ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ AJUGA REPTANS L Российский патент 2005 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использовано для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов.

Питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L. из патентных источников не выявлена. Наиболее близкой к заявленному изобретению является агаризованная питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L. (Володин В.В. Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах // Автореферат дис. доктора биол. наук. 1999. Москва. 52 с.) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахароза - 30 г/л, инозитол - 100 мг/л и витамины по Стаба, мг/л: фолиевая кислота - 0,5; рибофлавин - 0,5; биотин - 1; Са-пантотенат - 1; пиридоксин - 1; тиамина хлорид - 1; никотинамид - 2; кобаламин - 0,0015 и поливинилпиролидон - 2 г/л. Данный состав питательной среды не позволяет получить клеточные культуры с высоким содержанием экдистероидов.

Технический результат настоящего изобретения состоит в определении состава питательной среды для получения клеточной культуры Ajuga reptans L. с высоким содержанием экдистероидов.

Технический результат достигается тем, что клеточную культуру Ajuga reptans L. выращивают на агаризованной питательной среде, которая в отличие от прототипа содержит дополнительно β -ситостерин 5-50 мг/л или дополнительно MnSO₄·_{5H2O 606,5 мг/л.}

Пример 1. Контроль (по прототипу).

Для получения клеточной культуры Ajuga reptans L. готовили питательную среду, используя химически чистые реактивы. Готовили агаризованную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахароза - 30 г/л, инозитол - 100 мг/л и витамины по Стаба, мг/л: фолиевая кислота - 0,5; рибофлавин - 0,5; биотин -1; Са-пантотенат - 1; пиридоксин - 1; тиамина хлорид - 1; никотинамид - 2; кобаламин - 0,0015 и поливинилпиролидон - 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизовали в сухожаровом шкафу при 180° С, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливали по 40 мл питательной среды. Первичную клеточную культуру Ajuga reptans L. пассировали на агаризованную среду. Чашки Петри термостатировали при 26±1°С в условиях темноты. Спустя 4 недели определяли интенсивность роста и содержание экдистероидов в клеточной культуре. Интенсивность роста определяли по изменению сырой массы клеток в цикле выращивания. Повторность вариантов для клеточных культур 5-ти кратная.

Экдистероиды определяли в биомассе клеточных культур, которую высушивали при 60° С в течение 24 часов. 50-80 мг высушенной измельченной пробы экстрагировали метанолом в течение 16-18 ч. После центрифугирования аликвоту 1 мл разбавляли дистиллированной водой (1:4) и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С 16 (БиоХимМак, Россия). Сорбированные экдистероиды элюировали 3 мл 60%-ного метанола и анализировали ВЭЖХ. Анализ экдистероидов из клеточных культур проводили на хроматографической системе Varian, Pro Star (США), колонка Diasorb C16/T (150× 4мм) (БиоХимМак, Россия), размер частиц 7 мкм; состав элюента: ацетонитрил-вода (100:20, по объему); скорость элюции - 1.5 мл/мин. Детектирование проводили при λ =242 нм. В качестве стандартов веществ использовали эталонные образцы экдистероидов, полученные в лаборатории биохимии и биотехнологии растений (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН). Количество экдистероидов рассчитывали методом абсолютной калибровки.

Содержание в клеточной культуре Ajuga reptans L. 20-гидроксиэкдизона составило 0,293±0,010 мг/г сухой массы, 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 0,031±0,001 мг/г, аюгалактона - 0,096±0,010 мг/г, суммы экдистероидов - 0,420 мг/г.

Пример 2-4.

Получение клеточной культуры проводят аналогично примеру 1, различием является добавление в среду β -ситостерина в количестве 5 мг/л; 25 мг/л; 50 мг/л. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1ВариантыКонцентра
ция β - ситостерина в среде, мг/лИндекс роста по сырой массеСодержание экдистероидов, мг/г сухой массы   20-гидроксиэкдизон29-норциасте
рон + 29-норсенгос
теронАюгалактонСумма экдистероидов1Контроль8,58±0,870,293±0,0100,031±0,0010,096±0,0100,420257,36±0,520,250±0,0100,031±0,0010,233±0,0470,51432510,18±0,761,041±0,0310,567±0,0440,527±0,0232,13545012,00±0,781,228±0,0470,166±0,0071,058±0,0892,452

При концентрации в среде β -ситостерина 5 мг/л увеличение концентрации аюгалактона составляет 242%. При концентрации в среде β -ситостерина 25 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 355%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 1830%, концентрации аюгалактона - 549%, суммы экдистероидов - 508%. При концентрации в среде β -ситостерина 50 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 419%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 535%, концентрации аюгалактона - 1102%, суммы экдистероидов - 584%.

Пример 5.

Получение клеточной культуры проводят аналогично примеру 1, различием является добавление в среду дополнительно МnSO₄·_{5Н2О 606,5 мг/л. Результаты представлены в таблице 2.}

Таблица 2ВариантыКонцентрация MnSO₄·_{5H2O, мг/л}Индекс роста по сырой массеСодержание экдистероидов, мг/г сухой массы   20-гидроксиэкдизон29-норциастерон + 29-норсенгостеронАюгалактонСумма экдисте роидов1Контроль(по прототипу) (24,1)8,58±0,870,293±0,0100,031±0,0010,096±0,0100,4205630,613,94±1,700,905±0,0100,401±0,0100,612±0,0471,918

При концентрации в среде MnSO₄·_{5H2O 630,6 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 309%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 1294%, концентрации аюгалактона - 638%, суммы экдистероидов - 456%.}

Таким образом, применение предлагаемого состава питательной среды позволяет увеличить содержание экдистероидов в клеточной культуре Ajuga reptans L.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использована для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов. Питательная среда, позволяющая выращивать клеточную культуру Ajuga reptans L. на агаризованной модифицированной питательной среде, содержит макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахарозу – 30 г/л, инозитол – 100 мг/л. Витамины по Стаба содержит, мг/л: фолиевая кислота – 0,5; рибофлавин – 0,5; биотин – 1, Са-пантотенат – 1, пиридоксин – 1, тиамина хлорид – 1, никотинамид – 2, кобаламин – 0,0015 и поливинилпиролидон – 2 г/л, с добавлением β -ситостерина от 5 мг/л до 50 мг/л или MnSO₄·_{5Н2О 606,5 мг/л. Изобретение позволяет увеличить содержание экдистероидов в клеточной культуре Ajuga reptans L. 2 табл.}

Питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L., характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:

Агар-агар 8000

KNO₃ 1900

NH₄NO₃ 1650

СаСl₂ 332

MgSO₄·_{7Н2О 370}

КН₂РО₄ 170

FeSO₄·_{7Н2О 27,85}

Nа₂ ЭДТА 37,25

Н₃ВО₃ 6,2

МnSO₄·_{5Н2O 24,1}

ZnSO₄·_{7Н2О 8,6}

Nа₂МоО₄ 0,25

КI 0,83

CuSO₄·_{5Н2О 0,025}

СоСl₂·_{6Н2О 0,025}

сахароза 30000

инозитол 100

фолиевая кислота 0,5

рибофлавин 0,5

биотин 1

Са-пантотенат 1

пиридоксин 1

тиамина хлорид 1

никотинамид 2

кобаламин 0,0015

поливинилпиролидон 2000

β -ситостерин или 5-50

MnSO₄·_{5Н2О 606,5}

вода до 1 л