СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2004 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) с помощью силикатных сорбентов из биологических жидкостей и иных образцов. Выделение ДНК предложенным способом может быть использовано для молекулярно-биологических исследований, таких как определение концентрации, состава, рестрикционного анализа, ПЦР-анализа ДНК, а также в практической медицине (диагностика наследственных заболеваний человека, судебная медицина, генная дактилоскопия).

Получение высокоочищенных ДНК является важной проблемой в молекулярной биологии. Для получения ДНК из биологических жидкостей используют такие методы, как центрифугирование в градиенте CsCl₂, гель-фильтрацию, обработку фенолом и осаждение спиртом. Эти методы отличаются длительностью, многостадийностью и трудоемкостью.

Известен способ выделения ДНК из клинических образцов с использованием мелкодисперсного (МС) мешированного (стандартизованного по размеру) стекла (ММС) [Beld M., Sol С., Goudsmit Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. //Nucl. Acids Res. 1996. v. 24. p. 2618-2619]. Способ заключается в том, что ДНК адсорбируют из буферного раствора, содержащего 4 М тиоцианат гуанидина (GuSCN), 0,1 М ЭДТА (рН 8,0) в течение 10 мин, затем отделяют силикатный сорбент центрифугированием (30 с при 1000 g), промывают силикатный сорбент дважды буфером для адсорбции, дважды 70% этанолом и один раз ацетоном. Силикатный сорбент сушат в течение 10 мин при 56°С, а затем элюируют ДНК инкубацией с буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, 10мМ ЭДТА (рН 8.0) (ТЕ-буфер) при нагревании до 56°С в течение 10 мин.

Недостатками данного способа является длительность выделения ДНК (30-40 мин), низкая сорбционная емкость силикатного сорбента (на 1 мг ММС адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделить ДНК длиной более 40 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% ДНК в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с ММС. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40 т.п.н. составляет от 40 до 50%.

Известен способ выделения ДНК из биологических жидкостей, в котором используют силикатный сорбент, обработанный азотной кислотой [Short protocols in molecular biology, Wiley, 1995]. Для этого МС обрабатывают в течение часа концентрированной HNO₃, затем отмывают водой. Адсорбцию ДНК на данное стекло и элюцию с силикатного сорбента осуществляют в условиях описанного аналога 1.

Недостатками данного способа является длительность выделения ДНК (30-40 мин), низкая сорбционная емкость силикатного сорбента (на 1 мг МС адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделить ДНК длиной более 40 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с МС. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40 т.п.н. составляет от 40 до 50%.

Известен способ выделения ДНК, включающий адсорбцию ДНК на аэросиле (А-300) в среде хаотропного агента, отделение сорбента и связанной с ним ДНК, элюцию ДНК с аэросила и очистку целевого продукта. При этом аэросил вносят в раствор, содержащий ДНК до конечной концентрации 0,3-0,6%, для выделения однонитевой ДНК и РНК, используют среду с содержанием 0,5-2 М GuSCN, а для выделения двунитевой ДНК используют среду с содержанием 4 М GuSCN [Патент РФ №2119954, кл. С 12 N 15/10, С 07 Н 21/04, опубл. 10.10.98].

Недостатками данного способа являются его длительность и трудоемкость.

Наиболее близким к заявленному способу - прототипом является способ выделения ДНК из форменных элементов крови [Boom R. et al. "Rapid and simple method for purification nucleic acids". J.Clin. Microbiol. 1990, v.28, p.495-503]. Для адсорбции ДНК используют ММС. Способ включает следующие стадии: ДНК адсорбируют из буферного раствора, содержащего 5,4 М GuSCN, 105 мМ ЭДТА, 53 мМ трис-НСl (рН 7,3), 1,12% тритон Х-100 в течение 10 мин. Затем силикатный сорбент осаждают центрифугированием (15 с при 12000g), промывают дважды буфером, содержащим 5,4 М GuSCN, 53 мМ трис-НСl, рН 6,4, и затем один раз этанолом. Силикатный сорбент сушат в течение 10 мин при 56°С, а затем элюируют адсорбированную ДНК инкубацией с ТЕ-буфером в течение 10 мин при нагревании до 56°С.

