200 мкл клеток-хозяев, инкубацию продолжали в течение 15 минут при 37° С. Прибавляли верхний слой агара (8 мл 75% агарозы в среде LBM при 48° С), после чего смесь высевали и выращивали в течение ночи при 37° С.

После выращивания в течение ночи в каждый планшет прибавляли λ -разбавитель (10 мМ Трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ сульфат магния), планшеты осторожно встряхивали в течение 2 часов. Разбавитель удаляли и центрифугировали в настольной центрифуге в течение 10 минут при 4000g. К каждому 1 мкл супернатанта прибавляли 1 мг/мл РНКазы А и 1 мг/мл ДНКазы I, смесь инкубировали в течение 15 минут при 37° С. Прибавляли равный объем буфера для осаждения (20% PEG 8000 (полиэтиленгликоль), 2 М хлорид натрия, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ сульфат магния), затем инкубировали во льду в течение одного часа, после чего смесь центрифугировали при 8000 g в течение 20 минут, супернатант удаляли, осадок сушили на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре. Осадок вновь суспендировали в 500 мкл буфера ТЕ, непродолжительно центрифугировали для того, чтобы удалить макрочастицы, супернатант переносили в чистую пробирку на 1,65 мл. Прибавляли приблизительно 2,5 мкл 20% SDS (с пятиминутной инкубацией при 65° С), затем прибавляли 2,5 мкл при концентрации 10 мг/мл протеиназы К (с инкубацией в течение 1 часа при 65° С) и 10 мкл 5 М раствора хлорида натрия. Смесь экстрагировали один раз равным объемом смеси фенол-хлороформ и один раз равным объемом хлороформа. Прибавляли равный объем изопропанола, затем инкубировали при -70° С в течение 3 часов, после чего смесь центрифугировали в течение 15 минут с предельной скоростью. Полученный осадок промывали 70% этанолом, сушили на воздухе и вновь суспендировали в 100 мкл буфера ТЕ.

Пример 2

Субклонирование регуляторной последовательности EF-1α

Для того чтобы определить размер включенной последовательности ДНК EF-1α , ДНК фага, полученную, как описано в примере 1, расщепляли с помощью рестриктазы NotI, полученные рестрикционные фрагменты разделяли на агарозном геле в 0,6% 1хТАЕ (Трис-ацетат-ЭДТА). Клоны 2.12 и 2.17 расщеплялись по одинаковому образцу с появлением полос в 11 т. н. и 4,5 т. н. помимо ожидаемых фланкирующих λ -фрагментов в 19 т.н. и 10 т.н. Клоны 7.44 и 40.24 также расщеплялись по одному образцу с появлением полос в 12 т.н. и 7 т.н., что в совокупности с данными расщепления клонов 2.12 и 2.17 указывало на наличие внутреннего сайта рестрикции NotI в последовательности ДНК EF-1α . Фрагменты включения клонов 2.12 и 7.44 субклонировали следующим образом.

ДНК фага (60 мкл), полученную, как описано в примере 1, расщепляли рестриктазой NotI, после чего расщепленную ДНК осаждали добавлением 20 мкл 3 М раствора ацетата натрия и 400 мкл 100% этанола. Осажденную ДНК собирали с помощью центрифугирования, промывали 200 мкл 70% этанола, сушили на воздухе в течение 15 минут, вновь суспендировали в 20 мкл ТЕ, нагревали при 65° С в течение 10 минут, затем прибавляли 2 мкл загружающего буфера для электрофореза. ДНК разделяли, используя гель-электрофорез, полосы 4.5 т.н., 7 т.н., 11 т.н. и 12 т.н. выделяли в виде срезов агарозы. ДНК экстрагировали из каждого среза, используя набор QlAquick фирмы QIAGEN для экстракции геля в соответствии с предложенным производителем протоколом. Чистоту полосы и концентрацию определяли путем разделения аликвоты в 5 мкл каждого выделенного фрагмента в агарозном геле в 0,6% 1х ТАЕ.

Индивидуальные фрагменты по отдельности лидировали в расщепленный рестриктазой Notl вектор pBluescript SW⁺. При лигировании фрагментов 11 и 12 т.н. линеаризованный вектор перед введением фрагмента-вставки обрабатывали щелочной фосфатазой. Использовали 2 мкл каждого лигирования для электропорации 40 мкл электрокомпетентных клеток XL-1 Blue. Трансформированные клетки высевали на пластины с LBM/carb-агарозой с 40 мкл 5% X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β -D-галактопиранозида) в диметилформамиде (DMF) и 20 мкл 0,1 М IPTG (изопропил-β -D-тиогалактопиранозида) на пластину. Клетки инкубировали в течение ночи при 37° С, наутро пластины охлаждали до 4° С для усиления интенсивности голубой окраски.

При вторичном скрининге белые клоны окрашивали на пластинах с LBM/carb-агарозой, содержащих Х-gаl и IPTG, как описано выше, клоны, которые оставались белыми на следующий день, выращивали в 3 мл LBM/carb в течение ночи при 37° С. Плазмидную ДНК из белых клонов, выращенных в течение ночи, получали, используя систему очистки ДНК WIZARD Plus Minipreps (фирмы Promega, Madison, Wl) в соответствии с предложенным производителем протоколом.

