СПОСОБ ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ Vibrio cholerae О139 Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 C12R1/63 C12R1/92 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике холеры.

Особенностью штаммов Vibrio cholerae O139 «Бенгал», поступивших в Ростовский НИПЧИ из различных стран (Индия, Япония, Франция, Киргизия), и других выделенных в России явилось наличие лизогении. Обнаружение специфической метки в виде лизогенности по фагам различных морфогрупп и серологических типов было важно для идентификации токсигенных вибрионов O139 серогруппы. Холерные диагностические бактериофаги, используемые для индикации возбудителя холеры, а также специальные методы дифференциации холерных вибрионов по некоторым признакам оказались непригодными для Vibrio cholerae O139 в связи с фагорезистентностью последних. В связи с этим и возникла проблема разработки посредством фаговых методов, а именно профаготипированием и лизисом специфическим фагом, внутривидовой дифференциации штаммов Vibrio cholerae O139.

Известен способ фаготипирования Vibrio cholerae O139 (см. Индия, Чакрабати и др., журнал J. Clin Microbiol, 2000, Jan. 38 (1): 44-9), заключающийся в том, что посредством пяти фагов, выделенных в эпидемию, 500: штаммов холерных вибрионов O139 серогруппы распределили на 10 фаготипов.

Однако несмотря на то, что предложенный метод дает возможность дифференцировать штаммы нового серотипа, использовать его в России не представляется возможным, так как в нашей стране диагностические и типирующие фаги для холерных вибрионов O139 серогруппы отсутствуют.

За прототип выбран способ дифференциации эпидемических и неэпидемических вибрионов вида Vibrio eltor по типу иммунитета их умеренных фагов (см. RU пат. №1767879, кл. С 12 Q 1/04, 1994 г. (01.30), в котором применяют в качестве тест-системы две индикаторные культуры Vibrio eltor 570/КМ-114/ и 570/222 Н/КМ-117/, при этом штамм КМ-114 чувствителен к холерным умеренным фагам всех известных иммунотипов, а его субкультура штамм КМ-117 обладает устойчивостью к литическому действию фагов III иммунотипа, при этом выявляя посредством данной тест-системы штаммы V. eltor, несущие фаги III иммунотипа V морфогруппы, последние расцениваются как подозрительные на принадлежность к эпидемическим.

Недостатком известного способа дифференциации является то, что с его помощью невозможно осуществлять внутривидовую дифференциацию холерных вибрионов O139 серогруппы, которые содержат различные по морфологии и антигенным свойствам испытуемые на лизис фаги, так как у штаммов новой серогруппы встречается носительство фагов двух морфогрупп I и V, либо только I, либо только V. Это обстоятельство подтверждает недостаточную точность известного способа.

Задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа внутривидовой дифференциации V. cholerae O139, позволяющего с высокой точностью проводить разграничение штаммов по маркерному фаговому признаку.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе внутривидовой дифференциации V.cholerae O139, включающем совместное инкубирование испытываемой культуры с индикаторным тест-штаммом с последующим фаготипированием, в качестве тест-штаммов используют фагочувствительные штаммы V.cholerae eltor KM-199 и V.cholerae O139 KM-152, а дифференциацию проводят в два этапа, по первому этапу в качестве индикаторного штамма используют V. cholerae eltor KM-199, инкубируют его с исследуемой культурой в течение 20-24 часов, затем полученную смесь микроорганизмов при температуре 55-57°С прогревают 40-60 минут и высевают на газоны индикаторного штамма V. cholerae eltor KM-199, который предварительно засевают в слое 0,7% агара на пластинку 1,5% агара Мартена, причем через сутки выращивания при 37°С проводят регистрацию фаголизиса, при этом второй этап дифференциации осуществляют, используя фаг, полученный из лизогенного штамма испытуемой культуры путем его нанесения на индикаторный штамм V. cholerae O139 КМ-152, с помощью которого выявляют только филаментозные фаги, проводя прямое фаготипирование.

Для осуществления способа используют два штамма холерных вибрионов в качестве тест-системы V. cholerae eltor и V. cholerae SG-36 (O139 серогруппа). Штамм V.cholerae eltor (P-13169) депонирован под номером КМ-199 в ГКПБРНИПЧИ «Микроб», г.Саратов и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки длиной 1,2-2,7 мкм, диаметр 0,2-0,4 мкм с одним полярно расположенным жгутиком. Спор и капсул не образует. Грамотрицательны.

На плотных средах - агар Мартена и агар Хоттингера, pH 7,6±0,2 - образует полупрозрачные колонии с голубоватым оттенком, 1,5±0,5 мм в диаметре.

В жидких средах - бульон Мартена и бульон Хоттингера, 1%-ная пептонная вода, pH 7,8±0,2 образует равномерную муть, тонкую пленку на поверхности среды.

Биохимические свойства.

Разлагает до кислоты без газа маннозу, сахарозу, глюкозу, манит, не расщепляет арабинозу, окисляет глюкозу в среде Хью-Лейфсона в аэробных и анаэробных условиях (на 4-е сутки), декарбоксилирует лизин, не расщепляет аргинин, не образует сероводород. Штамм устойчив к 30 мкг/мл полимиксина.

Серологические свойства.

Отношение к гомо-гетерологичным фагам: штамм лизируется диагностическими фагами эльтор, ctx⁺, ctx^-, фагом холерным классическим «С» не лизируется. Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам: штамм агглютинируется О-холерной сывороткой и сывороткой Огава, но не агглютинируется сыворотками Инаба, RO.

Штамм V. cholerae SG-36 (O139 серогруппа) депонирован под номером КМ-152 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки имеют вид грамотрицательных, полиморфных, слегка изогнутых и прямых палочек. Подвижны, при выращивании в 0,3% щелочном агаре наблюдается помутнение столбика агара. При просмотре в электронном микроскопе - монотрихи.

Рост на твердых питательных средах на щелочном агаре (pH 7,6-7,8), вибрионы образуют через 18 часов роста при 37°С колонии правильной формы, диаметром 1,5-2 мм, с влажной блестящей поверхностью, полупрозрачные в проходящем свете.

Рост на жидких питательных средах: на щелочном бульоне - помутнение с нежной пленкой.

Биохимическая активность штамма: штамм разлагает глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, маннозу, сахарозу, глюкозу, маннит, крахмал с образованием кислоты без газа, не продуцирует ацетилметилкарбинол, индол, декарбоксилирует лизин, не расщепляет аргинин, арабинозу, не образует сероводород. Штамм устойчив к 30 мкг/мл полимиксина.

Отношение к гомо-гетерологичным фагам: штамм не лизируется диагностическими фагами: холерными классическим эльтор, ТЭПВ 1-7, лизируется фагом I морфогруппы 16488, выделенным из V. cholerae O139-16488. Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам: штамм агглютинируется сывороткой O139 серогруппы, произведенной в РПЧИ; не агглютинируется О-холерной сывороткой и типоспецифическими сыворотками Инаба, Огава, RO. Штамм O139 серогруппы вирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁷ м.к.

Генетические особенности штамма: лизогенный, ctx⁺, tcp^-. Штамм не способен расщеплять синтетический субстрат для нейраминидазы 2-(4-метилумбеллиферил)-N-ацетил-L-D-нейраминовую кислоту.

Продукт, синтезируемый штаммом: продуцент умеренного фага, серологически родственного фагам холерных вибрионов эльтор, II серотипа, III иммунной категории.

Активность (продуктивность) штамма: продуцирует умеренный фаг в титре 10⁷/мл.

Пример 1.