Недостатками данного способа является недостаточный выход целевого продукта из-за низкой сорбционной емкости силикатного сорбента (на 1 мг ММС адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделить ДНК длиной более 50 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с ММС. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 50 т.п.н. составляет от 48±4%, причем ДНК с низкой молекулярной массой выделяется значительно менее эффективно.

Технической задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет более эффективной адсорбции ДНК, повышение функциональных возможностей способа за счет обеспечения возможности выделения широкого спектра ДНК длиной от 50 п.н. до высокомолекулярных фракций и уменьшение длительности процесса.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в инкубировании биологического образца с заранее обработанным силикатным сорбентом в растворе хаотропного агента, отмывке силикатного сорбента от биополимеров ненуклеотидной природы и последующей элюции ДНК раствором, содержащим ионы бикарбоната. Супернатант представляет собой раствор очищенной ДНК, пригодной для молекулярно-биологических исследований без дополнительных стадий очистки и концентрирования.

Время выделения ДНК данным способом составляет 8-10 минут. Способ обеспечивает выделение ДНК длиной от 50 п.н. до высокомолекулярных фракции из биологических образцов с высокой эффективностью и не зависит от концентрации ДНК в образце. Способ обеспечивает количественную элюцию ДНК, адсорбированной на обработанное мелкодисперсное мишированное стекло (ОММС).

Способ включает следующую последовательность стадий:

1) предварительная обработка ММС 3,5-7% плавиковой кислотой (HF) в течение 2-6 ч с последующей отмывкой частиц стекла и высушиванием обработанного ММС (ОММС);

2) выделение ДНК из биологических жидкостей путем связывания ДНК с ОММС в среде, содержащей хаотропный агент (9 М GuSCN, 40 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,4);

3) отделение ОММС и связанной с ним ДНК путем центрифугирования при 1000g в течение 10 сек;

4) промывание ОММС и связанной с ним ДНК дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,4, и дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ Nad, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0;

5) элюцию ДНК с ОММС буферными растворами, содержащими 5-50 мМ ионов бикарбоната (НСО₃), рН 8,0-10,0.

Использование изобретения позволяет повысить выход ДНК (с 0,5 до 2,5 мкг дц-ДНК на 1 мг силикатного сорбента), выделяемой при помощи силикатных сорбентов из биологических проб, обеспечивая количественное выделение ДНК, что позволяет уменьшить количество биологического материала, используемого для выделения ДНК с целью последующей амплификации или иного исследования. В табл. 1 представлены данные по элюции Р³²-радиоактивно-меченой ДНК (длиной от 1000 до 100 п.н.) различными элюентами. Из табл. 1 видно, что использование для элюции ТЕ-буфера не позволяет количественно элюировать ДНК с поверхности силикатного сорбента. Использование же ионов бикарбоната обеспечивает количественную элюцию ДНК любой длины вне зависимости от количества адсорбированной ДНК.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1) В качестве силикатного сорбента используют ММС, обработанное 3,5-7% раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 часов, промывку сорбента проводят сначала дважды буферным раствором, содержащим хаотропный агент, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола. Такая обработка позволяет унифицировать размер частиц стекла, увеличить рабочую поверхность и сорбционную емкость последнего. На фиг.1 (А, Б) изображена электронная микрофотография (×5000) мешированного (А) и мешированного стекла, обработанного 3,5-7% раствором плавиковой кислоты (Б). На фотографии видно, что обработка стекла плавиковой кислотой приводит к травлению микротрещин, разрушению стеклянных частиц и получению порошка, содержащего более мелкие и гомогенные по размеру частицы стекла с более однородной структурой поверхности и обладающего повышенной площадью поверхности. Такой силикатный сорбент обладает более высокой емкостью. В табл. 2 представлено влияние условий обработки стекла на связывание 2,5 мкг Р³²-радиоактивно-меченой ДНК с мелкодисперсным стеклом. В зависимости от условий сорбции емкость ОММС в 1,5-2 раза выше, чем необработанного. Кроме того, облегчается разделение раствора ДНК от силикатного сорбента за счет формирования однородного осадка стеклянных частиц, ускоряется и упрощается процедура выделения ДНК. ОММС связывает как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты ДНК. На фиг.2 изображен электрофорез фрагментированной ДНК в 2% агарозном геле, содержащем 0,0003% бромистого этидия. ДНК гидролизована ДНК-азой 1 в присутствии ионов Мn⁺⁺. На первой дорожке нанесен маркер длины на основе фага M15 (от 100 до 1000 п.н.) (Сибэнзим, Новосибирск), на второй дорожке - исходная высокомолекулярная ДНК из тимуса теленка, на третьей дорожке - фрагментированная ДНК из тимуса теленка, извлеченная из раствора адсорбцией заявляемым способом. На фиг.2 видно, что предложенный способ позволяет выделять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты ДНК.

