СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/765 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и может быть использовано в качестве средства, обладающего гепатопротекторным действием при лечении нарушений функций печени живого организма.

Известны гепатопротекторы: эссенциале, липоевая кислота, сирепар, α -токоферол. Однако эти средства не могут полностью защитить или восстановить нарушенные функции мембран, митохондрий и других структур гепатоцитов, поскольку любой из них влияет лишь на отдельные звенья патогенеза гепатитов (Гайдамака О.В., Литвинова О.В. Гепатопротекторнi препарати: сучасний стан i перспектива ix створення, Фармацевтичний журнал. - 1998, Киев, № 6, стр. 42-46). В связи с этим современные гепатопротекторы используются в комплексной терапии. Однако такой подход к лечению гепатитов опасен взаимодействием препаратов вследствие полипрагмазии и осложнением течения заболевания. Одновременно практически все препараты данной группы имеют побочные эффекты, которые ограничивают их применение (Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. - М.: Универсум паблишинт, 1997, - 532 с.).

Известны также препараты, обладающие гепатопротекторным действием, в которых активным агентом является группа флавоноидных соединений - Silimarin, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Sylybum marianum L). На основе этих соединений разработан ряд лекарственных препаратов "силимарин", "силибор", "силибинин", "карсил" и др. Все эти препараты зарубежного производства, поэтому очевидна актуальность и необходимость поиска и изучения новых природных источников сырья.

Известен препарат легалон, содержащий в своем составе в качестве активного агента группу флавоноидов из экстракта плодов расторопши пятнистой. Легалон обладает гепатопротекторным и антитоксическим действием. Механизм действия связан с ингибированием перекисного окисления липидов, вследствие чего предотвращается разрушение клеточных мембран. В поврежденных гепатоцитах препарат стимулирует синтез белков и фосфолипидов, в результате чего происходит стабилизация клеточных мембран, предотвращается потеря компонентов клетки, например трансаминаз. Препарат препятствует проникновению в клетку некоторых гепатотоксических веществ (Лекарственные препараты зарубежных фирм в России. - М.: Астрафармсервис, 1993, с.350).

К недостаткам известного средства можно отнести невысокую биологическую активность препарата и наличие побочных эффектов.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в создании нового гепатопротекторного средства растительного происхождения с более высокой биологической активностью и не имеющего побочных эффектов.

Поставленная задача решена тем, что в качестве гепатопротектора применяют полипренолы (Ропрен), получаемые из древесной зелени хвойных пород, общей формулы

где n=10-20,

Полипренолы представляют собой природную смесь олигомеров (изопренолов) вышеуказанной общей формулы, содержащие структурные соединения, например, формулы

где n=8-16.

Смесь полипренолов ведет себя как одно вещество, может быть разделено на обращеннофазных сорбентах на индивидуальные изопренологи и представляет собой маслянистую маловязкую жидкость желто-оранжевого цвета, хорошо растворимую в растительных маслах.

Предлагаемые в качестве гепатопротектора полипренолы формулы получают путем переработки растительного сырья, состоящего из древесной зелени хвойных и лиственных пород. Способ основан на экстракции ее органическим растворителем, последующем выделении отстаиванием при охлаждении и фильтрованием восков, отделении свободных кислот от полученного раствора экстрактивных веществ в углеводородном растворителе раствором щелочи, разделении полученного нейтрализованного раствора на раствор нейтральных веществ в углеводородном растворителе и водно-щелочной раствор солей органических кислот, подкислении водно-щелочного раствора солей неорганической или органической кислотой, выделении отстаиванием из него хлорофиллиновых кислот и фракции жирных и смоляных кислот и последующем разделении суммы дитерпеновых и высших жирных кислот, отгонке растворителя от нейтральных веществ и разделении нейтральных веществ. Способ отличается тем, что сумму дитерпеновых и высших жирных кислот обрабатывают в низкомолекулярном спирте с добавкой в качестве катализатора серной кислоты, отгоняют спирт и нейтрализуют неорганическим основанием дитерпеновые кислоты и катализатор, проводят экстракцию эфиров высших жирных кислот углеводородным экстрагентом, подкисляют водно-щелочной раствор и экстрагируют выделившиеся дитерпеновые кислоты углеводородным растоврителем, отгоняют растворитель до концентрации дитерпеновых кислот 30-50% и получают репеллент против грызунов. Нейтральные вещества последовательно экстрагируют ацетоном и спиртом C₁-С₃. Массовое соотношение нейтральные вещества:экстрагент 1:2 до 1:5 получают при обработке ацетоном концентратов сложных эфиров высших жирных кислот с тритерпеновыми спиртами, стеринами и высшими жирными спиртами и остаток, растворимый в ацетоне. При переработке остатка спиртом отделяют сумму дитерпеновых спиртов от соединений, нерастворимых в спирте, омылением которых спиртовым раствором щелочи получают концентрат полипренолов, хроматография на силикогеле которого при соотношении вещество:сорбент 1:10 и использовании гексана и гексана с добавкой объемных 5 и 10% диэтилового эфира в соотношении сорбент:растворитель 1:1 выделяют полипренолы с плотностью 0,893-0,897; на хроматограмме ВЭЖХ должны присутствовать пики, дающие по расположению и высоте пиков типичную для полипренолов хроматограмму. Условия хроматографии: колонка размером 3,0× 150 мм, заполненная сорбентом октадецилсиликагелем типа X-Terra C₁₈ или аналогичная, подвижная фаза - смесь ацетон-метанол (80:20), скорость потока - 1 мл/мин.