Рестрикционный анализ выделенной плазмидной ДНК свидетельствовал о том, что фрагменты 4,5 т.н., 7 т.н. и 12 т.н. были успешно лигированы в вектор pBluescript SW⁺, полученные плазмиды обозначили pSK/EF1.4.5, pSK/EF1.7 и pSK/ЕП.12 соответственно.

Каждую плазмиду затем получали, используя набор миди-преп фирмы QIAGEN в соответствии с предложенным производителем протоколом. ПЦР проводили на каждом новом векторе, титруя матричную ДНК и используя праймеры кодирующего участка (SEQ ID NO: 4-11, применяемые парами, как описано выше, для скрининга псевдогенов, лишенных одного или более интронов). Титрование проводили после того, как было обнаружено, что при высоких концентрациях все три фрагмента включают полностью кодирующий участок EF-1α , что подразумевало возможное перекрестное загрязнение трех плазмидных препаратов. Для титрования ПЦР проводили в условиях, содержащих 2,5 мкл матричной ДНК в концентрациях 0,001, 0,01, 0,1, 1 или 10 нг/мкл, 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера (фирмы Perkin-Elmer), 2,0 мкл 2 мМ смеси dNTP, 1,5 мкл 25 мМ хлорида магния, 0,125 мкл полимеразы Тао (фирмы Perkin-Elmer) и 11,4 мкл дистиллированной воды. Амплификацию проводили при следующих условиях: 4 минуты при 94° С, затем 30 циклов по 1 минуте при 90° С, 2 минуты при 50° С, 4 минуты при 72° С. Результаты указывали на то, что весь кодирующий участок EF-1α находится внутри фрагментов в 4,5 т.н. и 7 т.н.

Рестрикционную карту для каждой вставки составляли с использованием набора нерадиоактивного картирования генов FLASH (фирмы Stratagene), предназначенного для применения с вектором λ FIX II®. Однако вместо ДНК фага использовали плазмидную ДНК, вырезанную с помощью рестриктазы NotI из векторов pSK, описанных выше. По существу протокол картирования не отличался от предложенного производителем. В кратком виде, плазмиды секвенировали с обратными праймерами М13 (SEQ ID NO: 12) и обратными праймерами М13 (SEQ ID NO: 13) (комплементарными участкам, находящимся внутри последовательности множественного клонирования вектора pBluescript SW⁺) для того, чтобы локализовать для каждой вставки праймерные последовательности ТЗ (SEQ ID NO: 14) и Т7 (SEQ ID NO: 15), являющиеся внутренними по отношению к сайту рестриктазы NotI.

М13 GTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID NO: 12

M13rev GGAAACAGCTATGACCATG SEQ ID NO: 13

Т3 AATTAACCCTCACTAAAGGG SEQ ID NO: 14

T7 GTTAATACGGACTCACTATAGGGC SEQ ID NO: 15

Праймеры Т7 и Т3 использовали в качестве зондов в протоколе картирования генов. Поскольку было показано, что вставка EF-1α включает внутренний сайт NotI, предполагалось, что пары фрагментов (4,5 т.н./11 т.н. и 7 т.н./12 т.н.) включают одну или другую праймерную последовательность, и, таким образом, установлено, что вставки 4,5 и 12 т.н. включают праймерную последовательность T7, тогда как вставка 7 т.н. содержит последовательность Т3.

Вставки 4,5 т.н. и 7 т.н., содержащие кодирующий участок последовательности EF-1α , вырезали из вектора с помощью рестриктазы NоtI. Отщепленную ДНК разделяли на агарозном геле, отделенные фрагменты срезали с геля и ДНК выделяли из каждого среза, используя набор для экстракции геля QIAquick фирмы QIAGEN в соответствии с предоставленным изготовителем протоколом. Картирование осуществляли, используя семь различных ферментов и продукты частичной рестрикции. Продукты реакции разделяли на агарозном геле, ДНК переносили на нейлоновую мембрану Duralon-UV и использовали в качестве зонда олигонуклеотид Т3 или Т7. Оценивали параметры полос и создавали рестрикционные карты.

Плазмиду pSK/EF-1.7 скринировали с внутренними праймерами, первоначально созданными для скрининга с помощью ПЦР (SEQ ID NO: 4-11, ранее описанные праймеры 95-136-95-143), чтобы быть уверенными в том, что генная последовательность отвечает ранее идентифицированному белку. Определяли ориентацию кодирующего участка и создавали дополнительные праймеры, что позволило осуществить секвенирование до внутреннего сайта NotI. Определяли последовательность всего кодирующего участка и сравнивали ее с ожидаемой последовательностью кДНК, описанной Hayashi и др. (см. выше). Анализ последовательности подтвердил, что выделенная ДНК действительно кодирует такие же последовательности EF-1α , как описанные Hayashi и др., (см. выше). Кроме того, последовательность первого экзона была идентична ранее опубликованной 5’-концевой последовательности кДНК хомячковой EF-1α , (Hayashi и др., см. выше), были идентифицированы семь интронов, образующие структуру, подобную таковой для человеческого гомолога.

