ШТАММ HAEMOPHILUS INFLUENZAE SPB ТИП В - ВЫСОКОАКТИВНЫЙ ПРОДУЦЕНТ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА ПОЛИРИБОЗИЛРИБИТОЛФОСФАТА Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12P19/04 C12R1/21 

Штамм HAEMOPHILUS INFLUENZAE SPB тип b - высокоактивный продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата (далее - изобретение) относится к области биотехнологии и медицины. Целью данного изобретения является получение капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата для дальнейшего промышленного производства иммунобиологических препаратов. Для достижения поставленной цели предлагается штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, выделенный от больного ребенка в г. Санкт-Петербург и депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-7884. Данный штамм обладает способностью синтезировать полирибозилрибитолфосфат в высокой концентрации при росте на полусинтетической питательной среде.

Для профилактики инфекций, вызванных Haemophilus influenzae тип b, используют моно- и комбинированные вакцины, действующим веществом в которых является полирибозилрибитолфосфат - капсульный полисахарид возбудителя. Одними из основных факторов, влияющих на эффективность промышленного производства данных вакцин, являются продуктивность штамма, скорость его роста, себестоимость питательной среды.

Известен способ получения капсульного полисахарида при помощи штамма Haemophilus influenzae b Mech №1, который при росте на синтетической и полусинтетической (на основе аминопептина) питательных средах синтезировал полирибозилрибитолфосфат в количестве 100 и 50 мкг/мл соответственно (патент RU 2257412, 27.07.2005 С1, Елкина СИ., Ястребова Н.Е., Орлова О.Е., Ванеева Н.П., Сергеев В.В., Апарин П.Г., Львов В.Л. «Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 - продуцент капсульного полисахарида - полирибозилрибитолфосфата»). Время культивирования в жидкой питательной среде составляет 6-8 часов после достижения культурой стационарной фазы роста.

В патенте (патент RU 2465316, 27.10.2012, Ванеева Н.П., Елкина СИ., Апарин П.Г. «Штамм бактерий Haemophilus influenzae b 326, стабильный продуцент капсульного полисахарида») описан штамм Haemophilus influenzae В 326 - стабильный продуцент капсульного полисахарида. При росте на синтетической (среда Klein с факторами роста) и полусинтетической (дополнительно содержит казеиновый пептон) питательных средах данный штамм синтезирует 90-150 и 80-130 мкг/мл полирибозилрибитолфосфата соответственно. Длительность культивирования не превышает 8 часов.

Задачей настоящего изобретения является получения продуктивного штамма-продуцента полирибозилрибитолфосфата.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении продукции полирибозилрибитолфосфата.

В отличии от аналогов предлагаемый штамм Haemophilus influenzae SPB тип b (№В-7884 в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) синтезирует большее количество полирибозилрибитолфосфата (250-300 мкг/мл) за меньший период культивирования (6 часов).

Первичная идентификация культуры Haemophilus influenzae SPB тип b была проведена по фенотипическим и серологическим признакам на базе Федерального государственного унитарного предприятия «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России).

Вторичная идентификация была проведена по фенотипическим, серологическим и генотипическим признакам на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Серологическое исследование провели с использованием моновалентной сыворотки тип b (Becton, Dickinson and Company, США), генетическое - с помощью масс-спектрометра MALDI-Biotyper (Bruker, Германия) и анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Морфологические признаки Haemophilus influenzae SPB тип b

Культура представлена мелкими неподвижными грамотрицательными неспорообразующими палочками овоидной формы размером 0,3-0,5×0,2-0,3 мкм, возможен полиморфизм, деление клеток происходит перетяжкой. На поверхности клеток образуется легкоотделяемый капсульный полисахарид. По отношению к кислороду культура - факультативный анаэроб.

Культуральные особенности Haemophilus influenzae SPB тип b

На твердой питательной среде шоколадный агар образует округлые мелкие (0,5-3 мм) выпуклые матовые колонии серого цвета с гладкой поверхностью. У молодых колоний края ровные, которые по мере старения культуры становятся волнистыми. При культивировании данного штамма на полусинтетической жидкой питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b (состав приведен в примере 1) наблюдается равномерное помутнение среды и незначительный придонный рост.

Биохимические свойства Haemophilus influenzae SPB тип b

Штамм оксидазо- и каталазоположительный, по типу питания- хемоорганотроф. Штамм является ауксотрофом и требует для роста факторов роста никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и протопорфирин IX (или протогем).

Серологические свойства Haemophilus influenzae SPB тип b

Штамм проявляет агглютинирующие свойства к сыворотке специфичной к Н. influenzae типа b.