2) Элюцию связанных с силикатным сорбентом ДНК осуществляют обработкой ОММС буферными растворами, содержащими 5-50 мМ ионов бикарбоната, рН 8,0-10,0, что позволяет быстро и количественно отделять от силикатного сорбента ДНК. В табл. 3 представлены данные по извлечению Р³²-радиоактивно-меченой ДНК (длиной от 1000 до 100 п.н.), внесенной в плазму крови человека предложенным способом. Из табл. 3 видно, что заявляемый способ выделения ДНК обеспечивает количественное выделение ДНК из биологических жидкостей.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Для адсорбции ДНК проводят предварительную обработку стекла плавиковой кислотой. Для этого ММС инкубируют с 3,5% HF на качалке в течение 4 ч, обработанное стекло сушат при 200°С в течение 1 ч, а затем охлажденное до комнатной температуры стекло суспендируют в воде. Для выделения клеточной ДНК клетки обрабатывают стандартным 0.25%-ным раствором трипсина. В чашку Петри с отмытыми физиологическим раствором клетками добавляют 0,5 мл физиологического раствора и равный объем смеси, содержащей 4 мг ОММС в буферном растворе, содержащем 9 М GuSCN, 40 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-НСl, рН 6,4. После 5 мин инкубации на качалке образцы центрифугируют 10 с при 1000g. Супернатант удаляют, силикатный сорбент промывают дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-НСl, рН 6,4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 8,0). Элюируют ДНК с силикатного сорбента 50 мМ NaHCO₃ при рН 10,0 в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000g в течение 1 мин собирают супернатант, содержащий ДНК, рН раствора нейтрализуют половиной объема 40 мМ трис-НСl (рН 7,1).

Для оценки полноты выделения ДНК заявляемым способом были проведены сравнительные эксперименты по выделению ДНК путем ее осаждения трихлоруксусной кислотой и адсорбцией водонерастворимой фракции на нейлоновых фильтрах. Для этого клетки человеческой эпидермальной карциномы А431 выращивали на среде с Н³-тимидином. Н³-меченую ДНК выделяли из одинакового количества (10⁶) клеток предлагаемым способом адсорбции на ОММС и стандартным способом адсорбции ДНК на нейлоновых фильтрах. Для выделения ДНК на фильтре аликвоту клеток (10⁶) переносили на 0,2 мкм нейлоновый фильтр, промывали 0,15 М NaCl и фиксировали 5% трихлоруксусной кислотой. Радиоактивность ДНК, выделенной различными способами, измеряли на β-сцинтиляционном счетчике RacBeta 1211. Было установлено, что радиоактивность ³H-меченой ДНК, выделенной различными способами, была одинаковой. Таким образом, было показано, что предлагаемый способ обеспечивает количественное выделение ДНК. Содержание ДНК в пробе определяли при помощи измерения флуоресценции образцов в комплексе с Hoechst 32258. Флуоресценцию комплексов ДНК с Hoechst 32258 измеряли на флуориметре Hitachi MPF4 при длине волны возбуждения 350-360 нм и испускания 480-495 нм [Labarca С., Paigen К. A simple, rapid and sensitive DNA assay procedure. //Anal. Biochem. 1980, v. 102, p. 344-352]. Для построения калибровочных кривых был использован стандартный раствор фрагментированной ДНК из тимуса теленка в концентрациях 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 нг/мл. Данным способом из 2×10⁶ клеток линии А 431 было выделено 10 мкг ДНК. Время выделения ДНК из образцов данным способом составляет 8-10 мин. Емкость стекла по связыванию ДНК составляет до 2,5 мкг ДНК на 1 мг ОММС.

Пример 2

Для адсорбции ДНК проводят предварительную обработку стекла плавиковой кислотой. Для этого ММС инкубируют с 7% HF на качалке в течение 2 ч, обработанное стекло сушат при 200°С в течение 1 ч, а затем охлажденное до комнатной температуры стекло суспендируют в воде. Для выделения клеточной ДНК клетки обрабатывают стандартным 0,25%-ным раствором трипсина. В чашку Петри с отмытыми физиологическим раствором клетками добавляют 0,5 мл физиологического раствора и равный объем смеси, содержащей 4 мг ОММС в буферном растворе, содержащем 9М GuSCN, 40 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,4. После 5 мин инкубации на качалке, образцы центрифугируют 10 с при 1000g. Супернатант удаляют, стекло промывают дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мM NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Элюируют ДНК с силикатного сорбента 5 мМ NaHCO₃ при рН 8,0 в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000g 1 мин собирают супернатант, содержащий ДНК, рН раствора нейтрализуют половиной объема 40 мМ трис-HCl (рН 7,1).

Время выделения ДНК из образцов данным способом составляет 8-10 мин. Емкость стекла по связыванию ДНК составляет до 2,5 мкг ДНК на 1 мг ОММС.

Пример 3

К 0,5 мл плазмы крови человека добавляют равный объем смеси, содержащей 3 мг ОММС, полученного аналогично примеру 1 в буферном растворе, содержащем: 9 М GuSCN, 40 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,4. Процедуру выделения и определения концентрации ДНК при помощи флуоресценции комплексов ДНК с Hoechst 32258 проводили аналогично примерам 1 и 2. Концентрация ДНК в плазме крови здоровых доноров составила 20 нг/мл плазмы.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом:

- уменьшить расход мелкодисперсного стекла;

- увеличить эффективность выделения ДНК в 1,5-2 раза за счет количественной элюции адсорбированной на силикатном сорбенте ДНК;

- повысить функциональные возможности способа за счет обеспечения возможности выделения как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фрагментов ДНК;

- увеличить чувствительность ПЦР-диагностических систем за счет связывания низкомолекулярных фрагментов ДНК;

- использовать предложенный метод для количественного определения концентрации ДНК в биологических жидкостях;

- уменьшить количество биологического материала, используемого для выделения ДНК с целью последующей амплификации или иного исследования;

уменьшить время процедуры выделения до 8-10 мин.

Изобретение относится к способу выделения дезоксирибонуклеиновых кислот, включающему адсорбцию дезоксирибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение и промывку сорбента с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента. В качестве сорбента используют мелкодисперсное мешированное стекло, обработанное 3,5-7,0% раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 часов. Промывку сорбента проводят сначала дважды буферным раствором, содержащим хаотропный агент, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола. Элюцию осуществляют буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната при рН 8,0-10,0. Способ позволяет упростить процедуру и сократить длительность выделения ДНК, повысить выход целевого продукта, а также обеспечивает выделение как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фракций ДНК. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот, включающий адсорбцию дезоксирибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение и промывку сорбента с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют мелкодисперсное мешированное стекло, обработанное 3,5-7,0%-ным раствором плавиковой кислоты в течение 2-6 ч, промывку сорбента проводят сначала дважды буферным раствором, содержащим хаотропный агент, а затем дважды буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, элюцию осуществляют буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната при рН 8,0-10,0.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что адсорбцию нуклеиновых кислот на обработанном сорбенте проводят в буферном растворе, содержащем 9 М GuSCN, 40 мМ ЭДТА, 10 мМ трис- HCl, рН 6,4 в течение 3 мин.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первую промывку сорбента проводят буферным раствором, содержащим 4,5 М GuSCN, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,4, а вторую промывку сорбента осуществляют буферным раствором, содержащим 25% изопропанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.