Последовательность и рестрикционная карта, полученные от фрагмента в 7 т.н., указывали на то, что часть 5’-фланкирующего интрона и промотор локализованы во фрагменте в 12 т.н. в 5’-положении по отношению к внутреннему сайту NotI. Фрагмент SpeI/NotI в 3 т.н. в 5’-положении по отношению к внутреннему сайту NotI вырезали из вставки в 12 т.н. и субклонировали в плазмиду pBluescriptSK⁺, расщепленную ранее теми же ферментами, полученную плазмиду обозначали pSK/EF1.3. Фрагмент в 3 т.н. картировали, как описано выше, используя КрnI и СlаI для того, чтобы подтвердить рестрикционные сайты, и секвенировали с применением набора “Убирай основание” (фирмы Promega, Madison, WI), используя сайты КрnI и ClaI для создания 5’- и 3’-расширений соответственно. Анализом последовательности идентифицировали участки, содержащие промотор, ТАТА-бокс и интрон в 0,9 т.н. в 5’-нетранслированной фланкирующей последовательности, которая имела такую же протяженность, как первый интрон человеческого гена (Uetsuki, 1989, см. выше). Последовательность для промотора CHEF1 и 5’-интрона находится в SEQ ID NO: 1, причем интрон включает нуклеотиды 2699-3641.

Пример 3 Характеристика регуляторной ДНК гена CHEF

Последовательность, расположенная против хода транскрипции и включающая стартовый ATG-кодон хомячкового гена EF-1α , находится в SEQ ID NO: 1. Большая часть идентифицируемых сайтов связывания фактора транскрипции, по-видимому, находится на 3’-конце перед сайтом Sacl, расположенным в последовательности в 1,56 т.н. на 5’-конце по отношению к инициирующему ATG-кодону гена EF-1α . Однако каждый из экспрессионных векторов, включающий описанные ниже последовательности CHEF1, также содержит 2 т.н. последовательности CHEF1 на 5’-конце по отношению к сайту Sacl.

Секвенирование указывало на присутствие абсолютно согласованного ТАТА-бокса, расположенного на расстоянии приблизительно в 1 т.н. на 5’-конце по отношению к стартовому ATG-кодону, а участок между верхним сайтом Sacl и ТАТА-боксом включал многочисленные потенциальные сайты связывания фактора транскрипции (Boulikas, Cht. Rev. Euk. Gene Exp., 4, 117-321, 1994), в том числе сайты Sp1 (SEQ ID NO:№16-17), сайты ATF (SEQ ID NO: 18) и сайты NF-1 (SEQ ID NO: 19).

GGCGGG SEQ ID NO: 16

GGGCGG SEQ ID NO: 17

TGACGY(C/A)R SEQ ID NO: 18

TTGGCN_5.6(T/G)CCR SEQ ID NO: 19

Подобно человеческому гену EF-1α (Uetsuki и др., см. выше), в 5’-нетранслированном участке (UTR) хомячкового гена EF-1α находится интрон в 943 п.н., который выявляется при обнаружении донорных и акцепторных последовательностей сплайсинга. Однако при использовании программы анализа ДНК Geneworks было обнаружено, что последовательность интрона в 5’-UTR только на 62% идентична соответствующей последовательности человеческого гена. 5’-Интрон включает многочисленные потенциальные сайты связывания фактора транскрипции, число которых приблизительно совпадает с числом сайтов связывания между сайтом Sacl и ТАТА-боксом, что свидетельствует о значении 5’-интрона для оптимальной транскрипции от промотора EF-1α .

С использованием программы анализа ДНК Geneworks было обнаружено, что последовательность CHEF1 от расположенного против хода транскрипции рестрикционного сайта Sacl до расположенных по ходу транскрипции, но не включаемых последовательностей 5’-интрона, на 64% идентична человеческой последовательности EF-1α . Сопоставление расположения сайтов связывания фактора транскрипции Sp1 как в человеческих, так и в хомячковых регуляторных последовательностях приведено в таблице 1. Полная последовательность человеческого гена EF-1α (Uetsuki и др., см. выше) расположена в SEQ ID NO: 29.

Таблица 1

Расстояние сайтов Sp1 от ТАТА-бокса

Хомяк
Положение нуклеотидаЧеловек
Положение нуклеотида-424-335-304-220-183-208-171432-151476-135573-2658163690156 168 257 261 425 495 589 594 688 

Пример 4

конструкция экспрессионных плазмид

Многочисленные плазмиды, использованные в последующих примерах, были сконструированы следующим образом.

Плазмиду pSV2-dhfr (AKTK, регистрационный №37146) расщепляли с рестриктазами SphI/BamHI и очищали фрагмент в 1,8 т.н., кодирующий дигидрофолатредуктазу (DHFR) (фрагмент 1). Фрагмент, кодирующий DHFR, включал также промотор/оператор вируса SV40 и полиаденилирующие последовательности, расположенные на 5’- и 3’-конце соответственно по отношению к гену dhfr. Плазмиду pSL1190 (фирмы Pharmacia) расщепляли с помощью рестриктазы HindIII, выступающие концы замещали фрагментом Кленова, тупые концы ДНК вновь лигировали для разрушения сайта HindIII с образованием плазмиды pSL1190H, которую затем расщепляли с помощью рестриктаз SphI/BamHI и очищали фрагмент в 3,4 т.н. (фрагмент 2). Фрагмент pSV2-dhfr в 1,8 т.н. (фрагмент 1) лигировали к фрагменту pSL1190H в 3,4 т.н. (фрагменту 2), получая плазмиду pSL1190H-dhfr.