Антигенные свойства Haemophilus influenzae SPB тип b

Штамм синтезирует антиген полирибозилрибитолфосфат - капсульный полисахарид, который играет основную роль в его вирулентности.

Генетические характеристики Haemophilus influenzae SPB тип b

При анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК была определена последовательность размером 1395 п.н.

Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b хранят при температуре - (80±3)°С в полусинтетической питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b (состав приведен в примере 1) в смеси с 80% глицерином (соотношение 1:4).

Подробное получение капсульного полисахарида на жидкой полусинтетической питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b (состав приведен в примере 1) в зависимости от способа подготовки посевного материала описано далее в примерах.

Пример 1. Синтез полирибозилрибитолфосфата штаммом Haemophilus influenzae SPB тип b в зависимости от различных компонентных комбинаций шоколадного агара, используемого при получении инокулята

Культуру из криопробирки в объеме 0,2 мл пересевали на шоколадный агар различного состава. Инкубацию посевов проводили в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при температуре (35±2)°С в течение 24 ч. Для культивирования использовали готовые чашки с шоколадным агаром (вариант 1, производитель Becton and Dickinson), приготовленный в лабораторных условиях шоколадный агар с добавкой IsoVitaleX (1%, объемная часть) согласно инструкции (вариант 2, основа шоколадного агара и добавка IsoVitaleX производства Becton and Dickinson, среда приготовлена ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) и приготовленный в лабораторных условиях шоколадный агар с добавкой IsoVitaleX (1%, объемная часть) с дополнительно внесенными факторами роста, а именно НАД - 0,02 г/л; гемин - 0,04 г/л, (вариант 3, основа шоколадного агара и добавка IsoVitaleX производства Becton and Dickinson, среда приготовлена ФГУП СПбНИИВС ФМБА России).

Далее культуру с поверхности чашек смывали физиологическим раствором (титр 10⁵ КОЕ/мл) и засевали колбы (10% от объема питательной среды), содержащие по 100 мл жидкой полусинтетической питательной среды для культивирования Haemophilus influenzae тип b следующего состава (г/л): Na₂HPO₄⋅2H₂O - 1,5, КСl - 0,5, NaCl - 2,3, NH₄Cl - 0,5, пептон бактериологический - 7,5, дрожжевой экстракт - 2,0, НАД - 0,02, гемин - 0,04, глюкоза - 4,0. Культивирование проводили на шейкер-инкубаторе при температуре (35±2)°С, при 150 об/мин в течение 6 часов.

По завершении культивирования концентрацию полисахарида определяли следующим образом. Биомассу инактивировали нагреванием (55°С, в течение 15 минут) и после охлаждения до (8-10)°С отделяли центрифугированием (4500 об/мин, в течение 30 мин). Содержание полирибозилрибитолфосфата в полученном супернатанте определяли по содержанию рибозы спектрофотометрическим методом.

В таблице 1 представлены данные по количественному содержанию полирибозилрибитолфосфата в супернатанте в зависимости от состава шоколадного агара.

Таким образом, максимальное количество капсульного полисахарида (265-275 мкг/мл) получено при использовании посевного материала, выращенного на шоколадном агаре с добавкой IsoVitaleX, в состав которого дополнительно входит 0,02 г/л НАД и 0,04 г/л гемина.

Пример 2. Влияние концентрации клеток Haemophilus influenzae SPB тип b в инокуляте на количество синтезированного капсульного полисахарида

Посевной материал получали при условиях, описанных в примере 1. Культуру выращивали на шоколадном агаре с повышенным содержание факторов роста (пример 1, вариант 3). Далее путем смыва культуры с поверхности агаризованной среды физиологическим раствором готовили суспензию с различной концентрацией клеток Haemophilus influenzae SPB тип b: 10⁴ КОЕ/мл, 10⁵ КОЕ/мл, 10⁶ КОЕ/мл, 10⁷ КОЕ/мл, 10⁸ КОЕ/мл. Засев, культивирование, определение концентрации полирибозилрибитолфосфата проводили, как описано в примере 1.

На рис. 1 представлены данные по количественному содержанию полирибозилрибитолфосфата в супернатанте в зависимости от концентрации клеток в суспензии для засева жидкой полусинтетической питательной среды для культивирования Haemophilus influenzae тип b.

Как видно из данных, представленных на рис. 1, максимальная концентрация полисахарида (290-300 мкг/мл) наблюдалась при концентрации клеток в инокуляте 10⁶ КОЕ/мл.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, обладающий высокоактивной продуктивностью капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-7884. Изобретение обеспечивает синтез полирибозилрибитолфосфата 250-300мкг/мл при минимальном времени культивирования (6 часов). 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-7884, продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата.