ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИНОЙ ГИБРИДОМЫ И4, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ МИКРОТРУБОЧЕК ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2005 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и биологии и касается штамма мышиных гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела (МКА), пригодные для идентификации фазы митотической активности клеток посредством выявления расположения микротрубочек по экспрессии антигена, выявляемого полученным реагентом.

При делении (митозе) клетки активная роль в расхождении хромосом принадлежит ахроматиновому веретену, образующемуся при расщеплении центросомы с отходящими от нее микротрубочками. Микротрубочки - это фибриллярные полимерные белковые структуры, которые динамичны, т.е. постояннополимеризуются и деполимеризуютсявцитоплазме. Полимеризация (сборка) микротрубочек обычно начинается на центросоме, причем присоединение новых белковых молекул к микротрубочке происходит на дистальном от центросомы конце. Сформированная микротрубочка отделяется от центросомы и разбирается.Наличие динамичных микротрубочек абсолютно необходимо для нормального прохождения митоза (деления). В силу своей динамичности микротрубочки чувствительны к веществам, взаимодействующим с их основным белком тубулином, т.е. антимитотическим агентам. Например, колихицин, связываясь с тубулином, вызывает разрушение микротрубочек, в результате чего клетки не могут делиться. Алкалоид таксол, наоборот, стабилизирует микротрубочки, в результате чего нормальное ахроматиновое веретено также не формируется и митоз не осуществляется. Известен ряд химиопрепаратов, избирательно действующих на митотическое веретено и тем самым останавливающим деление клеток (винкристин, винбластин, таксол, эпотилоны), которые применяются для лечения лейкозов и опухолей (рака) или проходят клинические испытания для этих целей. Параметры динамики микротрубочек (скорости сборки и разборки, частота образования новых микротрубочек) постоянны для определенного типа клеток и фазы митоза, но вариабельны между разными типами клеток и фазами митоза и зависят от белкового состава микротрубочек. В частности, раковые клетки обычноотличаютсяухудшениемполимеризациииусилением деполимеризации микротрубочек. Параметры динамики микротрубочек зависят от состава входящих в них минорных белков.

В связи с этим детальная идентификация минорных белков, входящих в состав микротрубочек, чрезвычайно важна для изучения их роли в динамике процесса клеточного деления и возможности влияния на него, особенно в случаях злокачественного перерождения (трансформации) клеток, характеризующегося безграничным делением и ростом опухолевого клона.

В настоящее время выделено уже немало белков, из которых состоят микротрубочки, хотя функции многих из них неизвестны. В то же время количество гибридом, которые секретировали бы моноклональные антитела к определенным белкам микротрубочек, в мире довольно ограничено. В нашей стране они совсем отсутствуют.

В качестве прототипа полученного нами штамма гибридомы могут рассматриваться гибридомы:

1) к основному белку микротрубочек тубулину (мол. масса 55 кДа) - гибридомы DM1A (Blose et al., 1984), B-5-1-2, D66, TUB 2.1, 2-28-33, SAP.4G5, JDR.3B8, SDL.3D10, ONS.1A, 6-11-В1, B3, TUB 1A2;

2) к центросоме - GTU-88, TUB-11 (Chang et al., 2003);

3) к специфическим белкам микротрубочек нейронов -

белку MAP1 (мол. масса 300 кДа, легкая цепь 34 кДа) - гибридомы Е12 (Kuznetsov et al., 1986), АА6; белку МАР2 (мол. масса 250 кДа) - гибридомы НМ-2 (Tucker et al., 1988), АР-20, белку tau (мол. масса 60 кДа) - гибридома TAU.

Однако полных аналогов полученного нами штамма гибридомы, секретирующей МКА к белку с мол. массой 110 кДа, входящему в состав микротрубочек, не обнаружено.

Целью изобретения явилось создание штамма культивируемых гибридомных клеток, полученных в системе мышь·мышь, секретирующих моноклональные антитела к белковым структурам, имеющим прямое отношение к митотической активности клеток, т.е. к процессу их деления.

Для осуществления этого применяли метод соматической гибридизации клеток. В качестве иммуногена использовали ядерную фракцию лизированных в 0.1% растворе Nonidet Р-40 клеток В-лимфобластоидной линии Ramos, находящейся в логарифмической фазе роста. Это обеспечивало наличие максимального количества активно пролиферирующих (т.е. делящихся) клеток, экспрессирующих искомые антигены. Мышей линии BALB/c четырехкратно иммунизировали, а затем их сенсибилизированные спленоциты сливали с культивируемыми клетками мышиной миеломы в соотношении 3:1. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3000-3700. Объединенные после процедуры слияния клетки культивировали в 96-луночных плоскодонных платах по 0.2·10⁶ клеток на ячейку в среде с селективными агентами (50-кратными концентратами гипоксантина, аминоптерина, тимидина). Скрининг культуральных жидкостей из лунок, давших рост гибридомным клонам, проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции на фиксированных клетках линии Ramos.

