СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/10 C07H21/02 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки рибонуклеиновых кислот (РНК) с помощью силикатных сорбентов из биологических жидкостей и иных образцов. Выделение РНК предложенным способом может быть использовано для молекулярно-биологических исследований, таких как определение концентрации, состава, RT-PCR, структурных исследований, исследований рибозимов и т.д.

Получение высокоочищенных и интактных РНК является важной проблемой в молекулярной биологии.

Наиболее распространенным способом выделения РНК является способ обработки фенолом с последующим осаждением выделенного целевого продукта спиртом [1]. Способ включает следующие стадии: к клеткам, ресуспендированным в 0,5% SDS, добавляют 1/10 объема 2 М CH₃COONa, pH 4,2 и 2 объема фенола и инкубируют при интенсивном перемешивании в течение 5 мин при 4°С. РНК, содержащуюся в водной фазе, отделяют от органической фазы центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин при 4°С. К отобранной водной фазе добавляют равный объем фенол:хлороформ в соотношении 49:1, инкубируют при интенсивном перемешивании в течении 30 сек и отделяют водную фазу центрифугированием, как описано ранее. К отобранной водной фазе добавляют равный объем хлороформа, инкубируют при интенсивном перемешивании в течение 30 сек, водную фазу отделяют центрифугированием, как описано ранее. К раствору РНК добавляют 1/10 объема 3 М CH₃COONa, pH 5,2 и 4 объема этилового спирта и инкубируют в течение 3 ч или ночи при -20°С, затем центрифугируют образец при 10000 g в течение 20 мин при 4°С. Супернатант удаляют, преципитат РНК высушивают и растворяют в воде.

Недостатками данного способа являются длительность выделения РНК (не менее 3,5 ч в связи с переосаждением целевого продукта), неудобство работы с фенолом и хлороформом, а также низкий выход низкомолекулярного продукта (25%).

Известен способ выделения РНК, включающий адсорбцию РНК на стекловолоконных фильтрах GF/F в среде хаотропного агента, отделение сорбента и связанной с ним РНК, элюцию РНК и очистку целевого продукта [2]. Способ включает следующие стадии: к 300 мкл образца добавляют 100 мкл 4 М тиоцианата гуанидина (GuSCN), инкубируют при 70°С в течение 2-3 мин, переносят на фильтр GF/F, центрифугируют 5-10 с, промывают центрифугированием 2 раза 1 М GuSCN (по 400 мкл), 2 раза 80%-ным изопропанолом, высушивают фильтры при 37°С в течение 10 мин, РНК элюируют 50 мкл воды.

Недостатками данного способа являются низкий выход целевого продукта и невозможность выделения низкомолекулярных фракций РНК.

Известен способ выделения РНК, основывающийся на смешивании гомогенизованного в растворе 4 М GuSCN образца, с водонасыщенным фенолом с формированием монофазного раствора [3]. После добавления хлороформа происходит разделение фаз: РНК находится в водной фазе, тогда как ДНК и белки ассоциированы с интерфазой и органической фазой. Способ включает следующие стадии: лизирование выращенных клеток при помощи денатурирующего раствора (4 М GuSCN, 25 мМ цитрат натрия, рН 7,0, 0,5% саркосил, 0.1 М 2-меркаптоэтонол) из расчета 1 мл денатурирующего раствора на 10⁷ клеток. Клеточный лизат переносят в пробирку, добавляют 0,1 мл 2 М CH₃COONa, рН 4, 1 мл водонасыщенного фенола, 0,2 мл хлороформ:изоамилового спирта в соотношении 49:1. Суспензию тщательно перемешивают в течение 10-20 сек и инкубируют в течение 15 мин при 0-4°С. Отделяют водную фазу, содержащую РНК, от органической фазы центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин при 4°С. Водную фазу переносят в новую пробирку, добавляют равный объем изопропанола, инкубируют смесь в течение 30 мин при -20°С, а затем центрифугируют образец при 10000 g в течение 20 мин при 4°С. К осадку добавляют 0,3-0,5 мл денатурирующего раствора и переосаждают РНК как описано ранее. Осадок РНК промывают 75%-ным этанолом и центрифугируют образец при 10000 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант удаляют, РНК высушивают под вакуумом в течение 5 мин и растворяют в воде.

Недостатками данного способа является длительность выделения РНК (около 3 ч.), многостадийность процесса, неудобство работы с фенолом и хлороформом, а также низкий выход низкомолекулярного продукта (7%).