Оценку гепатопротекторных свойств Ропрена (полипренолов) проводили на доступных и воспроизводимых моделях токсического гепатита, повреждениях печени, вызванных фенацетином, дихлорэтаном, частичной резекцией печени. Повреждения печени, вызываемые данными токсическими веществами, наиболее сходны с таковыми при вирусном гепатите (под редакцией А.Г.Рахмановой, Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции, Т.1, Санкт-Петербург, 1997, с.175). Изучение препарата при частичной резекции печени позволяет оценить его действие на репаративно-регенерационную функцию гепатоцитов (Салопаев Б.П. Регенерация, адаптация, гомеостаз, Горький, Волго-Вятское издательство, 1990 г., с.152).

Изучение гепатопротекторного действия Ропрена выполнены в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, Институте экспериментальной медицины РАМИ, Институте токсикологии Минздрава РФ.

Крысам самцам массой 160-170 г вводили внутрижелудочно дихлорэтан (500 мг/кг) и ацетаминофен (фенацетин) (400 мг/кг) 1 раз в день на протяжении 4 дней в смеси с подсолнечным маслом (1:1). Через 10 дней у всех экспериментальных животных по морфологической картине печени подтверждалось наличие токсического гепатита. С этого времени на протяжении 10 дней экспериментальным животным с лечебной целью вводили 1 раз в сутки Ропрен в дозе 20,0 мг/кг живой массы животного (25% раствор в растительном масле) внутрижелудочно и препараты сравнения: эссенциале - ампулы (1 мл/кг, внутривенно в хвостовую вену) и легалон (силимарин) в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно. Об эффективности лечения судили по динамике массы тела относительной массе печени, содержанию билирубина, трансаминаз, фосфатаз, церулоплазмина, общего белка, липидов сыворотки крови, содержанию гликогена, глутатиона, SH-групп, цитохромов в печени, а также по гексеналовому сну, бромсульфоаминовой пробе и гистологической картине печени.

К 20 дню эксперимента в группе с токсическим поражением печени дихлорэтаном и без лечения погибло 40% животных, а при лечении с легалоном - 10% крыс. После воздействия фенацетина за это время в группе животных без лечения погибло 60% подопытных животных, а в группе, леченной легалоном, - 30% крыс. В группах при лечении Ропреном и эссенциале летальности не наблюдалось. При создании экспериментальной модели гепатита путем интоксикации дихлорэтаном или фенацетином наблюдалась некоторая желтушность слизистых оболочек и склер, пальпаторно определялось увеличение размеров печени, снижалась масса тела. Результаты морфометрических показателей интактных, подвергнутых интоксикации и леченых животных приведены в таблице 1.

При интоксикации животных дихлорэтаном и фенацетином достоверно снижалась масса тела и увеличивалась относительная масса печени. Лечение животных Ропреном позволило вернуть массу тела и относительную массу печени в большей степени к нормальным показателям, чем лечение легалоном и эссенциале.

Для оценки функционального состояния печени использовали результаты биохимического анализа крови, приведенные в таблице 2.

Из результатов анализов крови экспериментальных и интактных животных следует, что при поражении печени дихлорэтаном и фенацетином в крови животных отмечались явные биохимические сдвиги: увеличивалась активность трансаминазы, фосфатазы, лактатдегидрогеназы, снижалось в сыворотке крови содержание общего белка, липидов, резерва сульфгидрильных групп крови, повысились уровни билирубина и церулоплазмина, замедлялось выведение бромсульфалеина. При лечении Ропреном и препаратами сравнения установлено, что все препараты уменьшают признаки поражения печени. По сравнению с лечением легалоном лечение Ропреном и эссенциале показало более высокий терапевтический эффект. При использовании Ропрена большинство биохимических показателей вернулись или приблизились к показателям интактных животных.

Наряду с биохимическими показателями крови проводились исследования ткани печени. В таблице 3 приведены данные по содержанию восстановленного глутатиона, гликогена, цитохромов Р₄₅₀ и В₅. Антоксическую функцию печени оценивали по продолжительности гексеналового сна.

Из результатов анализа следует, что при токсикологических поражениях печени дихлорэтаном и фенацетином уменьшились запасы гликогена, восстановленного глутатиона, уровня детоксицирующих цитохромов. Поражение печени также подтверждается снижением ее функциональной активности в виде уменьшения скорости распада гексенала.

Применение Ропрена, эссенциале и легалона (в меньшей степени) способствует улучшению показателей печени. Ропрен и эссенциале в большей степени способствуют восстановлению печеночных показателей, функционального состояния печени, приближая их к норме.

Таким образом, применение Ропрена значительно улучшало морфологические, биохимические и функциональные показатели печени экспериментальных животных, предотвращало их гибель. Ропрен по многим показателям превосходит или показывает близкие результаты репаративных процессов по сравнению с эссенциале и значительно превосходит по изученным показателям легалон. Это подтверждается и гистологическими исследованиями печени интактных и экспериментальных животных.

Печень животных исследовали через 1, 3 и 10 дней лечения. При просмотре гистологических препаратов печени животных через 1 сутки после перорального введения дихлорэтана и фенацетина наблюдались признаки острого токсического гепатита. На препаратах, окрашенных суданом, было видно, что цитоплазма гепатоцитов густо заполнена мелкими и крупными каплями жира. Жировая дистрофия печени носила диффузный характер. На препаратах, окрашенных гематоксилинэозином, наблюдались вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов, набухание клеточных тел, нечеткость клеточных границ и бледная окраска некоторых групп ядер.

У животных, получавших лечение в течение 3 дней Ропреном и эссенциале, степень и распространение жировой дистрофии были менее выражены, чем у животных, не получавших лечение, и животных, получавших легалон.

У животных, получавших лечение в течение 10 дней Ропреном, наблюдалась нормализация структуры печени. На препаратах, окрашенных гематоксилинэозином, клеточные границы были выражены. Ядра гепатоцитов имели достаточное содержание хроматина и четкую мембрану. Капли жира были видны лишь в единичных гепатоцитах (окрашивание суданом). Ропрен значительно улучшал гистологическую картину органа при сравнении с лечением легалоном, а при лечении эссенциале можно было наблюдать остаточные явления гепатита.

По данным патоморфологического исследования ежедневное в течение 10 дней применение Ропрена устраняет признаки жировой дистрофии и нормализует структуру печени опытных крыс. Аналогичные результаты получены и при электронной микроскопии препаратов печени животных, пролеченных Ропреном в течение 10 дней. Наиболее характерным являлось некоторое увеличение количества липосом и умеренное набухание митохондрий и эндоплазматического ретикулума, что свидетельствует об активных процессах репарации.

Важной моделью изучения влияния лекарственных препаратов на стимуляцию процессов естественной регенерации печени и восстановления ее функциональной активности является модель частичной гепатоэктомии животных. Эксперименты проведены на 60 белых крысах самцах массой 180-200 г. Частичную гепатоэтомию осуществляли, удаляя центральную долю печени под эфирным наркозом. Опытным группам животных перорально с помощью зонда вводили Ропрен в дозе 40 мг/кг (1 мл раствора на оливковом масле) или препарат сравнения оротат калия в дозе 100 мг/кг 2 раза в день, начиная со следующего дня после операции, в течение 7 дней.

Выбранный в качестве препарата сравнения оротат калия (производное пиримидина) является эталонным препаратом, рекомендуемым для ускорения регенерации печени. Оротовая кислота является предшественником урацила, в который она превращается при декарбоксилировании.

Контрольной группе крыс через зонд вводили оливковое масло в таком же объеме (плацебо, 1 мл, 2 раза в день). О функциональной активности печени судили по тесту продолжительности гексеналового сна на 8 сутки после частичной гепатоэктомии. Гексенал вводили животным внутрибрюшинно в дозе 80 мг/кг. Для количественной оценки процессов регенерации использовали коэффициент полноты регенерации (Гайворонская В.В. и др. Влияние бемитила, этомерзола и яктона на процессы регенерации печени после частичной гепатоэктомии. - Экспериментальная и клиническая фармакология, Т.63, №5, 2000, с.34-36). Этот коэффициент имеет вид К=P₁·_{Р2/Р3, где P1 - масса печени через 7 дней после частичной гепатоэктомии, Р3 - масса удаленной при гепатоэктомии печени. Р1 и Р3 измеряют непосредственно, Р2 - масса оставшейся после гепатоэктомии печени (измеряется расчетным способом). Результаты эксперимента и расчета приведены в таблице 4.}

Коэффициент полноты регенерации печени “К” достоверно (Р< 0,03) превышает таковой для групп, получавшей оротат калия и плацебо. С другой стороны, группа плацебо имеет также коэффициент “К” выше, чем группа, получавшая оротат калия.

