СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРСЕКРЕЦИИ ФОЛЛИТРОПИНА И ЛЮТРОПИНА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/74 G01N33/76 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, генетике, биологии и физиологии, лабораторной диагностике.

Проблема XXI века - это оздоровление генетического фонда, это проблема науки, социально-экономического благополучия России.

Постановлением Правительства Российской Федерации (октябрь, 1994, N 1146) введена в действие система социально-генетического мониторинга для выявления, оценки и прогнозирования состояния здоровья населения.

Возрастающее загрязнение окружающей среды привело к росту гипогенитализма, мужскому и женскому бесплодию, особенно высок риск роста гипогонадизма среди детей и подростков (врожденный и приобретенный).

Функционирование системы гонодостата обеспечивается гипоталамусом и гипофизарными гормонами (гонадотропинами). Гонадотропные гормоны представлены ФСГ (фоллитропином) и ЛГ (лютропином). Оба гормона являются гликопротеидами, состоящими из α- и β-субъединиц. Специфическая особенность каждого из гормонов определяется β-субъединицей.

ФСГ и ЛГ продуцируются базофильными клетками гипофиза.

Синтез и секреция этих гормонов находятся под контролем гипоталамуса половых гормонов.

Оба гормона регулируют функцию яичников и семенников. При угнетении последних наблюдается компенсаторное повышение выброса ФСГ и ЛГ, их гиперсекреция, именуемая гипергонадотропным гипогенитализмом.

В норме ФСГ в женском организме стимулирует рост и развитие одного или нескольких примордиальных фолликулов и вызывает дифференцировку и пролиферацию клеток гранулезы. Когда фолликул развивается, высвобождается яйцеклетка, остаток фолликула трансформируется в желтое тело, активность которого обеспечивается ЛГ. ЛГ - основной регулятор синтеза стероидов в яичниках.

В семенниках ФСГ способствует активизации процессов сперматогенеза и вызывает пролиферацию клеток Сертоли. ЛГ - стимулирует генерацию тестостерона (М.И.Балаболкин. Эндокринология, М., 1998).

Нарушения секреции гонадотропинов - их избыточный выброс, гиперсекреция наблюдается при первичном гипогенитализме - врожденном и приобретенном.

Врожденный - дисгенезия семенников и яичников (синдром Клайнфелтера, синдром Шерешевского - Тернера, синдром Рейфенштейна и т.д.) (М.И.Балаболкин. Эндокринология, М., 1998).

Приобретенный гипогонадизм - повреждение половых желез (инфекции, травмы, облучения, аутоиммунная недостаточность, кистозная трансформация), климактерий (Е. М. Вихляева, Руководство по эндокринной гинекологии, Питер, 1996; Н.Т.Сморкова, Андрология, М., 1995).

Ранняя диагностика гипергонадного гипогенитализма (т.е. непосредственно связанного с угнетением деятельности половых желез и гиперсекрецией ФСГ и ЛГ) актуальна в связи с ростом бесплодия в СНГ и наличием врожденной и приобретенной первичной патологии яичников и семенников. Известны способы определения уровня гонадотропинов - ФСГ и ЛГ:
- биологический;
- радиоиммунологический;
- иммуноферментный.

Биологический способ основан на введении гормона подходящему животному и анализе биологического эффекта (Резников А.Г., Методы определения гормонов, М., 1980).

Недостатки способа:
1) крайне низкая чувствительность;
2) трудоемкость, связанная с большими затратами времени и материальных средств (использование гипофизэктомированных животных).

Радиоиммунологический (РИА) способ основан на использовании специфических антител, которые инкубируют со смесью радиоактивно меченых и немеченых молекул гормона (В. Вутке, Общая эндокринология. Методы изучения, М., 1996, с. 387 - 388). При этом общее число молекул гормона превышает связывающую способность антител, благодаря чему происходит конкуренция за места связывания. Молекулы гормона, связавшиеся с антителами, и свободные молекулы разделяют, затем измеряют радиоактивность связанной фракции и по калибровочной кривой определяют количество гормона в биологическом образце.

