Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к биологи ческой химии и медицине и может использоваться для определения активности ферментов крови.

Цель изобретения - разработка способа определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови.

Способ осуществляется следунзпщм образом..

Определение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах.

За меру активности глутатионпероксидазы принимают скорость окисления глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила. Концентрацию глутатиона до и после инкуба- ;Ции в предлагаемой среде с помощью 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кис- jnoTb (ДТНБК) определяют колориметри- ,чески. Количество образующегося продукта - тионитрофенильного аниона

(ТНФА) - прямо пропорционально количеству сульфогидрильных групп глутатиона, прореагировавших с ДТНБК.

Реактивы: трис-НС1 буфер 100 ммоль, рН 8,5, содержащий 4,8 ммоль ЭДТА, 12 ммоль азида натрия и 4,8 ммоль глутатиона (а); гидроперекись третичного бутила 20 ммоль/л (S); три- хпоруксусная кислота (ТХУ) 200 г/л (Ь); ДТНБК на метаноле 10 ммоль/л (г); трис-НС1 буфер 100 ммоль/л, рН 8,0 (|).

I

.В качестве антикоагулянта используют ЭДТА (I мг на 1 мл крови).

Эритроциты промывают холодным изотоническим раствором хпорида натрия (9 г/л) с рН 7,4, центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин и 4°С, гемо- лизируют равным объемом дистиллированной воды и повторным замораживанием и оттаиванием. Гемолизат разво4:vj

СО .

дят водой до концентрации по гемоглобину 1 О г /л,

Ход исследования: 100 мкл гемоли- зата преинкубируют с 830 мкл реактива а 10 мин цри 37°С, добавляют 70 мкл реактива и инкубируют точно 5 мин. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл реактива & ,осажденные белки удаляют центрифугирова- нием, 100 мкл надосадочной жидкости вносят в 9,9 мл реактива и добавляют 100 мкл реактива t , Фотомет рируют при 412 нм, толидана олтичес- кого слоя кюветы 10 мм. Контрольная проба отличается тем, что гемолизат вносят в инкубационную среду непосредственно перед осаждением белков реактивом о ,

.С учетом разведения гемолидата и коэффициента молярной экстинкции ТНФА при 412 нм 11400 рассчитывают активность глутатиохтероксидазы в микромолях израсходованного в реакции субстрата (глутатиона по форму- ле: (ОП оитролй - ОПоп., ) 2147 мкмоль/мин/1 г гемоглобина, где ОП - оптическая плотность.

На фиг.1 показана зависимость активности глутатионпероксидазы (ГП) эритроцитов от концентрации гидро-- перекиси третичного бутила в среде. Из представленных данных следует, что насыщение фермента ГП эритроцитов этим субстратом достигается при концентрации его в среде 1,4 ,

На фиг,2 показана скорость окис- ле1тя гл утатиона в предлагаемой среде в присутствии глутатионпероксидазы донорской крови (эритроцитов ) .Из представленных данных следует, что линейная зависимость между скоростью окисления глутатиона (по разнице оптических плотностей (ОП) контрольной и опытной проб) и временем инкубации в предлагаемой среде сохраняется в пределах не менее б мин.

На фиг 3 показана зависимость мелду активностью ГП эритроцитов и

0

.,

5

0

5

количеством фермента в пробе (относительно количества гемоглобина ге- молизата), измеренная в предлагаемой среде. Из представленных данных следует, что эта линейная зависи- -мость сохраняется в широком диапазоне активности ГП, по меньшей мере до 1000 мкмоль/мин/1г гемоглобина.

Предлагаемый способ специфичен, В таблице суммированы результаты проверки специфичности способа определения активности ГП эритроцитов в присутствии ингибитора ГП (монойод- ацетат), которьй полностью подавляет ферментативную активность (на 98,8± ±0,8 %); обработка гемолизата трансформирующим раствором практически не влияет на результаты анализа: подавление потенциальной ггсевдоперок- сидазной активности гемоглобина трансформацией последнего в цианмет- гемоглобин статистически недостоверно (0,47i 1,01%),

Предлагаемый способ может быть использован при определении активности ГП цельной крови и эритроцитов,

Формула изобретения.

Способ определения -активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови, включаюпдай помещение их в среду инкубации, содержаш;ую 100 ммоль трмс-НС1 рН 8,5, 4 ммоль этиленди- айинтетраацетата натрия, 10,0 ммоль рН 8,5, 4 ммоль этилендиаминтетрааце- тата натрия., 10,0 MMojib азида натрия, 4 ммоль глутатиона, добавление к смеси 1,4 ммоль гидроперекиси третично- го бутила, обработку пробы трихлор- уксусной кислотой, удаление белкового осадка, добавление к надосадочной жидкости 5,5-ди-тиобис(2-нитробензой- .ной) кислоты с последующим спектрофотометр ическим измерением оптической плотности при 412 нм.

rn мкмо/гь/мин IT г zeffozflO t/HO

200- 790.

. 780- 770

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для целей диагностики. Для определения активности глутатионпероксидазы используют среду инкубации, содержащую: трис/гидроксиметил/аминометан/Трис/-HCI буфер 100 ммоль, рН 8,5

этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 4,0 ммоль

азид натрия 10,0 ммоль

глутатион 4,0 ммоль

гидроперекись третичного бутила. При этом колориметрически измеряют скорость окисления глутатиона с помощью 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты при 412 нм. Способ позволяет определять активность глутатионпероксидазы цельной крови, эритроцитов и тромбоцитов. 1 табл., 3 ил.

0,7 г 2,т г.8

Гидролерен(/а /ггре/т -ot//7 i//7a, мполь Фиг.

f/Hf(yffoi4 пин

/77///ya/7A/w-y//2 ze/io /iofft/Ma 7OOO

800 600 00 WO

5 Л7- 7ПО- 7. г,5 0- Ге огло щг/м/

фиг.з