Наиболее близким к заявленному способу - прототипом, является способ выделения РНК из клинических образцов с использованием мелкодисперсного (МС) мишированного (стандартизованного по размеру) стекла (ММС) [4]. Данным способом возможно разделение дц- и оц-нуклеиновых кислот (НК). Способ заключается в том, что сначала из образца адсорбируют на ММС дц-НК и отделяют супернатант, содержащий оц-НК. Для этого к 50 мкл образца добавляют 40 мкл ММС и 900 мкл буфера, содержащего 120 г GuSCN в 100 мл 0,2 М ЭДТА (рН 8,0). Адсорбируют дц-НК в течение 10 мин, затем отделяют силикатный сорбент центрифугированием (2 мин при 12000g), промывают силикатный сорбент дважды буфером для адсорбции, дважды 70% этанолом и один раз ацетоном. Силикатный сорбент высушивают в течение 10 мин при 56°С, а затем элюируют дц-НК инкубацией с буфером, содержащим 10 мМ трис-НСl, 10 мМ ЭДТА (рН 8,0) (ТЕ-буфер) при нагревании до 56°С в течение 10 мин. К отделенному от ММС супернатанту, содержащему оц-НК, добавляют ММС и буфер для адсорбции оц-НК, содержащий 120 г тиоцианата гуанидина (GuSCN) в 100 мл 0,35 М трис-HCl, рН 6,4, 22 мл 0,2 М ЭДТА (рН 8,0), 9,1 г тритона Х-100 и 11 г MgCl₂·6H₂O. Адсорбируют оц-НК в течение 10 мин, затем отделяют силикатный сорбент центрифугированием, промывают и элюируют оц-НК как описано ранее.

Недостатками прототипа являются многостадийность и низкий выход целевого продукта. Данный способ позволяет выделить только высокомолекулярные НК, при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% НК в связи с тем, что 50-60% адсорбированной НК необратимо связывается с ММС. Существенным недостатком данного способа является наличие значительных количеств оц- и дц-ДНК в препаратах оц- и дц-РНК соответственно. Для удаления посторонних ДНК проводят дополнительную обработку образцов ДНК-азой, не содержащей РНК-азы, что увеличивает время выделения целевого продукта.

Технической задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, выделение широкого спектра РНК различного размера (от 100 н. до высокомолекулярных фракций) и уменьшение длительности процесса.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в инкубировании биологического образца с заранее обработанным силикатным сорбентом в растворе хаотропного агента, отмывке силикатного сорбента от биополимеров ненуклеотидной природы и последующей элюции РНК раствором, содержащим ионы бикарбоната и ЭДТА. Супернатант представляет собой раствор очищенной РНК, пригодной для молекулярно-биологических исследований без дополнительных стадий очистки и концентрирования.

Способ включает следующую последовательность стадий:

1) предварительная обработка ММС 3,5-7% плавиковой кислотой (HF) в течение 2-6 ч с последующей отмывкой частиц стекла и высушиванием обработанного ММС (ОММС);

2) выделение РНК из биологических жидкостей путем связывания РНК с ОММС в среде, содержащей хаотропный агент (1 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 6,5);

3) отделение ОММС и связанной с ним РНК путем центрифугирования при 1000 g в течение 10 сек;

4) промывание ОММС и связанной с ним РНК дважды буферным раствором, содержащим 1 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетат, рН 6,5, и дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0;

5) элюцию РНК с ОММС буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната (НСО-3

Время выделения РНК данным способом составляет не более 20 минут. Способ обеспечивает выделение РНК длиной от 100 н. до высокомолекулярных фракций из биологических образцов с высокой эффективностью и не зависит от концентрации РНК в образце. Способ обеспечивает эффективную элюцию РНК, адсорбированной на обработанное мелкодисперсное мишированное стекло (ОММС).

В табл. 1 представлены данные по элюции Р³²-радиоактивно-меченой РНК (длиной 100 н.) различными элюентами. Из табл. 1 видно, что использование для элюции ТЕ-буфера (прототип) не позволяет количественно элюировать РНК с поверхности силикатного сорбента. Использование же буферного раствора, содержащего ионы бикарбоната и ЭДТА, обеспечивает практически количественную элюцию РНК вне зависимости от количества адсорбированной РНК.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1) В качестве силикатного сорбента используют ММС, обработанное 3,5-7% раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 часов. Такая обработка позволяет унифицировать размер частиц стекла, увеличить рабочую поверхность и сорбционную емкость последнего. На фиг.1 (А, Б) изображена электронная микрофотография (×5000) мишированного (А) и мишированного стекла, обработанного 3,5-7% раствором плавиковой кислоты (Б). На фотографии видно, что обработка стекла плавиковой кислотой приводит к травлению микротрещин, разрушению стеклянных частиц и получению порошка, содержащего более мелкие и гомогенные по размеру частицы стекла с более однородной структурой поверхности и обладающего повышенной площадью поверхности. В результате облегчается разделение раствора РНК от силикатного сорбента за счет формирования однородного осадка стеклянных частиц, ускоряется и упрощается процедура выделения РНК. ОММС связывает как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты РНК. На фиг.2 изображен электрофорез РНК, выделенной различными способами: А) при помощи обработки фенолом, Б) при помощи гуанидинфенольной экстракции, В) заявляемым способом. РНК выделяли из клеток линии А431. На первой дорожке нанесена РНК, выделенная из цельных клеток, на второй дорожке нанесена РНК, выделенная из мембранно-цитозольной клеточной фракции. Из фиг.2 видно, что заявляемый способ является менее повреждающим по сравнению со способом, основывающимся на гуанидинфенольной экстракции, а также позволяет выделять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты РНК.