Плазмиду pSL1190H-dhfr модифицировали для элиминирования некоторых рестрикционных сайтов следующим образом. Сначала плазмиду расщепляли с помощью рестриктаэ XbaI/NheI (получая комплементарные выступающие концы), линейную плазмиду вновь лигировали, элиминируя сайты как ХbаI, так и NheI. Во втором процессе плазмиду pSL1190H-dhfr расщепляли с помощью рестриктазы HindIII, выступающие концы замещащли с фрагментом Кленова, линейную плазмиду вновь лигировали, элиминируя сайт HindIII. В третьем процессе плазмиду pSL1190H-dhfr расщепляли с помощью рестриктазы BgIII, выступающие концы замещащли с фрагментом Кленова, линейную плазмиду вновь лигировали, элиминируя сайт BgIII. В итоге этих трех этапов получали плазмиду pSL1190H-dhfr/NXHB, в которой сайты XbaI, NheI, HindIII и BgIII были разрушены. Затем плазмиду pSL1190H-dhfr/NXHB расщепляли с помощью рестриктаз EcoRI/BamHI, линкер NPB1/NPB2 [сконструированный из олигонуклеотидов отжига NPB1 и NPB2 (SEQ ID NO:№20 и 21)] включали с образованием плазмиды pSL/dhfr/NotI, имеющей уникальный сайт рестрикции NotI.

NPB1 GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (SEQ ID NO: 20)

NPB2 AATTGGATCCGTTTAAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 21)

Полученную плазмиду pSL/dhfr/NotI расщепляли с помощью рестриктаз Asр718/ВатНI и очищали фрагмент в 1,8 т.н., кодирующий DHFR (фрагмент 3). Плазмиду pRc/CMV (фирмы Invitrogen, San Diego, CA) расщепляли с помощью рестриктазы Asp718/BgIII для удаления промотора CMV, очищали фрагмент опосредованного бычьим гормоном роста (ВGН) полиаденилирования ДНК и фрагмент в 3,7 т.н. (фрагмент 4). Фрагмент pSL/dhfr/NotI в 1,8 т.н., кодирующий DHFR, с промотором/оператором SV40 и последовательности полиаденилирования (фрагмент 3) лигировали к фрагменту pRc/CMV в 3.7 т.н. (фрагменту 4), получая плазмиду pRc/DHFR/NotI.

Плазмиду pRc/CMV расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/XbaI, очищали фрагмент, кодирующий опосредованное BGH полиаденилирование ДНК (фрагмент 5). Плазмиду pRc/DHFR/NotI расщепляли с помощью рестриктазы BamHI/Asp718, очищали фрагмент в 4 т.н., кодирующий DHFR, промотор/оператор SV40 и последовательности полиаденилирования (фрагмент 6). Плазмиду рСЕР4 (фирмы Invitrogen, San Diego, CA) расщепляли с помощью рестриктаз SgIII/SacI, очищали фрагмент в 0,7 т.н., кодирующий промотор CMV (фрагмент 7). Фрагмент pRc/DHFR/NotI в 0.8 т.н. (фрагмент 5), фрагмент pRc/CMV в 4 т.н. (фрагмент 6), фрагмент рСЕР4 в 0,7 т.н. (фрагмент 7) и синтетический адапторный фрагмент SacI/XbaI соединяли с помощью четырехстадийного лигирования, получая плазмиду pDC1. Адаптер конструировали путем отжига олигонуклеотидов SXP1 и SXP2.

SXP1 (SEQ ID NO: 22)

5’-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTCCTCTAAAGAAGCCCCAAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3’

SXP2 (SEQ ID NO: 23)

5’-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTTGGGGCTTCTTTAGAGGAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3’

Таким образом, плазмида pDC1 включает промотор CMV, полилинкерный участок, сайт полиаденилирования от BGH, ген dhfr под контролем промотора SV40 и последовательность сплайсинга/полиаденилирования SV40.

Плазмиду pDC1 расщепляли с помощью рестриктазы XhoI, фрагмент в 4,5 т.н., лишенный промотора CMV, и BGH-полиаденилированную ДНК выделяли и лигировали, получая плазмиду pDCi1. Затем плазмиду pDCi1 расщепляли с помощью рестриктаз BamHI/XhoI и очищали фрагмент в 4,5 т.н. (фрагмент 8). Фрагмент pDCi1 в 4,5 т.н. (фрагмент 8) лигировали к расщепленному рестриктазами BamHI/XnoI фрагменту ПЦР, кодирующему частичную последовательность промотора CMV, полученную с использованием праймеров 96-13 и 96-14 (плазмида pDC1 в качестве матрицы), получая плазмиду pDCi2.

Праймер 96-13 (SEQ ID NO: 24)

5’-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCCGGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3’

Праймер 96-14 (SEQ ID NO: 25)

ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT

Плазмиду pDCi2 расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/SpeI, очищали фрагмент в 4,2 т.н., кодирующий DHFR, с промотором/оператором SV40 и последовательности полиаденилирования (фрагмент 9), плазмиду pDC1 расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/SpeI, очищали фрагмент в 1,5 т.н., включающий частичную промоторную ДНК CMV с сигнальными последовательностями опосредованного BGH полиаденилирования (фрагмент 10). Фрагмент pDCi2 в 4,2 т.н. (фрагмент 9) лигировали к фрагменту pDC1 в 1,5 т.н. (фрагменту 10), получая плазмиду pDC31. Плазмида pDC31 отличалась от плазмиды pDC1 несколькими новыми сайтами рестрикции, включая SmaI и AscI на 5’-конце промотора CMV. Плазмиду pDC31 расщепляли с помощью рестриктазы NotI, выступающие тупые концы ДНК сшивали, используя полимеразу Т4, плазмиду вновь лигировали для элиминирования сайта NotI, получая плазмиду pDC36. Плазмида pDC36 отличается от плазмиды pDC31 отсутствием сайта NotI.

