СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ОТ ТОКСИГЕННЫХ Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/63 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к дифференциации токсигенных штаммов холерных вибрионов от гемолитичных - атоксигенных.

Известно, что патогенные (токсигенные) штаммы холерных вибрионов, как правило, не обладают гемолитической активностью в отличие от апатогенных (атоксигенных) (Адамов А.К. и др. Методика дифференцирования патогенных и апатогенных вибрионов Е1 Тог. Журн. Пробл. особо опасн. инф. - Саратов. - 1971. - Вып.1. С.116-123). В схеме лабораторного исследования на холеру оценку эпидемической значимости вибрионов проводят по четырем критериям, одним из которых является определение гемолитической активности по Грейгу (Greig E. The haemolytic faction of Indian strains of cholerae and cholera like vibriose // Ind. J. Med. Res. - 1914. - Vol.2. - Р.622-629). Способность лизировать эритроциты барана остается основным дифференциально-диагностическим тестом (тест Грейга) в связи с недостаточной оснащенностью практических лабораторий и невозможностью проведения ПЦР-диагностики и ДНК-зондирования.

Тест Грейга заключается в том, что к 1 мл суточной бульонной культуры в пробирке добавляют 1 мл взвеси эритроцитов барана, трижды отмытых физиологическим раствором. После 24-часовой инкубации при 37°С учитывают реакцию. При положительной реакции наступает лизис эритроцитов (лаковая кровь), культуру считают атоксигенной - гемолитичной. В случае отрицательного результата происходит осаждение эритроцитов в виде четкого колечка на дне пробирки - культуру считают токсигенной.

Тест гемолиза по Грейгу не экономичен - для его постановки необходима свежая кровь, наличие животного, удовлетворительные условия его содержания; не отличается стандартностью и воспроизводимостью и сопровождается трудоемкостью взятия крови у животного.

Известно, что ген, кодирующий продукцию липазы (hlyС или lipA), входит в состав области гена hly, отвечающего за продукцию гемолизина (Fiore F., 1992). Авторами изобретения установлено, что очищенные препараты гемолизинов проявляют липазную активность до гемолитического титра. Исследованные атоксигенные (гемолитичные) штаммы холерных вибрионов в 90% случаев обладают липазной активностью, в то время как токсигенные штаммы (hly^-) не способны осуществлять гидролиз жиров.

Целью предложенного изобретения является способ дифференциации атоксигенных -гемолитичных штаммов холерного вибриона от токсигенных по ферментативному маркеру - липазной активности; поиск альтернативы, упрощение и стандартизация способа в сравнении с известным тестом Грейга.

Поставленная цель достигается тем, что на чашку Петри с агаром Мартена рН 9,0, содержащим индикатор - Нильский голубой сульфат в концентрации 1,0-1,2 мг/100 мл среды и субстрат - куриный жир в концентрации 1,0-1,5 мл/100 мл (среды), эмульгированный с помощью 0,1 мл “Прогресса”, наносят 1 петлю (d - 2 мм) исследуемой культуры и инкубируют посевы 48 часов при 37°С. При проявлении липазной активности, характерной для атоксигенных - гемолитичных штаммов, после инкубации непрозрачный, плотный микрогазон приобретает желтое или бутылочно-зеленое окрашивание на питательной среде голубого цвета.

У токсигенных холерных вибрионов в отсутствие липазной активности наблюдается рост прозрачного нежного микрогазона голубого, одинакового с питательной средой цвета. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. На чашку Петри с агаром Мартена рН 9,0, содержащим 1 мг индикатора Нильского голубого сульфата на 100 мл среды, 0,1 мл/100 мл “Прогресса”, 1,0 мл/100 мл растопленного эмульгированного куриного жира, наносят 1 петлю (d - 2 мм) культуры Vibrio cholerae eltor 14156 (ctx^-, hly⁺). Через 48 часов инкубации при 137°С наблюдается рост непрозрачного, плотного микрогазона желтого цвета.

Пример 2. Выполняют подобно примеру 1, но используют агар Мартена, содержащий 1,2 мг индикатора Нильского голубого сульфата на 100 мл среды, 1 мл/100 мл “Прогресса”, 1,5 мл/100 мл растопленного эмульгированного куриного жира. Через 48 часов инкубации культура Vibrio cholerae eltor 14156 (ctx^-, hly⁺) окрашивается в бутылочно-зеленый с желтым оттенком цвет.

Пример 3. Выполняют подобно примеру 1, но используют токсигенный штамм V.cholerae cholerae 569 В (ctx⁺). После 48 часов инкубации наблюдается рост в виде микрогазона светло-голубого цвета.

Пример 4. Выполняют подобно примеру 2, но используют токсигенный штамм V.cholerae eltor 5879 (ctx⁺). После 48 часов инкубации культура окрашивается в голубой одинаковый со средой цвет.

Эффективность способа изучена на 60 штаммах V.cholerae 4-x групп: 1 - штаммы, выделенные от людей hly⁺, ctx^-; 2 - штаммы из внешней среды hly⁺, ctx^-; 3 - штаммы из внешней среды ctx⁺ hly^-; 4 - штаммы, выделенные от людей ctx⁺ hly^-.

Предлагаемый способ позволяет легко, с высокой демонстративностью дифференцировать токсигенные штаммы холерного вибриона от атоксигенных (гемолитичных), является альтернативой тесту Грейга. Способ прост в постановке, легко учитываем, не требует наличия свежей крови и содержания барана, как в прототипе. Куриный жир одной серии (100 мл), достаточный для приготовления 10000 мл среды - 2000 исследований, можно хранить в условиях морозильной камеры (-20°С) в течение 2-х лет и более.

Предлагаемый способ может быть использован при работе с большим количеством штаммов возбудителя (деление 1 чашки со средой на 6 секторов), с целью дифференциации hly⁺, ctx^- и hly^- ctx⁺ штаммов.

Возможно приготовление питательной среды (агара Мартена с соответствующими ингредиентами) заранее, готовые чашки с питательной средой могут храниться при t (6±2)°С в течение 10-20 дней (срок наблюдения).

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в микробиологических исследованиях для оценки эпидемической значимости. Для реализации способа используют плотную питательную среду – агар Мартена с рН 9,0, с индикатором – Нильским голубым сульфатом и субстратом - эмульгированным куриным жиром - в концентрации 1,0-1,2 мг и 1,0-1,5 мл соответственно на 100 мл среды. Посевы инкубируют на указанной среде в течение 48 часов при температуре 37°С. Токсигенные холерные вибрионы, не обладающие липазной активностью, образуют микрогазон, окрашенный, как и среда, в голубой цвет. В то же время при проявлении липазной активности, характерной для атоксигенных (гемолитичных) штаммов холерных вибрионов, микрогазон окрашивается в желтый или бутылочно-зеленый цвет на голубом фоне питательной среды. Способ обеспечивает стандартизацию при одновременном упрощении его реализации.

Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных, включающий нанесение исследуемых культур на питательную среду с индикатором и субстратом и учет результатов по изменению окраски индикатора, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют агар Мартена с рН 9,0 с индикатором - Нильским голубым сульфатом в концентрации 1,0-1,2 мг/100 мл среды и субстратом - эмульгированным куриным жиром в концентрации 1,0-1,5 мл/100 мл, затем проводят инкубацию в течение 48 ч при температуре 37°С, после этого по окрашиванию микрогазона в желтый или бутылочно-зеленый цвет с желтым оттенком дифференцируют атоксигенные штаммы холерных вибрионов, обладающие липазной активностью, от токсигенных, не имеющих окраску микрогазона.