2) Сорбцию РНК из биологических жидкостей путем связывания с ОММС осуществляют в буферном растворе, содержащем 1 M GuSCN, 1,3 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 6,5, что позволяет повысить выход целевого продукта, уменьшить длительность процесса, а также выделять РНК различного размера (от 100 н. до высокомолекулярных фракций).

3). Элюцию связанных с силикатным сорбентом РНК осуществляют обработкой ОММС буферными растворами, содержащими 5-50 мМ ионов бикарбоната, 5-10 мМ ЭДТА, рН 8,0-10,0, что позволяет быстро и практически количественно отделять от силикатного сорбента РНК. В табл. 2 представлены данные по выделению РНК из клеток линии А 431 при помощи обработки фенолом [1], при помощи гуанидинфенольной экстракции [3], а также по выделению РНК на силикатном сорбенте предложенным способом. Из таблицы 2 видно, что заявляемый способ обеспечивает практически количественное выделение РНК из биологических жидкостей за существенно меньшее время.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Для адсорбции РНК проводят предварительную обработку ММС плавиковой кислотой. Для этого ММС инкубируют с 3,5% HF на качалке в течение 6 ч, обработанное стекло сушат при 200°С в течение 1 ч, а затем охлажденное до комнатной температуры стекло суспендируют в воде. Для выделения РНК были использованы клетки человеческой эпидермальной карциномы А431. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Для диссоциации выращенных клеток использовали 0,25% раствор трипсина. После нейтрализации трипсина клетки переносили в пробирки и осаждали центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин. Осажденные клетки ресуспендировали в 20 мкл физиологического раствора и добавляли 60 мкл лизис-буфера, содержащего 0,6% Nonidet P40, 50 мМ трис-HCl, 0,15 М NaCl, 5 мМ NaF, 1 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na₃MoO₄. Клетки инкубировали 15 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об/мин (центрифуга Eppendorf 5410) для разделения мембранно-цитозольной и ядерной фракции. Супернатант, содержащий мембранно-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки, доводили объем водой до 120 мкл и затем добавляли 180 мкл буфера, содержащего 6,75 М GuSCN, 2 мМ ДЭПК, 30 мМ ЭДТА, 15 мМ трис-ацетат рН 6,5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 1 мин, затем добавляли 900 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-ацетат рН 6,5, 1,3 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, перемешивали и затем добавляли 32 мг ОММС (из расчета 1 мг ОММС на 1 мкг РНК, содержащейся в 1·10⁶ клеток). После 5 мин инкубации на качалке образцы центрифугировали 10 сек при 1000g.

Супернатант удаляли, силикатный сорбент промывали дважды буферным раствором, содержащим 1 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетат рН 6.5, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 8,0). Элюировали РНК с силикатного сорбента 5 мМ буферным раствором ЭДТА, рН 10,0, содержащим 50 мМ NaHCO₃, в течение 5 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирали супернатант, содержащий РНК, раствор нейтрализовали 1/10 объема 100 мМ трис-НСl до рН 7,1. Этап элюции повторяли дважды, затем элюаты объединяли.

Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически. В результате из 1×10⁶ клеток линии А 431 было выделено 32 мкг РНК. Время выделения РНК из образцов составило 20 мин.