Недостатки способа:
1) часто несовершенная корреляция между биологической и иммунологической реакционной способностью гормона; у более сложных гликопротеидных гормонов (ЛГ, ФСГ) структуры физиологически активных гормональных молекул в плазме могут существенно варьировать;
2) методы определения РИА требуют дорогостоящего оборудования для ядерной медицины и специального помещения;
3) применение специфических веществ, меченных изотопом ¹²⁵J или ³H, что требует соблюдения определенных норм радиационной безопасности;
4) невозможность длительного хранения наборов (¹²⁵J - 2 месяца, ³H - 3 месяца);
5) не могут применяться для экспресс-диагностики (необходимо накопить достаточное количество проб для заполнения РИА-набора, чтобы не снизить рентабельность анализа).

Нами в качестве прототипа взят иммуноферментный способ, который основан на тех же принципах, что и радиоиммунный (РИА), с той лишь разницей, что в РИА применяют специфические вещества, меченные изотопом ¹²⁵J или ³H, а в ИФА они маркированы ферментом (чаще пероксидазой хрена). Один из вариантов ИФА - определение гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) иммунометрическим способом, основанным на принципе усиленной люминесценции с использованием моноклональных антител. При этом происходит измерение люминесцентного свечения продуктов ферментного окисления:
- количественное определение лютеинизирующего гормона (ЛГ) в сыворотке, плазме (ЕДТА или гепарит) и моче человека. Набор Амерлайт ЛГ - 30. М.: Амеркард, 1999 г.;
- количественное определение фолликуло-стимулирующего гормона в сыворотке и плазме человека. Набор Амерлайт ФСГ (моноклональной). М.: Амеркард, 1999 г.

Ход определения ЛГ способом ИФА (система "Амерлайт").

1. Устанавливают в держатель стрипов столько лунок, сколько необходимо для анализа всех стандартов, контролей и образцов.

2. Вносят в соответствующие лунки по 50 мкл стандартов, контролей и образцов.

3. Во все лунки с антителами вносят по 150 мкл конъюгата.

4. Инкубируют 30 ± 2 минут при t=37^oC, встряхивая.

5. Промывают лунки и добавляют 250 мкл сигнального реагента, содержащего люминогенные субстраты (производную люминола и соль перкислоты) и усилитель (замещенный фенол).

6. Через 2 - 20 минут после внесения сигнального реагента считывают результат на анализаторе "Амерлайт".

Ход определения ФСГ методом ИФА (система "Амерлайт")
1. Устанавливают в держатель стрипов столько лунок, сколько необходимо для анализа всех стандартов, контролей и образцов.

2. Вносят в соответствующие лупки по 50 мкп стандартов, контролей и образцов.

3. Во все лунки с антителами вносят 150 мкп конъюгата (мышиные моноклональные антитела к ФСГ).

4. Инкубируют 1 час ± 5 минут, встряхивая.

5. Промывают лунки и добавляют 250 мкп сигнального реагента. Через 2-20 минут после внесения сигнального реагента считывают результат на анализаторе "Амерлайт".

Недостатки иммунометрического способа.

1. Требуются дорогостоящие оборудование и реактивы.

2. Нерентабельно проведение единичных исследований, поэтому нецелесообразно использовать наборы для экспресс-диагностики.

3. Использование реактивов только фирм-производителей
4. Вследствие пульсирующего характера секреции ФСГ и ЛГ рекомендуется брать 3 отдельные пробы крови с 30-минутными интервалами и смешивать для анализа равные объемы сыворотки, полученные из них, что усложняет ход определения.

Все вышеизложенное затрудняет определение гонадотропинов - ФСГ и ЛГ.

Задачи предлагаемого изобретения:
1. Повышение достоверности показателей контроля за стимуляцией гонадотропинов (ФСГ и ЛГ).

2. Повышение информативности.

3. Упрощение способа и снижение стоимости.

4. Экспресс-диагностика гипергонодотропного гипогенитализма (врожденного и преобретенного).

5. Упрощение приготовления пробы.

6. Изучение кристаллограммы сыворотки крови по картине специфической (селективной кристаллизации за счет повышения уровня гонодотропинов (ФСГ и ЛГ).

Сущность изобретения заключается в том, что для определения гиперсекреции ФСГ и ЛГ сыворотку крови в каплях наносят на предметное стекло, предварительно протертое замшей, накрывают покровным стеклом, сушат при температуре 37-38^oC в термостате, выдерживают в нем 1-1,5 часа, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате кристаллов - папоротникообразных определяют гиперсекрецию фоллитропина (ФСГ), а при наличии дендритов широко- и платообразно- разветвленных - гиперсекрецию лютропина (ЛГ).