Гибридомные клетки, секретирующие моноклональные антитела, связывающиеся с микротрубочками клеток и дающие характерное свечение в реакции непрямой иммунофлюоресценции, шестикратно клонировали методом лимитирующих разведений и затем выводили в массовую культуру. Для получения высоких концентраций моноклональных антител, названных И4, штамм клеток И4 выращивали в виде асцитной опухоли в брюшной полости мышей (DBA·BALB/c) F₁ с предварительным введением пристана и облучением в дозе 400 рад.

Штамм И4 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты, слабо прикрепляющиеся к пластику.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - DMEM, с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 2% HEPES-буфера, 50 мкг/мл гентомицина и 5·10^-5 М 2-меркаптоэтанола. Условия культивирования: 37°С, абсолютная влажность и 5% CO₂ в воздухе. Частота пассирования 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10. Титр антител в культуральной жидкости в реакции непрямой иммунофлюоресценции определяется как 1:10-1:100.

Титр моноклональных антител в асцитной жидкости составляет 1:100-1:200.

Характеристика моноклональных антител

Моноклональные антитела И4, секретируемые штаммом И4, относятся к иммуноглобулину класса М.

Способ криоконсервирования штамма клеток И4. Криозащитная среда: DMEM, содержащая 40% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Криоампулы с клеточной взвесью помещают на сутки в холодильник на -70°С, после чего переносят в жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания 90-95%. После размораживания клетки культивируют в плотности 0.2-0.3·10⁶ кл/мл.

Бактерии, грибы и дрожжи в культуре не обнаружены.

Специфичность МКА И4. Моноклональные антитела окрашивают пунктирно микротрубочки, расположенные в цитоплазме клеток различного видового, тканевого и линейного происхождения (фиг. 1 и 2). При определении молекулярной массы антигена, связываемого полученными антителами, методом Вестерн-блоттинга, была выявлена полоса, соответствующая 110 кД. При изучении литературных данных, ссылок на получение моноклональных антител к антигену микротрубочек, обладающему сходной характеристикой, обнаружено не было.

Таким образом, созданные моноклональные антитела И4 могут быть рекомендованы в качестве реагента, используемого в дополнение к существующим зарубежным коммерческим образцам другой специфичности для более полного изучения процесса клеточного деления в фундаментальных исследованиях и возможности влияния на него в клинике.

Литература

1. Blose S.H. et al. 10-nm filaments are induced to collapse in living cells microinjected with monoclonal and polyclonal antibodies against tubulin. J. Cell Biol. 98, 847 (1984).

2. Chang P. et. al. ε-Tubulin is required for centriole duplication and microtubule organization. Nature Cell Biol. 5, 71-76 (2003).

3. Kuznetsov S.A., Rodionov V.I., Nadezhdina E.S., Murphy D.B., Gelfand V.I. Identification of a 34-kD polypeptide as a light chain of microtubule-associated protein-1 (MAP-1) and its association with a MAP-1 peptide that binds to microtubules. J. Cell Biol. 102, 1060 (1986).

4. Tucker R.P. et al. Neuronal microtubule-associated proteins in the embryonic avian spinal cord. J. Соmр. Neurol. 271, 44-55 (1988).

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и может быть использовано для идентификации фазы митотической активности клеток. Штамм мышиных гибридомных клеток получен путем слияния спленоцитов мышей, иммунизированных лизатами клеток лимфобластоидной линии RAMOS, с клетками мышиной миеломы. Гибридома секретирует моноклональные антитела, направленные к антигену с молекулярной массой 110 кДа, расположенному на микротрубочках в цитоплазме клеток и выявляемому в ядерных клетках различной видовой принадлежности. Использование изобретения позволяет изучать патогенез деления и состояние митотической активности здоровых и злокачественных клеток с оценкой антимитотического (противоопухолевого) действия различных химиопрепаратов и веществ. 2 ил.

Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы И4, используемый для получения моноклональных антител к антигену микротрубочек ядерных клеток с м.м. 110 кДа, которые относятся к иммуноглобулинам класса М.