Готовят взвесь из клеточной суспензии фагочувствительного индикаторного штамма Vibrio cholerae eltor KM-199 и исследуемого штамма Vibrio cholerae O139 (Р-16488), для этого по 1 петле суточных агаровых культур вносят в одну пробирку с 2 мл бульона Мартена (pH 7,6-7,8), проводят инкубирование в течение 20 часов при температуре 37°С. Затем смесь прогревают до температуры 55-57°С в течение часа и наносят каплю взвеси на газон штамма Vibrio eltor KM-199, предварительно засеянного в слое 0,7% агара на пластинку 1,5% агара Мартена.

Учет проводят через 24 часа выращивания при 37°С, при этом в месте нанесения капли образуется зона просветления газона. В результате исследуемый штамм V. cholerae O139 (Р-16488) является лизогенным и выделяет фаг.

Тест-штамм V. cholerae eltor KM-199 (Р-13169) является универсально чувствительным по всем типам фагов O139, позволяя таким образом осуществлять дифференциацию штаммов V.cholerae O139 по их лизогенности и нелизогенности (см. таблицу).

Следующим (вторым этапом) способа является использование индикаторного штамма V. cholerae KM-152 (Р-16373) для фагов V. cholerae O139 I морфогруппы. Для этого 0,5-1 мл 4 часовой бульонной культуры штамма КМ-152 вносят в 4 мл 0,7% агара Мартена и выливают на агаровую пластинку, затем на газон культуры наносят в виде «дорожки» каплю фага, выделенного из V. cholerae O139 (Р-16488) ФБ. На газоне штамма КМ-152 фаг БФ формирует мутные зоны лизиса. Штамм КМ-152 позволяет выявлять только филаментозные фаги, к которым штамм КМ-152 чувствителен и обладает устойчивостью к другим умеренным фагам III иммунотипа, имеющим головку и отросток.

Кроме того, в результате экспериментов было выявлено, что фаги I морфогруппы V. cholerae O139 отличаются от фагов V морфогруппы высокой чувствительностью к хлороформу. В результате воздействия на фаги хлороформом 1:10 фаги I морфогруппы погибали, а фаги V морфогруппы оставались жизнеспособными. В связи с этим для инактивации клеток смешанной культуры (индикаторный штамм с лизогенной культурой) при выделении фага используют прогревание при температуре 55-57°С в течение 40-60 минут, при этом фаги I и V морфогруппы сохраняются жизнеспособными.

Пример 2.

Выполняют, как описано в примере 1, используя смесь V. cholerae eltor KM-199 и V. cholerae O139 (Р-17625). Смесь прогревают при температуре 56°С в течение 40 минут, а затем наносят каплю взвеси в виде «дорожки» на газон штамма V. eltor KM-199, предварительно засеянного в слое 0,7% агара на пластинку 1,5% агара Мартена. Учет проводят через 24 часа выращивания при 37°С, при этом в месте нанесения капли не образуется зона лизиса культуры.

Следовательно, исследуемый штамм V. cholerae O139 (Р-17625) нелизогенный и фаг не выделяет.

Предложенный способ внутривидовой дифференциации был разработан на основании изучения новых эпидемических штаммов токсигенных V. cholerae O139 серогруппы специалистами Ростовского НИПЧИ. Было изучено 50 штаммов, из которых 25 ctx⁺ tcp⁺ штаммов выделены от больных холерой и 25 ctx^- tcp^- культур изолированы из проб внешней среды (см. таблицу).

По известному способу штаммы были разделены на лизогенные (25 штаммов ctx⁺ tcp⁺) и нелизогенные (25 штаммов ctx^- tcp^-). Фаг III иммунотипа содержали 6 штаммов.

По предлагаемому способу фагопродукция на индикаторе КМ-199 обнаружена у 25 ctx⁺ tcp⁺ штаммов, 25 ctx^- tcp^- штаммы не содержали фаг в супернатанте. Фаг III иммунотипа выявлен у 6 штаммов, он не лизировал V. cholerae O139 KM-152. Вместе с тем фагопродукция отмечается у 19 штаммов на V. cholerae O139 КМ-152, обеспечивая дополнительно дифференциацию этой группы и повышая эффективность в 3 раза.