Плазмиду pDC36 расщепляли с помощью рестриктаз ApaI/BamHI, выступающие концы замещали, плазмиду повторно лигировали, получая плазмиду pDC38, которая отличалась от плазмиды pDC36 отсутствием фрагмента АраI/ВатНI, содержащего последовательность BGH-полиаденилирования. Плазмиду pDC38 расщепляли с помощью рестриктаз SmaI/HindIII, очищали фрагмент ДНК в 4,6 т.н., лишенный промотора CMV (фрагмент 11).

Плазмиду pSK/ЕF1.3 расщепляли с помощью рестриктаз EcoRV/NofI/PvuI, очищали фрагмент в 2,9 т.н., кодирующий промотор CHEF1 и расположенные против хода транскрипции последовательности ДНК (фрагмент 12). Плазмиду Bluescript SW⁺II (pSK⁺) расщепляли рестриктазой Nоtl, очищали фрагмент в 2,9 т.н. (фрагмент 13). Фрагмент NotI в 7 т.н. из λ -фага лигировали к фрагменту pSK⁺ в 2,9 т.н. (фрагмент 13), получая плазмиду pSK/EF1.7.

Плазмиду pSK⁺ расщепляли с помощью рестриктаз HindIII/NotI, очищали фрагмент в 2,9 т.н. (фрагмент 14). Плазмиду pSK/EF1.7 расщепляли с помощью рестриктаз NotI/NcoI, очищали фрагмент в 620 п.н., кодирующий часть 5’-нетранслированного интрона CHEF1 (фрагмент 15). Очищали фрагмент ПЦР в 123 п.н., отщепленный с помощью рестриктаз HindIII/NcoI, кодирующий остающийся 5’-интрон, генерированный с праймерами 96-36 и 96-45 и плазмидой pSK/EFI.12 в качестве матрицы (фрагмент 16).

Праймер 96-36 (SEQ ID NO: 26)

GGCTTAGCTCCGAGGAGGG

Праймер 96-45 (SEQ ID NO: 27)

CGTGACAAGCTTGGTTTTCACAACAC

Фрагмент pSK⁺ в 2,9 т.н. (фрагмент 14), фрагмент pSK/EF1.7 в 620 п.н. (фрагмент 15) и фрагмент HindIII/NcoI в 123 п.н. (фрагмент 16) лигировали, получая плазмиду pSK/5’ EF-1, имеющую полную 5’-последовательность интрона CHEF1.

Плазмиду pSK/5’ EF-1 расщепляли с помощью рестриктаз HindIII/NotI, очищали фрагмент в 0,7 т.н., кодирующий 5’-интрон (фрагмент 17). Фрагмент pDC38 в 4,6 т.н., лишенный промотора CMV (фрагмент 11), фрагмент pSK/EF1.3 в 2,9 т.н. с промотором CHEF1 и последовательностями, расположенными против хода транскрипции (фрагмент 12), и фрагмент pSK/5’ EF-1 в 0,7 т.н., кодирующий полный 5’-интрон (фрагмент 17), соединяли с помощью трехстадийного лигирования, получая плазмиду pDEF1, которая, таким образом, содержала полную регуляторную ДНК 5’-CHEF1, ген dhfr, источник репликации SV40, который допускал репликацию очень большого числа копий в клеточных линиях, трансформированных Т-антигеном вируса SV40.

Плазмиду pDEF1 расщепляли рестриктазой HindIII, выступающие концы замещали, плазмиду расщепляли рестриктазой Nofl, очищали фрагмент в 2,6 т.н., содержащий промотор CHEF1 и расположенную против хода транскрипции последовательность ДНК в дополнение к частичной 5’-последовательности интрона (фрагмент 18). Плазмиду pDEF1 расщепляли с помощью рестриктаз NоtI/Asр718, очищали фрагмент в 1,3 т.н., кодирующий остающийся 5’-интрон (фрагмент 19). Плазмиду pDC38 расщепляли с помощью рестриктаз SmaI/Asp718, очищали фрагмент в 4 т.н., кодирующий DHFR, с промотором/оператором SV40 и полиаденилированной ДНК (фрагмент 20). Фрагмент pDEF1 в 2,6 т.н. (фрагмент 18), фрагмент pDEF1 в 1,3 т.н. (фрагмент 19) и фрагмент pDC38 в 4 т.н. (фрагмент 20) соединяли путем трехстадийного лигирования, получая плазмиду pDEF2. Плазмида pDEF2 в штамме XL-1 Blue E. colt под регистрационным номером 98343 была заложена на хранение 4 марта 1997 года в Американскую коллекцию типов культур, (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852). Плазмида pDEF2 отличается от плазмиды pDEF1 отсутствием 0,3 т.н. во фрагменте HindIII/SpeI в 2,3 т.н., предшествующем ТАТА-боксу CHEF1, а также наличием только одного сайта HindIII в полилинкерном участке. Плазмида pDEF2 используется в тех случаях, когда ген, который должен быть экспрессирован, включает свой собственный сайт полиаденилирования.