Пример 2

Для адсорбции РНК проводят предварительную обработку ММС плавиковой кислотой. Для этого ММС инкубируют с 7% HF на качалке в течение 2 ч, обработанное стекло сушат при 200°С в течение 1 ч, а затем охлажденное до комнатной температуры стекло суспендируют в воде. Обработку клеток линии А-431 для получения мембранно-цитозольной фракции осуществляли аналогично примеру 1. Далее супернатант, содержащий мембранно-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки, доводили объем водой до 120 мкл и затем добавляли 180 мкл буфера, содержащего 6,75 М GuSCN, 2 мМ ДЭПК, 30 мМ ЭДТА, 15 мМ трис-ацетат рН 6,5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 1 мин, затем добавляли 900 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-ацетат, рН 6,5, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК перемешивали и затем добавляли 32 мг ОММС (из расчета 32 мг ОММС на 1·10⁶ клеток). После 5 мин инкубации на качалке образцы центрифугировали 10 сек при 1000 g. Супернатант удаляли, силикатный сорбент промывали дважды буферным раствором, содержащим 1 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетат, рН 6,5, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 8,0). Элюировали РНК с силикатного сорбента 10 мМ буферным раствором ЭДТА, рН 8,0, содержащим 10 мМ NaHCO₃, в течение 5 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирали супернатант, содержащий РНК, раствор нейтрализовали 1/10 объема 100 мМ трис-НСl до рН 7,1. Этап элюции повторяли дважды, затем элюаты объединили.

Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически. В результате из 1×10⁶ клеток линии А 431 было выделено 32 мкг РНК. Время выделения РНК из образцов составило 20 мин.

Пример 3

К 0,5 мл плазмы крови человека добавляли 0,75 мл буферного раствора, содержащего 6,75 М GuSCN, 2 мМ ДЭПК, 30 мМ ЭДТА, 15 мМ трис-ацетат рН 6,5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 1 мин, затем добавляли 3 объема буфера, содержащего 1,3 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 6,5, перемешивали и затем добавляли 3 мг ОММС. Процедуру выделения РНК проводили аналогично примерам 1 и 2. Содержание РНК в пробе определяли при помощи измерения флуоресценции образцов в комплексе с SYBR Green II. Флуоресценцию комплексов РНК с SYBR Green измеряли на флуориметре Bio-Rad при длине волны возбуждения 490 нм и испускания 520 нм [5].

Для построения калибровочных кривых был использован стандартный раствор РНК, выделенной из клеток А 431 в концентрациях 10, 25, 50, 100, 200, 400 нг/мл. Предлагаемым способом была выделена РНК из образцов плазмы крови от трех человек. Концентрация РНК составила 11, 20 и 76 нг/мл плазмы. Время выделения РНК из образцов данным способом составляет не более 20 мин.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом:

- уменьшить расход мелкодисперсного стекла;

- увеличить эффективность выделения РНК в 1,5-2 раза за счет практически количественной элюции адсорбированной на силикатном сорбенте РНК;

- обеспечить выделение как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фрагментов РНК;

- использовать предложенный способ для количественного определения концентрации РНК в биологических жидкостях;

- уменьшить количество биологического материала, используемого для выделения РНК с целью последующей амплификации или иного исследования;

- сократить длительность процедуры выделения РНК до 20 мин.

Источники информации

1. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995, р. 4-6-4-7.

2. Грибанов О., Щербаков А., Перевозчикова Н., Гусев А. Использование аэросила и фильтров GF/F для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК//Биохимия 1996, т.61, с.10.

3. Chomezynski P., Mackey К. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction//Organelles and cellular structures. 1996, v.10, р.221-224.

4. Beld M., Sol C. Goudsmit Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms//Nucl. Acids Res, 1996, v. 24, р.2618-2619.

5. Schmidt D., Ernst J. A fluorometric assay for the quantification of RNA in solution with nanogram sensitivity//Analitical Biochemistry, 1995, v. 232, р.144-146.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов выделения рибонуклеиновых кислот (РНК) и может быть использовано для молекулярно-биологических исследований. Способ заключается в инкубировании биологического образца с предварительно обработанным 3,5-7% раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 часов мелкодисперсным мишированным стеклом в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, отделении сорбента и связанной с ним РНК центрифугированием, промывании сорбента и элюции РНК с сорбента буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната (НСО₃) и 5-10 мМ ЭДТА при рН 8,0-10,0. Способ позволяет сократить длительность процесса, повысить выход РНК и обеспечить выделение как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фракций РНК. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

1. Способ выделения рибонуклеиновых кислот, включающий адсорбцию рибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение сорбента, промывку последнего и элюцию целевого продукта с сорбента, отличающийся тем, что сорбент предварительно обрабатывают 3,5-7,0%-ным раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 ч, сорбцию рибонуклеиновых кислот на обработанный сорбент осуществляют в буферном растворе, содержащем 1М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетат, рН 6,5, а элюцию целевого продукта с сорбента проводят буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната и 5-10 мМ ЭДТА при рН 8,0-10,0.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве силикатного сорбента используют мелкодисперсное мишированное стекло.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывку сорбента проводят дважды буферным раствором для сорбции рибонуклеиновых кислот, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.