Способ осуществляют следующим образом:
1. Для забора берут периферическую кровь из пальца, для чего скарификатором наносят повреждение в области пальца руки человека.

2. Капилляром Панченкова набирают кровь - 0,06-0,1 мл.

3. Полученный объем центрифугируют для получения сыворотки.

4. Сыворотку в виде капель объемом 0,01-0,02 мл каждая (5-6 капель) тарированной пипеткой наносят на предметное стекло, предварительно протертое замшей, и накрывают покровным стеклом.

5. Высушивают в термостате при T = +37-38^oC на протяжении 1-1,5 часов.

Под микроскопом в проходящем свете изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате кристаллов: папоротникообразных - определяют гиперсекрецию фоллитропинов (ФСГ), дендритов: (широко- и платообразно-разветленных - гиперсекрецию лютропина (ЛГ).

Нами предварительно были смоделированы модельные композиты (МК), приготовление из сыворотки крови здорового человека, обогащенной фоллитропином (ФСГ) и лютропином (ЛГ), взятых из тест-наборов ЛГ-30 и FSH (фирма "Амерлайт"). Модели содержали заранее известные концентрации гормонов, характерных для их гиперсекреции, так, высокой концентрации ФСГ соответствовали уровни - 9,8 - 24,5 - 48 мМЕ/мл, высокой концентрации ЛГ - 11 - 26.4 - 98 мМЕ/мл (фото 1, 2).

На фото 1а - в представлены кристаллограммы (КГ) модельных композитов, обогащенных ФСГ. В пробах содержание гормона выражалось в концентрациях: а - 9.8, б - 24.5, в - 48 мМЕ/мл.

На фото 2а - в представлены КГ МК, обогащенных ЛГ. В пробах соответственно концентрация гормона составила: а - 11, б - 26.4, в - 98 мМЕ/мл.

Экспериментальные исследования подтверждены 1895 наблюдениями.

Кристаллограммы эталонов:
Фото 1 а-в
Кристаллограмма (КГ) сыворотки крови (СК) здорового человека, обогащенная фоллитропином; присутствуют папоротникообразные кристаллы длиною от 5 до 25 мкм; концентрация фоллитропина (ФСГ): а - 9,8 мМЕ/мл, б - 24,5 мМЕ/мл, в - 48 мМЕ/мл.

Фото 2 а-в
Эталоны КГ сыворотки крови здорового человека, обогащенной лютропином (ЛГ), присутствуют дендриты: широкоразветвленные (а) и платообразно-разветвленные (б, в).

Концентрация ЛГ: а - 11 мМЕ/мл, б - 26,0 мМЕ/мл, в - 98 мМЕ/мл.

Примеры
Пример 1. Фото 3 аб
Больной К. , 14 лет, история болезни N 1139. DS: подозрение на гипергонадотропный гипогенитализм (синдром Клайнфелтера), на фото 3аб приведена КГ СК, присутствуют папоротникообразные кристаллы (а, б) длинною от 5 до 20 мкм, характерные для кристаллизации ФСГ и мелкие платообразно-разветвленные, широкоразветвленные дендриты, характерные для кристаллизации ЛГ (в).

Технология.

Из пальца капилляром Панченкова взята кровь - 0,1 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая (5) нанесены на предметное стекло, протертое замшей. Каждая капля накрыта покровным стеклом. Препарат поместили в термостат на 1,5 часа при T = 37^oC, затем исследовали микроскопическим путем в проходящем свете. Найдены папоротникообразные кристаллы (фото 3а, б) фоллитропина и мелкие платообразно-разветвленные дендриты (фото 3в) лютропина. Одновременно произведено определение уровня ФСГ (фоллитропина) и лютропина (ЛГ), концентрации гормонов повышены соответственно - 25 мМЕ/мл и 18,0 мМЕ/мл при норме ФСГ 5,31±1,1 мМЕ/мл и норме ЛГ - 4,25±0,91 мМЕ/мл.

DS: гипергонадотропный гипогенитализм подтвердился (гиперсекреция ФСГ и ЛГ).