Плазмиду pDEF2 расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/XbaI для линеаризации, при которой также элиминировались последовательности начала репликации, фрагмент в 7,4 т.н. очищали (фрагмент 21). Плазмиду pDC1 расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/XbaI, очищали фрагмент в 0,8 т.н., включающий точку начала замещения или репликации ДНК в дополнение к последовательностям BGH-полиаденилирования (фрагмент 22). Фрагмент pDEF2 в 7,4 т.н. (фрагмент 21) и фрагмент pDC21 в 0,8 т.н. (фрагмент 22) соединяли, получая плазмиду pDEF10, которая отличается от плазмиды pDEF1 так же, как плазмида pDEF2. Плазмида pDEF10 отличается от плазмиды pDEF2 наличием сайта полиаденилирования от гена бычьего гормона роста на 3’-конце полилинкерного участка.

Плазмиду pDEF10 с целью линеаризации расщепляли с помощью рестриктаз HindIII/XbaI, очищали фрагмент в 8.2 т.н. (фрагмент 23). Плазмиду pDCI/MDC, кодирующую полученный на основе макрофага человеческий хемокин (MDC), расщепляли с помощью рестриктаз HindIII/XbaI, очищали фрагмент в 0,4 т.н., кодирующий MDC (фрагмент 24). Лигирование фрагмента pDEF10 в 8,2 т.н. (фрагмент 23) с фрагментом pDC/MDC в 0,4 т.н. (фрагмент 24) привело к плазмиде pDEF10/MDC.1.

Плазмиду pRc/CMV расщепляли рестриктазой BamHI, выступающие концы замещали фрагментом Кленова, плазмиду расщепляли рестриктазой Asр718, очищали фрагмент в 1,5 т.н. (фрагмент 25). Плазмиду pDC1 расщепляли с рестриктазой NotI, выступающие концы замещали фрагментом Кленова, плазмиду расщепляли рестриктазой Asp7t8, очищали фрагмент в 3,9 т.н. (фрагмент 26). Лигировали фрагмент pRc/CMV в 1,5 т.н. (фрагмент 25) с фрагментом pDC1 в 3,9 т.н. (фрагмент 26), получая плазмиду рМСХ.

Плазмида pNCX подобна плазмиде pDC1 за исключением того, что в ней ген dhfr заменен на ген, устойчивый к неомицину (NeoR). Плазмиду pNCX расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/Pvul, очищали фрагмент в 2,1 т.н. (фрагмент 27). Плазмиду pDEF1 расщепляли с помощью рестриктаз Asp718/PvuI, очищали фрагмент в 5,9 т.н. (фрагмент 28). Фрагмент pNCX в 2,1 т.н. (фрагмент 27) лигировали к фрагменту pDEF1 в 5,9 т.н. (фрагмент 28), получая плазмиду pNEF1. Плазмида pNEF1 отличается от плазмиды pDEF1 наличием устойчивого к неомицину бактериального гена (NeoR), кодирующего устойчивость к неомицину или G418. Для включения генов в плазмиду pNEF1 обычно используют фрагменты HindIII/XbaI с последующим расщеплением рестриктазой HindIII или трехстадийным лигированием, поскольку плазмида содержит два сайта HindIII.

Пример 5

Трансфекция клеток линии DG44 и анализ продуктивности

Для трансфекции клеток-хозяев одной плазмидой 50-100 мкг плазмиды линеаризовали обычным методом путем расщепления с помощью рестриктазы PvuI или AscI. Для трансфекции, при которой вводили две плазмиды в клетки линии СНО, плазмиды оставляли нерасщепленными. Перед трансформацией плазмиды осаждали этанолом и дважды промывали 70% этанолом. Осадок ДНК сушили непродолжительное время и вновь суспендировали в 400 мкл стерильной дистиллированной воды. К ресуспендированной ДНК прибавляли 400 мкл стерильного буфера 2х HeBS [40 мМ НЕРЕS(N-2-гидроксипиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота)-NаОН, рН 7,0; 274 мМ NaCl; 10 мМ KCl; 1,4 мМ Na₂HPO₄; 12 мМ декстроза]. Нетрансфицированные клетки DG44 культивировали в среде DMEM/F-12, уравновешенной гипоксантином (конечная концентрация 0,01 мМ) и тимидином (конечная концентрация 0,0016 мМ), что обозначается также как "НТ". Для роста как нетрансфицированных, так и трансфицированных клеток DG44 к среде прибавляли диализованную FBS (эмбриональную бычью сыворотку) до конечной концентрации 5-10% объемных. Клетки линии DG44 готовили для трансфекции путем выращивания культур примерно до 50% слияния или менее в полистирольных сосудах Корнинга для культивирования тканей на 150 см². Клетки удаляли из пластика путем аспирации среды, промывали слипшиеся клетки забуференным фосфатным буфером физиологическим раствором, не содержащим кальция и магния (CMF-PBS: 2,7 мМ KCl; 1,5 мМ КН₂РO₄; 137 мМ NaCl; 8,1 мМ Na₂HPO₄), прибавляли 4 мл раствора, содержащего 0,0125% облученного трипсина (фирмы Worthington Biochemical Corporation) в буфере CMF-PBS, инкубировали при 37° С в течение нескольких минут. Прибавляли среду (4 мл), содержащую эмбриональную бычью сыворотку (FBS), определяли концентрацию клеток, аликвоты в 2× 10⁷ клеток осаждали с помощью центрифугирования. Каждый клеточный осадок промывали один раз буфером CMF-PBS и вновь суспендировали в 0,8 мл раствора, содержащего буфер HeBS и целевую плазмидную ДНК. Ресуспендированные клетки переносили в кювету Gene Pulser (фирмы Bio-Rad) при комнатной температуре, кювету помещали в прибор для электропорации Bio-Rad Gene Pulser с емкостью конденсатора 290 В и 960 мкФ (9-11,5 мс имп.). Клетки выдерживали в кювете в течение приблизительно 10 минут, затем прибавляли к 10 мл буфера DMEM/F-12, уравновешенного 5-10% диализованной FBS и НТ. В это время определяли интенсивность гибели клеток (вытеснение красителя трипанового голубого), которая обычно составляла примерно 50%. Затем клетки осаждали центрифугированием, снова суспендировали в 2 мл среды DMEM/F-12, уравновешенной 5-10% диализованной FBS и НТ (“неселективная среда”), высевали в полистирольные планшеты на 10 см² для культур тканей. Через двое суток роста клетки, как правило, слившиеся к этому времени, удаляли из планшетов, используя для этой цели трипсин, как описано выше, и высевали в планшеты на 10 см² при различных разбавлениях в буфере DMEM/F-12, уравновешенном 5-10% диализованной FBS и не содержащим НТ (“селективная среда”). Через 5-9 суток клетки загружали селективной средой. Примерно через две недели трансфектантные колонии (обычно более 1000 на каждую трансфекцию) удаляли из планшетов, используя трипсин, как описано выше, после добавления селективной среды определяли клеточную концентрацию. В планшеты на 10 см², содержащие 10 мл селективной среды, вносили, по меньшей мере, две аликвоты по 2× 10⁶ клеток от каждой трансфекции. Клетки выращивали до вырождения, до того времени, как большая часть клеток отслаивалась от планшета из-за перенаселенности. Супернатант от таких культур анализировали методом иммуноферментного анализа ELISA, определяя средний титр продукта.

Пример 6

Получение рекомбинантного белка с использованием CHEF1

Клетки линии DQ44, описанные в примере 5, трансфицировали плазмидами, несущими гены, приведенные в таблице 3, оперативно связанные с последовательностью CHEF1 регуляторной ДНК. Бактериальные штаммы, трансформированные плазмидами, кодирующими каждый из используемых в исследованиях генов, были заложены на хранение 1 апреля 1997 года в Американскую коллекцию культур тканей (12301 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20852) под регистрационными номерами, приведенными в таблице 2.

Таблица 2

Регистрационные номера плазмид

Кодированный генОбозначение плазмидыРегистрационный номерТяжелая цепь антитела IСМ3PDEF1/ICM3H.298381Легкая цепь антитела IСМ3PNEF1/ICM3L398382Тяжелая цепь антитела 23F2GPDEF1/F2GH.198383Легкая цепь антитела 23F2GPNEF1/F2GL198384ХитиназаPDEF1/CTN.198385Ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов (PAF-AH)PDEF2/HPH.498386Хемокин, полученный на основе макрофага (MDC)PDEF10/MDC.198387

После отбора трансфектантов пул колоний (более 200) от каждой трансфекции удаляли из каждого планшета, используя трипсин, одинаковое число клеток от каждой трансфекции вновь помещали в планшеты и выращивали до вырождения. Супернатанты удаляли, экспрессию белка анализировали, применяя либо метод иммуноферментного анализа ELISA, либо ферментный анализ. Результаты приведены в таблице 3.

За исключением первого эксперимента по исследованию экспрессии хитиназы (обозначена как хитиназа-1 в таблице 3) использование регуляторной ДНК-последовательности CHEF1 привело к значительно более высоким уровням продукции белка, изменяющимся в пределах от трехкратного до одиннадцатикратого повышения экспрессии по сравнению с промотором CMV.

Для того чтобы определить, является ли пониженная экспрессия, наблюдавшаяся в опыте с хитиназой, аномальной или повторяемый результат характерен и/или уникален для хитиназы, был проведен повторный эксперимент, но с использованием двух отдельных трансфекций в отличие от однократной трансфекции, использованной в первом эксперименте, приведшем к необычайно низкому количеству полученных трансфектантов. Кроме того, использовали другой метод анализа хитиназной активности, который давал более точные результаты, чем методика, примененная в первом эксперименте.

Вторая попытка трансфекции привела к такому количеству трансфектантов, которое хорошо согласовывалось с результатами, полученными ранее, при использовании плазмиды pDEF2, которая в других экспериментах давала более 150% от количества трансфектантов при использовании плазмиды CMV. Хотя наблюдаемое усиление экспрессии белка (примерно в 1,4 раза) по сравнению с экспрессией при использовании промотора CMV было меньше, чем наблюдаемое ранее для других исследованных белков, согласующиеся результаты второго эксперимента (обозначенного как хитиназа-2 в таблице 3) служили дополнительным подтверждением полученных данных.

Пример 7

Получение рекомбинантного белка с использованием регуляторной ДНК CHEF1 различной длины

Экспрессионный вектор, включающий дополнительные 8 т.н. 5’-фланкирующей ДНК гена EF1-α был также сконструирован и обозначен pDEF14. Плазмида pDEF14 отличается от плазмиды pDEF2 тем, что первая из них содержит приблизительно 11,7 т.н. 5’-фланкирующей ДНК хомячкового гена EF1-α , тогда как плазмида pDEF2 содержит только 3,3 т.н. той же последовательности. Плазмида pDEF14 включает также 4 т.н. 3’-фланкирующей ДНК, смежной с 3’-концом экспрессионной кассеты DHFR. Большую плазмиду pDEF14 конструировали, как описано ниже.

Краткое содержание методики: фрагмент AscI/NotI CHEF1 в 11 т.н. удаляли из плазмиды pDEF2 и на его место включали фрагмент AscI/NotI в 11 т.н. Включение большей последовательности потребовало прежде всего проведения модификации сайта XbaI, расположенного на расстоянии 11,7 т.н. в 5’-положении сайта инициации ATG гена EF1-α , в сайт AscI. Кроме того, фрагмент NsiI/SalI с тупыми концами, состоящий из фланкирующей последовательности CHEF1, начиная с сайта NsiI в 118 п.н. в 3’-положение по отношению к стоп-кодону EF1-α , был включен в сайт FmeI/SalI в 3’-положении по отношению к экспрессионной кассете DHFR, расположенной на 3’-конце полилинкерного участка, в который включались экспрессируемые гены. Полная 3’-последовательность ДНК, начиная от стоп-кодона гена EF1-α , располагается в SEQ ID NO: 28. Бактерии, трансформированные этой плазмидой, были заложены на хранение 9 апреля 1997 года в Американскую коллекцию типов культур (123 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) под регистрационным номером 98398. Полученная плазмида pDEF-14 включает уникальные сайты ХbаI и NotI наряду с множественными сайтами HindIII, что делает необходимым трехстадийное лигирование при включении гена в плазмиду для экспрессии. Например, ген может быть включен в плазмиду лигированием фрагмента HindIII/XbaI, включающего целевой ген, с фрагментом NotI/HindIII в 737 п.н. от плазмиды pDEF14 и фрагмента XbaI/NotI в 19,7 т.н. от плазмиды pDEF14.

Экспрессию белка с использованием этого вектора сравнивали с экспрессией при использовании вектора pDEF2, включающего меньшую часть 5’-фланкирующего участка EF1-α . В предварительных экспериментах ДНК, кодирующую как тяжелую, так и легкую цепь антитела 23F2G, субклонировали как в вектор pDEF2, так и в вектор pDEF14, уровни экспрессии определяли путем последующей трансфекции в клетки линии DG44, как описано в примере 5. Гены, кодирующие обе цепи антитела, располагали линейно в векторах, экспрессию обоих генов осуществляли с помощью последовательности CHEF1 в отдельных плазмидах. Кодирующие участки для двух цепей в каждой плазмиде отделяли идентичными ДНК в 4,3 т.н., полученными из 3’-нетранслированного участка человеческого иммуноглобуллина lgG4.

Результаты указывали на то, что экспрессия антитела 23F2G от большей последовательности CHEF1 в плазмиде pDEF14 была в четыре раза выше, чем экспрессия антитела от меньшей последовательности pDEF2. Этот результат был неожиданным, поскольку большая часть идентифицируемых сайтов транскрипционного фактора связывания плазмиды pDEF14 находится также в ДНК-последовательности плазмиды pDEF2. Поэтому не исключено, что один дополнительный и неидентифицированный сайт (или более) транскрипционного фактора связывания либо энхансерные последовательности расположены в ДНК CHEF1 в плазмиде pDEF14. В качестве альтернативы большая ДНК CHEF1 может обусловить повышенную транскрипцию в результате некоторых свойств 3’-последовательности ДНК.

Предполагается, что для специалистов очевидны многочисленные модификации и варианты изобретения, подобные приведенным выше в иллюстративных примерах. Следовательно, изобретение имеет только те ограничения, которые упоминаются в приводимой формуле изобретения.

Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к очищению и выделению полинуклеотидов, регулирующих транскрипцию генов млекопитающих, и может быть использовано для регуляции экспрессии гетерологичных полинуклеотидов, получения трансгенных животных и для идентификации родственных регуляторных последовательностей ДНК. ДНК, содержащую транскрипционную регуляторную ДНК гена хомяка EF-1α, выделяли путем скрининга геномной библиотеки к ДНК яичника китайского хомячка (СНО-К1). Конструируют химерный полинуклеотид, включающий выделенную регуляторную ДНК гена хомяка EF-1α, оперативно связанную с генной последовательностью, кодирующей целевой белковый продукт, отличный от белка, кодируемого геном хомяка EF-1α. Полученный химерный полинуклеотид используют в составе экспрессионной плазмиды для трансформирования или трансфицирования клетки-хозяина. Для увеличения транскрипции целевого гена в клетке-хозяине интегрируют ДНК, содержащую регуляторную ДНК гена хомяка EF-1α, в геномную ДНК клетки-хозяина в положение, оперативно связанное с целевым геном. Изобретение обеспечивает повышение в 3-11 раз уровней экспрессии мРНК оперативно связанных гетерологичных полинуклеотидов, 14 с. и 17 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Очищенная и выделенная ДНК, содержащая транскрипционную регуляторную ДНК гена хомяка ЕF-1α, выбранная из группы, состоящей из

а. ДНК, содержащей последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1;

b. ДНК, содержащей часть последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в SEQ ID NO:1, способную промотировать транскрипцию гена, оперативно связанного с регуляторной ДНК;

с. ДНК, содержащей последовательность от нуклеотида примерно 2114 до нуклеотида примерно 3656 в полинуклеотиде, показанном в SEQ ID NO:1;

d. 11,7 кв регуляторного домена в плазмиде рDEF14; и

е. ДНК, содержащей последовательность, приведенную в SEQ ID NO:28.