СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУЦИНА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к биомедицине, а именно к медицинской микробиологии и иммунологии.

Муцин - кислый белок (гликопротеин). Он является обязательным компонентом секретов слизистых оболочек желудочно-кишечного, респираторного трактов, мочеполовой системы и конъюнктивы, выполняя функции фактора врожденного иммунитета. Содержание муцина изменяется при патологических процессах в вышеуказанных отделах организма человека. При синдроме “сухих глаз” (“dry eyes”) выявлено стойкое снижение содержания муцина в конъюнктивальном мешке. При язвенной болезни желудка обнаружено длительное увеличение концентрации муцина в слюне, содержание которого практически нормализуется после проведенного лечения и рубцевания язв.

В качестве прототипа авторы предлагают способ количественного определения содержания белка и муцина (гликопротеинов) в слюне с использованием реактива Бенедикта (Коробейникова Э.Н., Ильиных Е.И. Количественное определение содержания белка и муцина (гликопротеинов) в слюне. Клиническая лабораторная диагностика. - 2001, №8. - С.34-35). Сущность метода заключается в том, что растворы белков в щелочной среде с реактивом Бенедикта дает фиолетовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка. Реактив Бенедикта готовят следующим образом: к 50 мл дистиллированной воды добавляют 17,3 г цитрата натрия и 10 г карбоната натрия. Смесь нагревают до полного растворения солей, не доводя до кипения. Отдельно растворяют 1,73 г сульфата меди в 10 мл дистиллированной воды, полученный раствор добавляют к первому и доводят дистиллированной водой до 100 мл. Для определения белка в исходной слюне к 0,1 мл слюны приливают 1,9 мл дистиллированной воды, 2 мл 6% раствора гидроксида натрия и 0,2 мл реактива Бенедикта, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 15 минут. Затем пробу спектрофотометрируют при длине волны 330 нм против контроля на реактивы, измеряя ее оптическую плотность. Концентрацию белка определяют, используя калибровочный график, отражающий зависимость оптической плотности стандартного раствора альбумина от его концентрации. Для осаждения муцина к 0,1 мл слюны добавляли 1,9 мл дистиллированной воды и 2-3 капли 20% раствора уксусной кислоты, перемешивали в течение 5 минут, затем центрифугировали при 2000 оборотов в минуту. К надосадочной жидкости добавляют 2 мл 6% раствора гидроксида натрия и 0,2 мл реактива Бенедикта и определяют концентрацию белка в ней аналогично методике для исходной слюны. Количество муцина определяют по разности количества белка в исходной слюне и в надосадочной жидкости, образовавшейся после осаждения муцина.

К недостаткам количественного способа определения муцина с использованием реактива Бенедикта относится, во-первых, нестойкость цветного комплекса на свету, так как степень окрашивания растворов изменяется в течение 10-15 минут и скорость изменения окрашивания зависит от степени освещенности в помещении. Во-вторых, концентрация водородных ионов (рН) исходной слюны и надосадочной жидкости, образовавшейся после осаждения муцина, отличаются, так как используется кислотное осаждение. В-третьих, построение калибровочного графика требует дополнительного времени. В-четвертых, забор дозатором малого объема слюны (0,1 мл) представляет трудность в связи с ее густой консистенцией. В связи с вышеизложенным количественный способ определения муцина с использованием реактива Бенедикта является трудоемким, условия формирования и устойчивость окрашенного комплекса не обеспечивают достаточную стандартность исследования, особенно при большом количестве проб.

Авторы предлагают способ количественного определения муцина в биологических жидкостях организма человека спектрофотометрическим методом, используя цветную реакцию с бромфеноловым синим. Сущность метода заключается в том, что растворы белков с бромфеноловым синим в кислой среде образуют окрашенный комплекс, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка. Авторы приводят экспериментальные данные на примере слюны как наиболее доступном для исследования материале. Способ может быть использован для любой биологической жидкости, такой как желудочный сок, содержимое конъюнктивального мешка, бронхиальная слизь. Забор слюны в объеме 1 мл осуществляли у 44 практически здоровых человек натощак после чистки зубов и тщательного прополаскивания ротовой полости.

