ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ HAEMOPHILUS INFLUENZAE ТИПА B Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии, а именно к получению питательной среды для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b.

Haemophilus influenzae типа b (Hib) часто является причиной острого менингита, эпиглоттита, артрита, остеомиелита, пневмонии, целлюлита, пиелонефрита и перикардита у детей. Воздушно-капельный механизм передачи, трудности этиотропной терапии, связанные с резистентностью Hib-бактерий, позволяют считать единственным эффективным средством борьбы с этой инфекцией и защиты от нее детей специфическую вакцинопрофилактику.

Вакцины против Hib производят на основе капсульного полисахарида (полирибозил-рибитолфосфата - ПРФ). ПРФ является антигеном и способен индуцировать иммунный ответ по Т-независимому типу. Для обеспечения полноценного ответа у детей младшего возраста ПРФ конъюгирует с белком-носителем, что придает полисахариду свойств Т-зависимого антигена.

В настоящее время в большинстве стран, получивших подтверждение эпидемиологической значимости инфекционных заболеваний, вызванных Hib и включивших вакцинацию против Hib-инфекции в календарь прививок, специфическая вакцинопрофилактика позволила ликвидировать тяжелые генерализованные формы гемофильных заболеваний, а носительство выявляется лишь у непривитых (Демина А.А. Эпидемиология инвазивных заболеваний, обусловленных Haemophilus influenzae типа b. Международный медицинский журнал. 1998, 4:315-322).

В России оценка эпидемиологической значимости указанных заболеваний до сих пор не проводилась, и отечественная вакцина против Hib-заболеваний отсутствует.

Для разработки отечественных высокочувствительных диагностических тестов, и тем более для создания вакцины, необходимы препараты чистого капсульного полисахарида Н.influenzae типа b.

Традиционно для выращивания Haemophilus influenzae типа b используют полноценные питательные среды - сердечно-мозговой бульон и среду с казаминовыми кислотами (Difco, США). Ориентировочная стоимость 1 л сердечно-мозгового бульона (без учета стоимости факторов роста и витаминов) составляет 183 руб., среды с казаминовыми кислотами - 190 руб. по ценам 2003 г.

При выращивании Hib на полноценных питательных средах в культуральном супернатанте после прекращения синтеза и отделения в среду культивирования капсульного полисахарида содержится около 50% белков. Процесс выделения капсульного полисахарида включает его осаждение из культурального супернатанта цетавлоном с последующей экстракцией из осадка растворами солей с возрастающей ионной силой. Вместе с полисахаридом осаждаются гидрофильные белки и нуклеиновые кислоты. Увеличение концентрации раствора соли, с одной стороны, приводит к получению полисахарида большей молекулярной массы, с другой - повышает содержание белка в препарате (Anderson P., Smih D.H. Isolation of Capsular Polysaccharide from Culture Supernatant of Haemophillus influenzae Type b, Inf and immun. 1977, Feb: 472-477).

Избыточное содержание в полноценных питательных средах питательных веществ и/или наличие в них каких-то специфических ингибиторов приводит к снижению синтеза капсульного полисахарида Hib.

Известна синтетическая питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая аминокислоты и пептиды, витамины и факторы роста, минеральные соли, буферы, ПАВ, стабилизирующие коллоиды и другие компоненты (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2001, №3).

Ориентировочная стоимость синтетической питательной среды составляет около 180 руб. за 1 л. Из 31 компонента, входящего в ее состав 12 - аминокислоты. Приготовление синтетической питательной среды трудоемко, т.к. состоит из 22 этапов, связанных с разными требованиями к способам стерилизации различных компонентов.

Техническим результатом заявленной питательной среды является простота процесса приготовления, удешевление ее стоимости, а также получение при культивировании на ней Haemophilus influenzae типа b чистого капсульного полисахарида, не содержащего примеси белков питательной среды.