Практическую ценность представляет выделение по предлагаемому способу фага из штамма V. cholerae O139-P16488, что обеспечивает получение диагностического препарата фага V. cholerae O139.

Фаг, выделенный на штамме КМ-199, лизирует 13 штаммов ctx⁺ tcp⁺ V. cholerae O139, что улучшает лабораторную диагностику холерных вибрионов новой серогруппы.

В таблице представлены результаты повышения числа дифференцированных штаммов по предлагаемому способу.

Использование предлагаемого способа внутривидовой дифференциации V. cholerae O139 позволяет с помощью индикаторных штаммов КМ-199 и КМ-152 в определенной технологической последовательности с высокой точностью проводить фаготипирование, получая при этом дополнительные характеристики холерных вибрионов, выделяемых из клинического материала.

Кроме того, фагопродукция и чувствительность к фагу, выделенному из лизогенного штамма, позволяют провести прямое фаготипирование и дают чувствительный способ лабораторной диагностики V.cholerae O139 серогруппы, так как дифференцируются штаммы вибрионов между собой по маркерному фагу и упрощается первичная характеристика изучаемых штаммов по фаготипу, что значительно сокращает время проведения экспресс-анализов и позволяет быстро устанавливать источники инфекции, территорию, регион ее распространения, проведение дифференциации очагов.

ТаблицаКол-во изученных штаммов V.cholerae O139Дифференциация холерных вибрионов O139 серогруппыПо предлагаемому способуПо известному способуФагопродукцияИммунитет КМ-152Лизис фагом из V.cholerae O139 (16488)ФагопродукцияИммунитетКМ-199КМ-152КМ-114КМ-11725 ctx⁺ tcp⁺251961325625 ctx^- tcp^-25000250

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике холеры. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве тест-штаммов используют фагочувствительные штаммы Vibrio cholerae eltor KM-199 и Vibrio cholerae O139 KM-152, а дифференциацию проводят в два этапа, по первому этапу в качестве индикаторного штамма используют Vibrio cholerae eltor КМ-199, инкубируют его с исследуемой культурой в течение 20-24 часов. Затем полученную смесь микроорганизмов при температуре 55-57°С прогревают 40-60 минут и высевают на газоны индикаторного штамма Vibrio cholerae eltor KM-199, который предварительно засевают в слое 0,7% агара на пластинку 1,5% агара Мартена. Через сутки выращивания при 37°С проводят регистрацию фаголизиса, при этом второй этап дифференциации осуществляют, используя фаг, полученный из лизогенного штамма испытуемой культуры путем его нанесения на индикаторный штамм Vibrio cholerae O139 КМ-152, с помощью которого выявляют только филаментозные фаги, проводя прямое фаготипирование. Использование способа позволяет с высокой точностью проводить фаготипирование с получением дополнительных характеристик холерных вибрионов, выделяемых из клинического материала. 1 табл.

Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae О139, включающий совместное инкубирование испытуемой культуры с индикаторным тест-штаммом с последующим фаготипированием, отличающийся тем, что в качестве тест-штаммов используют фагочувствительные штаммы Vibrio cholerae eltor KM-199 и Vibrio cholerae О139 KM-152, а дифференциацию проводят в два этапа, по первому этапу в качестве индикаторного штамма используют Vibrio cholerae KM-199, инкубируют его с исследуемой культурой в течение 20-24 ч, затем полученную смесь микроорганизмов при температуре 55-57°С прогревают 40-60 мин и высевают на газоны индикаторного штамма Vibrio cholerae eltor KM-199, который предварительно засевают в слое 0,7% агара на пластинку 1,5% агара Мартена, причем через сутки выращивания при 37°С проводят регистрацию фаголизиса, при этом второй этап дифференциации осуществляют, используя фаг, полученный из лизогенного штамма испытуемой культуры путем его нанесения на индикаторный штамм Vibrio cholerae О139 KM-152, с помощью которого выявляют только филаментозные фаги, проводя прямое фаготипирование.