Пример 2. Фото 4аб.

Больной И. , 27 лет, история болезни (ИБ) N 689. DS: синдром поликистозных яичников. Подозрение на гипергонадотропный гипогонадизм. На фото 4аб присутствуют кристаллы ФСГ (а, б), папоротникообразной формы и платообразно-разветвленные дендриты (а).

Технология.

При поступлении в стационар из пальца руки капилляром Панченкова взяли кровь - 0.08 мл, отцентрифугировали. Капли СК объемом 0.02 мл (6) нанесены на предметное стекло, протертое замшей, каждое накрыто покровным стеклом. Пробу поместили в термостат для сушки на 1 ч при T = 38^oC и затем микроскопировали. Обнаружены папоротникообразные кристаллы (повышен уровень ФСГ) и платообразно-разветвленные дендриты.

Одновременно произведено определение уровня ФСГ, его концентрация - 21 мМЕ/мл и уровня ЛГ - его концентрация - 19 мМЕ/мл (выше нормы).

Dиагноз гипергонадотропного гипогонадизма подтвердился (гиперсекреция фоллитропина и лютропина).

Пример 3. Фото 5аб.

Больной У. , 10 лет, ИБ N 839. DS: Крипторхизм двусторонний, подозрение на гипергонадотропный гипогонадизм. На фото 5аб присутствуют папоротникообразные кристаллы ФСГ.

Технология.

Из пальца руки капилляром Панченкова взяли кровь - 0.1 мл, отцентрифугировали.

Капли СК объемом 0.02 мл каждая (5) нанесли на предметное стекло, протертое замшей, каждая накрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат для сушки на 1 час при T = 38^oC, затем микроскопировали в проходящем свете. Обнаружены папоротникообразные кристаллы (повышение уровня ФСГ). Одновременно произведено определение уровня ФСГ (его концентрация повышена - 46 мМЕ/мл).

Диагноз гипергонадотропного гипогенитализма подтвердился (найдена гиперсекреция ФСГ, увеличение концентрации гормона в 9 раз, норма - 5.31 + 1.1 мМЕ/мл).

Пример 4. Фото 6 аб.

Больная А., 52 лет ИБ N 594. DS: Климактерический синдром.

Подозрение на гипергонадотропный гипогенитализм (гиперсекрецию ФСГ и ЛГ).

На фото 6а присутствуют папоротникообразные кристаллы фоллитропина (ФСГ) и широкоразветвленные дендриты (лютропин, ЛГ).

Технология.

Из пальца руки больной А. взята кровь капилляром Панченкова - 0.06 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0.01 мл каждая (6) нанесены на предметное стекло, протертое замшей, каждая покрыта покровным стеклом. Образец поместили в термостат для сушки на 1.5 часа при T = 37^oC, затем исследовали под микроскопом в проходящем свете. Найдены папоротникообразные кристаллы фоллитропина и широкоразветвленные дендриты. Одновременно исследован уровень ФСГ и ЛГ в сыворотке крови, который оказался повышенным соответственно 9.0 мМЕ/мл и 11 мМЕ/мл. Гиперсекреция ФСГ и ЛГ подтвердилась (DS: гипергонадотропный гипогенитализм подтвердился).

Пример 5. Фото 7а-в.

Больная Б. , 16 лет, ИБ N 1189. DS: кистозные изменения в яичниках. Подозрение на гипергонадотропный гипогенитализм (гиперсекрецию ФСГ и ЛГ).

На фото 7 а-в присутствуют папоротникообразные кристаллы ФСГ (а, б), широко- и платообразно-разветвленные дендриты (а, б, в) (лютропин, ЛГ).

Технология.

Из пальца руки больной Б. взята кровь - 0.1 мл капилляром Панченкова, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0.01 мл каждая (5) нанесены на предметное стекло, протертое замшей, каждая покрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат для сушки на 1.5 часа при T = 37^oC, затем микроскопировали.

Обнаружили папоротникообразные кристаллы фоллитропина (ФСГ), дендриты: широко- и платообразно-разветвленные (ЛГ). Уровень ФСГ и ЛГ повышен (23 мМЕ/мл и 32 мМЕ/мл). Найдена гиперсекреция гонадотропинов (фоллитропина и лютропина).