Для достижения указанного результата питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая КН₂РО₄, К₂НРО₄, NaCl, MgCl₂ CaCl₂, глюкозу, НАД, гемин, тиамин, пантотенат кальция, согласно изобретению, дополнительно содержит аминопептид при следующем соотношении компонентов на 1 л:

NaCl 5,8 гMgCl₂0,2 гCaCl₂0,022 гКН₂PO₄2,720 гК₂HPO₄3,480 гглюкоза 5,000 ггемин 0,01 гНАД 0,004 гпантотенат кальция 0,004 гтиамин 0,004 мламинопептид 300 мл

Сущность изобретения иллюстрируется на следующем примере.

Пример. Для получения полусинтетической питательной среды для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b предварительно готовят растворы, которые на последнем этапе смешивают:

1) раствор солей

NaCl - 58 г

MgCl_2·6Н₂О - 9,22 г

CaCl_2·2Н₂О - 0,294 г

Доводят до 1 л дистиллированной водой до рН 7.0

2) 1 М калий-фосфатный буфер.

КН₂PO₄ - 136 г

К₂HPO₄ - 174 г

Доводят до 1 л дистиллированной водой.

3) Раствор гемина в фосфатном буфере.

50 г гемина растворяют в 12,5 мл 0,5 М раствора К₂HPO₄, добавляют 86 мл дистиллированной воды и 1,6 мл раствора 1М КН₂PO_4.

4) Раствор НАД и витаминов.

Тиамина хлорид 5% - 4 мл

Пантотенат кальция - 0,2 г

НАД - 0,2 г

Доводят дистиллированной водой до 20 мл.

5) Раствор глюкозы

Глюкоза - 25 г

Доводят дистиллированной водой до 100 мл

6) Растворы солей (1), калий-фосфатного буфера (2), гемина в фосфатном буфере (3) и глюкозы (5) стерилизуют автоклавированием.

7) Раствор НАД и витаминов стерилизуют фильтрованием.

8) Смешивают стерильные растворы:

100 мл раствора солей (1), 20 мл 1 М калий-фосфатного буфера (2), 20 мл раствора гемина (3), 4 мл разведенного в 10 раз раствора НАД с витаминами (4), 20 мл 25% раствора глюкозы (5) и добавляют 300 мл раствора аминопептида.

Доводят объем дистиллированной водой до 1 л. РН готовой среды 7.0-7.7.

В результате получают питательную среду с содержанием следующих компонентов на 1 л:

NaCl 5,8 гMgCl₂0,2 гCaCl₂0,022 гКН₂PO₄2,720 гК₂HPO₄3,480 гглюкоза 5,000гемин 0,01НАД 0,004пантотенат кальция 0,004тиамин 0,004 мламинопептид 300 мл

Полученная полусинтетическая питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b отличается от известной питательной среды простотой приготовления, невысокой стоимостью и отсутствием компонентов, мешающих получению чистого препарата капсульного полисахарида. Заявленная питательная среда состоит из 11 компонентов, ее приготовление включает 8 этапов, ориентировочная стоимость 1 л такой питательной среды составляет 20 рублей.

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии, а именно к получению питательной среды для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b. Питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая КН₂PO₄, К₂HPO₄, NaCl, MgCl₂, CaCl₂, глюкозу, НАД, гемин, тиамин, пантотенат кальция, аминопептид и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение обеспечивает простоту приготовления, невысокую стоимость и отсутствие компонентов среды, мешающих получению чистого препарата капсульного полисахарида. Ориентировочная стоимость 1 л такой питательной среды составляет 20 рублей.

Питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая KH₂PO₄, К₂HPO₄, NaCl, MgCl₂, CaCl₂, НАД, гемин, тиамин, пантотенат кальция, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит глюкозу, аминопептид и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

КН₂PO₄2,720 гК₂HPO₄3,480 гNaCl 5,8 гMgCl₂0,2 гCaCl₂0,022 гГлюкоза 5,000 гНАД 0,004 гГемин 0,01 гПантотенат кальция 0,004 гТиамин 0,004 млАминопептид 300 млДистиллированная вода до 1 л