Для проведения опыта готовят водные растворы альбумина концентрацией 0,25 г/л, бромфенолового синего - 1,2 г/л и буферный раствор (рН 3,0), содержащий 320 ммоль/л лимонной кислоты и 160 ммоль/л натрия фосфата. Раствор бромфенолового синего и буферный раствор смешивают в соотношении 2:23, получая рабочий реагент. Для определения белка в исходной слюне готовят: контрольную пробу, включающую 2,5 мл рабочего реагента и 0,5 мл дистиллированной воды, стандартную пробу - 2,5 мл рабочего реагента и 0,5 мл раствора альбумина и опытную пробу - 2,5 мл рабочего реагента и 0,5 мл слюны. Содержимое каждой пробы перемешивают, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Стабильность окраски окрашенного комплекса составляет не менее 6 часов. Определяют оптическую плотность (ОП) опытной и стандартной проб против контрольной пробы при длине волны 620 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см. Концентрацию белка рассчитывают по формуле С=(ОП_оп.:ОП_ст.)×0,25, где С - концентрация белка (г/л), ОП_оп. - оптическая плотность опытной пробы, ОП_ст. - оптическая плотность стандартной пробы, 0,25 - концентрация белка в растворе альбумина в г/л.

Осаждение муцина проводят добавлением к 0,5 мл слюны 0,05 мл 20% уксусной кислоты, через 5 минут проводят центрифугирование при 2000 оборотов в минуту в течение 10 минут.

Определение белка в надосадочной жидкости проводят аналогично методике для исходной слюны, используя вместо слюны надосадочную жидкость.

Концентрация муцина в слюне вычисляется как разность между концентрациями белка в исходном материале и в надосадочной жидкости, образовавшейся после осаждения муцина. Концентрация муцина в слюне обследованной группы практически здоровых людей, определенная вышеописанным методом, составила 0,78±0,03 г/л.

Предлагаемый способ количественного определения муцина позволяет провести изучение его содержания в биологических жидкостях - слюне, желудочном соке, содержимом конъюнктивального мешка, бронхиальной слизи. Способ не требует дорогостоящих реактивов, дополнительной работы для построения калибровочного графика, не является трудоемким и позволяет одновременно исследовать большое количество проб.

Изобретение относится к биомедицине, а именно к лабораторной диагностике. Количество муцина в слюне определяют спектрофотометрическим методом по разнице концентрации белка в исходном материале и надосадочной жидкости, образовавшейся после кислотного осаждения муцина. Для этого готовят две опытные пробы, первая содержит слюну и рабочий реагент, вторая - надосадочную жидкость и рабочий реагент; стандартную пробу, содержащую водный раствор альбумина концентрацией 0,25 г/л и рабочий реагент; и контрольную пробу, содержащую дистиллированную воду и рабочий реагент. Рабочий реагент получают смешиванием раствора бромфенолового синего в концентрации 1,2 г/л и буферного раствора (рН 3,0), содержащего 320 ммоль/л лимонной кислоты и 160 ммоль/л натрия фосфата в соотношении 2:23. Содержимое каждой пробы перемешивают, инкубируют 10 минут. Определяют оптическую плотность опытных и стандартной проб против контрольной пробы при длине волны 620 нм. Концентрацию белка в слюне и надосадочной жидкости рассчитывают, г/л: С=(ОП_оп.:ОП_ст.)хО,25, где ОП_оп. - оптическая плотность опытной пробы, ОП_ст. - оптическая плотность стандартной пробы. Способ прост в исполнении, его условия обеспечивают стабильность окрашенного продукта, что позволяет одновременно исследовать большое количество проб.

Способ количественного определения муцина, включающий определение белка в слюне и надосадочной жидкости, образовавшейся после осаждения муцина кислотой, спектрофотометрическим методом, отличающийся тем, что осуществляют забор слюны в объеме 1 мл, готовят две опытные пробы, первая содержит 0,5 мл слюны и 2,5 мл рабочего реагента, вторая - 0,5 мл надосадочной жидкости и 2,5 мл рабочего реагента, стандартную пробу - 0,5 мл водного раствора альбумина концентрацией 0,25 г/л и 2,5 мл рабочего реагента и контрольную пробу - 0,5 мл дистиллированной воды и 2,5 мл рабочего реагента, причем рабочий реагент получают смешиванием раствора бромфенолового синего в концентрации 1,2 г/л и буферного раствора (рН 3,0), содержащего 320 ммоль/л лимонной кислоты и 160 ммоль/л натрия фосфата в соотношении 2:23, содержимое каждой пробы перемешивают, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, определяют оптическую плотность опытных и стандартной проб против контрольной пробы при длине волны 620 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см и рассчитывают концентрацию белка в слюне и надосадочной жидкости (в г/л) по формуле

С=(ОП_оп.:ОП_ст.)х0,25,

где С - концентрация белка в слюне или надосадочной жидкости,

ОП_оп. - оптическая плотность опытной пробы,

ОП_ст. - оптическая плотность стандартной пробы,

0,25 - концентрация белка в растворе альбумина,

а концентрацию муцина вычисляют как разность между концентрациями белка в исходной слюне и в надосадочной жидкости.