Диагноз гипергонадотропный гипогонадизм подтвердился.

Пример 6. Фото 8аб.

Больной К. , 14 лет, ИБ N 11231, DS: Идиопатический гипогенитализм. Подозрение на гипергонадотропный гипогонадизм.

На фото 8 аб присутствуют кристаллы папоротникообразный (а), широко- и платообразно-разветвленные дендриты (б).

Технология.

Из пальца руки больного К. при поступлении в стационар капилляром Панченкова взято 0.08 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0.02 мл каждая (5) нанесены на предметное стекло, протертое замшей, каждая покрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат для сушки на 1.5 часа при T = 38^oC, затем микроскопировали.

Найдены папоротникообразные кристаллы (повышение ФСГ) и дендриты (кристаллы) широко- и платообразно-разветвленные (повышение ЛГ). Одновременно определили уровень ФСГ и ЛГ, он оказался повышен (42 мМЕ/мл и 39 мМЕ/мл). Обнаружена гиперсекреция гонадотропинов.

Диагноз гипергонадотропный гипогонадизм подтвердился.

Пример 7. Фото 9аб.

Больная В., 38 лет, ИБ N 1296. DS: синдром Штейн-Левенталя (склерокистоз яичников).

Подозрение на гиперсекрецию ФСГ и ЛГ, на ранний климакс.

На фото 9аб присутствуют кристаллы: папоротникообразные (а), дендриты: широко- и платообразно-разветвленные.

Технология.

Из пальца руки больной В. капилляром Панченкова взято 0.08 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК объемом 0.02 мл (6) нанесены на предметное стекло, протертое замшей, каждая покрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат для сушки на 1.5 часа при T = 37^oC, затем микроскопировали.

Найдены кристаллы ФСГ - папоротникообразные, кристаллы ЛГ - дендриты: широко- и платообразно-разветвленные. Одновременно определили уровень ФСГ и ЛГ, они оказались повышенным - 42 мМЕ/мл и 78 мМЕ/мл.

Диагноз преждевременного климакса подтвердился (гиперсекреция ФСГ и ЛГ).

Преимущество предлагаемого способа:
1. Упрощение операции подготовки биологического материала для исследования.

2. Отсутствие мышиных мониклонильных антител и химических веществ (пероксидазы хрена, соли перкислоты), отсутствие лиофилизированной бычьей сыворотки.

3. Отсутствие анализатора для считывания сигналов.

4. Нет необходимости в защитной одежде.

5. Не требуется сигнального и моющего реагента Амерлайт и комплекта для пуска система Амерлайт.

6. Экономические преимущества.

Предлагаемый способ апробирован в клинических условиях - свыше 2000 примеров.

Выделены модели "ин витро" из сыворотки крови человека, страдающего гипергонадотропным гипогенитализмом (врожденным и приобретенным). Картины кристаллизации в моделях обусловлены перенасыщением сыворотки крови фоллитропином (ФСГ - фолликуло-стимулирующий гормон) и лютропином (ЛГ-лютеинизирующий гормон).

Медико-социальный эффект.

Применение способа позволяет повысить достоверность полученных результатов, значительно снизить трудозатраты, упростить способ определения гиперсекреции ФСГ и ЛГ, проводить экспресс-диагностику.

Изобретение относится к медицине, биологии, физиологии, генетике, лабораторной диагностике. Способ осуществляют путем высушивания капель сыворотки крови между двумя стеклянными пластинками в контролируемых условиях с последующим микроскопированием в проходящем свете. При наличии в образцах папоротникообразных кристаллов диагностируют гиперсекрецию фоллитропина (ФСГ), при наличии дендритов широко- и платообразно-разветвленных диагностируют гиперсекрецию лютропина (ЛГ). Способ позволяет повысить достоверность контроля за гиперсекрецией ФСГ и ЛГ, снижает трудозатраты. Способ прост в исполнении и может быть использован для экспресс-диагностики гипергонадотропного гипогенитализма (врожденного и приобретенного). 9 ил.

Способ диагностики гиперсекреции фоллитропина и лютропина путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при Т=+37-38^oС, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате папоротникообразных кристаллов определяют гиперсекрецию фоллитропина, при наличии кристаллов - дендритов: широко- и платообразно-разветвленных - гиперсекрецию лютропина.