Полученные результаты позволяют считать, что тестируемый препарат Ропрен не нарушает процесс естественной репаративной регенерации печени и выше, чем у препарата сравнения.

На той же модели частичной гепатоэктомии было изучено влияние Ропрена и оротата калия на функциональную активность микросомальной системы по тесту гексеналового сна. Результаты приведены в таблице 5.

Были проведены морфологические исследования печени у крыс после частичной гепатоэктомии с последующим введением Ропрена. Печени исследуемых групп крыс, включая интактную группу (25 объектов), выведенных на 8 день эксперимента согласно Международным правилам гуманного обращения с животными, фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего производили заливку в парафин и готовили гистологические срезы толщиной не более 5 мк. Срезы окрашивали обзорными гистологическими красками - гематоксилином и эозином, азуром и эозином. Для выявления волокнистых структур проводили окрашивание по Ван Гизону. Для выявления гликогена проводили ШИК-реакцию. Оценку и подсчет гистологических структур проводили в 10 полях зрения объекта × 20, × 40, окуляра × 10 в условной единице площади. Статистическую обработку материала осуществляли с учетом принципов доказательной медицины. Проводили микрофотографирование гистологических препаратов. При просмотре гистологических препаратов для оценки репаративных процессов в печени обращалось внимание на состояние стромы и паренхимы печени. Для оценки состояния стромы оценивались волокнистые структуры печени, в том числе в портальных, перепортальных трактах и дольках печени, а также учитывалось состояние звездчатых ретикулоэндотелиоцитов (ЗРЭ)-купферовских клеток. При оценке состояния паренхимы печени обращалось внимание на содержание гликогена (как одного из важнейших показателей метаболической активности печени), а также на возможные дистрофические изменения гепатоцитов. Для оценки интенсивности, полноценности и особенностей регенераторных процессов в печени проводили подсчет митозов в гепатоцитах, амитотически разделившихся гепатоцитов (дву- и многоядерных) ядрышек в ядрах гепатоцитов (как показатель синтеза рибосомной РНК и пролиферативной активности гепатоцитов).

Таким образом, проведенные морфологические исследования печени у крыс после частичной гепатоэктомии с последующим введением Ропрена показали, что у этих животных оказывается более сохраненная строма органа без значительных разрастаний соединительной ткани. Имеет место активация (в форме пролиферации) звездчатых ретикулоэндотелиоцитов, активно участвующих в метаболических процессах печени.

В паренхиме печени наблюдалась активация метаболических процессов в виде заметного отложения гликогена в гепатоцитах. Вместе с тем выраженных дистрофических изменений гепатоцитов, равно как и так называемой “дисплазии” (полиморфизма) ядер гепатоцитов не наблюдалось как в группе получавших, так и не получавших Ропрен животных, что свидетельствует о щадящем действии препарата на паренхиму печени. Об этом же свидетельствует отсутствие активациии так называемой спонтанной патологии лабораторных животных под воздействием Ропрена. Следует особо отметить, что вследствие частичной гепатоэктомии в паренхиме печени у животных, не получавших Ропрен, наблюдается появление двуядрышковых ядер гепатоцитов, что указывает на некоторое нарушение процессов синтеза рибосомной РНК и возникновение нетипичных для ткани печени митозов в гепатоцитах.

При введении Ропрена количество дву- и полиядрышковых ядер гепатоцитов значительно (почти в два раза) уменьшается, а митозы практически не встречаются. В то же время у получавших Ропрен животных наблюдается увеличение количества двуядерных гепатоцитов, что является доказательством усилия обычного для репарации печени амитотического типа пролиферации гепатоцитов. Двуядерность гепатоцитов, как принято считать, является своеобразным механизмом приспособления для увеличения поверхностных отношений между ядром и цитоплазмой, особенно при предъявлении повышенных требований функции органа, например при репаративных процессах, развивающихся вследствие альтерации (в данном случае после частичной гепатоэктомии).

Все отмеченные выше морфологические особенности регенераторных изменений свидетельствовали о развитии более эффективных репаративных процессов в печени после введения Ропрена.

Предложено: новое средство для стимуляции процессов естественной регенерации печени. Средство представляет собой полипренолы, полученные из древесной зелени хвойных пород общей формулы (I), ранее известные как гепатопротектор. Изобретение обеспечивает сохранение стромы органа без значительных разрастаний соединительной ткани, активацию метаболических процессов при отсутствии активации спонтанной патологии (т.е. нарушения синтеза рибосомной РНК и нетипичных для ткани печени митозов в гепатоцитах). 5 табл.

где n=10-20.

Применение полипренолов, полученных из древесной зелени хвойных пород, общей формулы

где n=10-20, в качестве средства для стимуляции процессов естественной регенерации печени.