СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 1994 года по МПК G04B23/08 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Известен способ определения активности иммунокомпетентных клеток, заключающийся в том, что вначале из лимфоидных органов животного после забоя получают лимфоциты путем гомогенизации этих органов, после чего отмывают и стандартизуют эту взвесь. В расплавленную агарозу или агар вносят 0,1 мл 10%-ной суспензии эритроцитов барана (ЭБ), после чего туда же добавляют 0,1 мл взвеси лимфоцитов, разливают по чашкам Петри и инкубируют при 37^оС в течение 1-2 ч. Затем на поверхность агарозы (агара) наслаивают комплемент морской свинки, инкубируют 30 мин при температуре 37^оС и производят подсчет зон гемолиза, ассоциируемых с антителообразующими клетками -АОК (Прямой метод локального гемолиза. Кн.: Иммунологические методы. Под. ред. Г.Фримеля. М. , Медицина, 1987. с. 61-62). Принцип метода заключается в том, что лимфоциты животного, сенсибилизированные к ЭБ, синтезируют антиэритроцитарные антитела, которые в присутствии комплемента гемолизируют эти эритроциты.

Данный способ недостаточно экономичен и прост в исполнении. При эксперименте на мелких лабораторных животных он требует либо больших объемов забираемой крови (концентрация взвеси до 50 млн. клеток/мл), изъятие которой несовместимо с жизнью, либо извлечения селезенки, из-за чего также приходится животных забивать. Это лишает возможности тестирования по данному показателю хронических экспериментов. Сам агар при температуре плавления (свыше 45^оС) также обладает гемолитическим действием и не может быть разлит с достаточной точностью.

Цель изобретения - повышение экономичности и упрощение способа.

Поставленная цель достигается путем предварительной иммунизации животных эритроцитами барана, выделения и стандартизации взвеси лимфоцитов и проведения гемолиза эритроцитов барана лимфоцитарными антителами в присутствии комплемента. Лимфоциты выделяют из крови, инкубацию стандартизированных эритроцитов с эритроцитами барана и комплементом проводят в пробирках, активность оценивают по отношению числа эритроцитов барана после инкубации в пробирке, содержащей лимфоциты и комплемент, к таковому в пробирке, содержащей лимфоциты.

Способ осуществляют следующим образом. Группе животных, например крыс, производят внутрибрюшную иммунизацию 2,5 мл 10% взвеси ЭБ. Спустя 5 сут производят забор гепаринизированной крови в количестве 2-2,5 мл их хвоста. Затем проводят выделение взвеси лимфоцитов на градиенте фиколл-верографина (уд.вес. 1,077 г/л), после чего эту взвесь дважды отмывают забуференным физраствором и стандартизуют в питательной среде (например среда 199) до концентрации 2 млн. клеток/мл. Для каждого животного берут 3 пробирки. В первую и вторую пробирки помещают по 0,15 мл среды 199, в третью - по 0,15 мл 20% -ного раствора комплемента морской свинки. Во все три пробирки помещают по 0,2 мл стандартизированной взвеси лимфоцитов, после чего туда же добавляют 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки инкубируют в течение 60 мин при температуре 37^оС. После этого во второй и третьей пробирках проводят сравнительный подсчет концентрации эритроцитов.

Отношение концентрации эритроцитов в пробирке N 2 (содержит смесь лимфоцитов с эритроцитами барана без комплемента) к таковой в пробирке N 3 (содержит полный ассортимент гемолитической системы - эритроциты барана, лимфоциты и комплемент) называется гемолитическим индексом и характеризуют В-клеточную активность культуры лимфоцитов (продукцию гемолизинов). Содержимое пробирки N 1 (смесь ЭБ с лимфоцитарной взвесью) используется для последующей постановки теста Е-розеткообразования по стандартной методике ("Оценка субпопуляций Т-лимфоцитов у человека: T-супрессоры и Т-помощники". Методические рекомендации. Авт.: А.С.Павлюк и др. М., 1982. с. 8-12). Таким образом, представляется возможность без забоя животных в одной культуре лимфоцитов определить и В-клеточную активность, и Т-клеточную рецепцию параллельно.

Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

1. Крыса-самка линии Вистар исследована по известному способу и предлагаемой методике. Количество АОК селезенки на 1 чашку - 600, гемолитический индекс лимфоцитов селезенки - 2,55. Гемолитический индекс лимфоцитов крови (ГИ) - 2,29.

2. Крыса-самка N 2 линии Вистар. Количество АОК - 392, ГИ селезенки 2,05, ГИ крови - 2,07.

3. Крыса-самка линии Вистар также исследована по способам прототипа и изобретения. Количество АОК-1696, ГИ селезенки - 3,97, ГИ крови - 3,52.

Для обоснования способа было изучено 30 крыс линии Вистар (интактных), у которых изучена активность В-лимфоцитов по способу прототипа (уровень АОК селезенки) и по методике изобретения (гемолитический индекс). Причем, для досконального уточнения информативности параметров, гемолитический индекс изучен с двумя вариантами культур лимфоцитов: из селезенки и из крови. Средний уровень АОК на чашку Петри составил 445,5 ± 48,1, гемолитического индекса с лимфоцитами селезенки - 2,65± ±0,30, с лимфоцитами крови - 2,40 ± 0,19. Обращало внимание практическое отсутствие расхождения между уровнем ГИ селезенки и ГИ крови (Р>0,6). Был проведен регрессионно-корреляционный анализ связи между тремя изученными параметрами. Коэффициенты парной корреляции составили: 1) между уровнем АОК и ГИ селезенки +0,57 ± 0,15 (Р<0,001); 2) между уровнем АОК селезенки и ГИ крови +0,72 ± 0,13 (Р<0,001); 3) между уровнями ГИ селезенки и крови +0,66 ± 0,14 (Р<0,001). Линейные регрессионные модели этих связей были соответственно: 1) Y= 0,35X-108,0; 2) Y=0,28X-115,6; 3) Y=0,42X-128,5.

Высокая корреляция между уровнями АОК селезенки и гемолитическим индексом лимфоцитов крови указывает на очевидную информативность последнего показателя.

Таким образом, способ экономичен, так как при определении гемолитического индекса крови нет необходимости забивать животных, что позволяет обходиться в эксперименте меньшим их количеством. Способ более прост по сравнению с известным за счет исключения постановки сложной и трудоемкой реакции локального гемолиза в агаре.

Использование: экспериментальная медицина, иммунология. Цель: повышение экономичности и упрощение способа. Сущность: из крови животного выделяют лимфоциты и стандартизируют их, инкубируют эритроциты барана в присутствии комплемента с лимфоцитами и без лимфоцитов, а активность рассчитывают как отношение первого показателя к второму.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ путем предварительной иммунизации животных эритроцитами барана, выделения и стандартизации взвеси лимфоцитов, проведения гемолиза эритроцитов барана лимфоцитарными антителами в присутствии комплемента с последующим расчетом, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения экономичности способа, лимфоциты выделяют из крови, инкубацию стандартизированных лимфоцитов с эритроцитами барана и комплементом проводят в пробирках, а активность рассчитывают как отношение числа эритроцитов барана после инкубации в пробирке, содержащей лимфоциты и комплемент, к таковому в пробирке, содержащей лимфоциты.