СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕРАЦЕТИЛХОЛИНЕМИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, биологии, физиологии, биофизике и может быть использовано для качественного экспресс-определения гиперацетилхолинемии.

Ацетилхолин (Ах) - биогенный амин - играет важную роль в жизнедеятельности организма, передает первичное возбуждение в ЦНС, в вегетативной системе, в окончаниях парасимпатических и двигательных нервов.

Периферическое действие Ах проявляется в замедлении сердечных сокращений, расширении периферических кровеносных сосудов, снижении АД, усилении перистальтики желудка и кишечника, сокращении мускулатуры бронхов, матки, желчного и мочевого пузыря, усилении секреции пищеварительных, бронхиальных, потовых и слезных желез, сужении зрачка.

Действие Ах на бронхи стимулирует рефлекторный ответ гладкой мускулатуры. Этот медиатор раздражает М-холинорецепторы гладкой мускулатуры бронхов. Эффект бронхоспазма наблюдается при аллергических реакциях, астме (Белоусов Ю.Б. с соавт. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М., 1993, с.208-209, 217).

Ах служит медиатором нервных импульсов в холинергических синапсах. У человека Ах участвует в регуляции функционального состояния ЦНС, двигательной функции скелетной и гладкой мускулатуры. Доказано участие Ах в регуляции функционального состояния различных органов (сердце, легкие, железы внутренней секреции).

В настоящее время существуют биологические и химические способы определения Ах.

Биологические способы определения Ах объединяются своим конечным этапом - количественным определением Ах на изолированном гладкомышечном тест-органе (прямая мышца живота, легкое и сердце лягушки, тонкая кишка морской свинки, спинная мышца пиявки).

Биологический метод определения Ах (Винницкая К.Б., Большакова Т.Д., Семушкин Б.В. Лаб. дело, 1984, 2, с.115-118).

Определение Ах биологическим способом имеет ряд недостатков: недостаточная воспроизводимость, малая надежность, трудность определения Ах в присутствии других медиаторов.

Химические способы определения содержания Ах условно разделяются на 3 группы:
- энзиматические
- газохроматографические
- спектрометрические
(Розенгард В.И., Розенгард Е.В. Химические методы определения содержания ацетилхолина. Лаб. дело, 1972, 2, с.81-84).

Энзиматический метод заключается в том, что Ах изолируют из ткани с помощью электрофореза на бумаге и подвергают щелочному гидролизу. Образующийся холин ацетилируют ацетил-коэнзимом А, меченным С¹⁴ в ацетильной группе. Процесс осуществляют с помощью очищенного препарата холинацетилтрансферазы из мозга мышей. В результате образуется Ах-С¹⁴, количество которого линейно зависит от концентрации Ах в исследуемой ткани, затем производится радиометрическое определение Ах-С¹⁴.

Газохроматографический способ заключается в том, что Ах количественно переводят в какое-либо летучее соединение, содержание которого с высокой точностью может быть определено с помощью газового хроматографа, например, экстракт Ах из ткани мозга (смесью уксусной кислоты и этанола, выпаривают досуха, обрабатывают боргидридом калия, который восстанавливает образующуюся при распаде Ах уксусную кислоту до этанола). Количество последнего определяют с помощью газового хроматографа.

Спектрометрический способ заключается в том, что Ах осаждают в виде комплекса с йодом, избирательно сорбируют на колонке из ионообменной смолы BioRex, затем обрабатывают гидразином. Образовавшийся ацетилгидразин эмульгируют и воздействуют на него салициловым альдегидом. Продукт конденсации интенсивно флюоресцирует.

Недостатки указанных способов заключаются в:
- глубоком нарушении нативности исследуемого материала,
- в использовании дорогостоящих приборов - радиометрической установки, газового хроматографа, спектрофотометра.

Нами в качестве прототипа использован биологический суперфузионный способ определения Ах, основанный на применении суперфузионной установки, термостатированной бани и специальной регистрационной аппаратуры (Винницкая К.Б., Большакова Т.Д., Семушкин Б.В. Лаб. дело, 1984, 2, с.115-118).

В основе способа лежит стандартизированное и унифицированное определение Ах в крови, путем ее пропускания через тест-орган (препарат спинной мышцы пиявки).

Способ включает 2 этапа:
1 этап:
После пропускания через орган серии стандартизованных растворов Ах в концентрации 10^-8; 2,5•10^-8; 5•10^-8; 10^-7; 2,5•10^-7; 5•10^-7 строят сигмовидную калибровочную кривую.

Затем на орган подают исследуемую биологическую жидкость и в зависимости от ответа органа по калибровочной кривой определяют концентрацию Ах в ней.

2 этап - уточнение концентрации Ах
В зависимости от приблизительной концентрации Ах в исследуемой жидкости через орган пропускают растворы Ах в концентрации ниже и выше найденной. Затем сравнивают ответы тест-органа на эти различные концентрации Ах.

Ход исследования:
1. Препарат спинной мышцы пиявки разделяют продольно, прошивают ниткой.

2. Орган суперфузируют раствором Рингера при t=27^oC.

3. Спустя 1 час начинают определять ответ тест-органа на введение стандарта Ах в концентрации 10^-5 М.

4. Определяют сокращение тест-органа через 1 час после введения стандарта Ах в концентрации 10^-8 М, приготовленного растворенным 0,1 мл Ах 10^-6 М рингеровским раствором, содержащим физостигмин.

5. Исследуемую кровь разводят в 5 раз рингеровским раствором, содержащим физостигмин. Регистрация сокращения каждой пробы должна проводиться 2 мин.

6. Построение графика.

Реактивы:
- раствор Рингера, 10% CaCl₂,
- глюкоза 40%,
- стандарт Ах хлорида 10^-5 М, 10^-7 М, 5•10^-7 М, 10^-8 М,
- физостигмин.

Недостатки способа:
- Использование изолированного тест-органа - спинная мышца пиявки (доставка пиявок, их препарация).

- Применение фармакологических агентов.

- Наличие аппаратуры для поддержания оптимальных условий жизнедеятельности изолированного тест-органа.

- Нарушение нативности биологической жидкости при проведении этапов исследования.

- Сложность практического исполнения.

- Длительность выполнения.

Задачи предлагаемого изобретения
- Повышение достоверности показаний контроля за ходом определения наличия ацетилхолина в биологической жидкости - сыворотке крови.

- Повышение информативности.

- Упрощение способа и снижение стоимости.

- Экспресс-диагностика гиперацетилхолинемии.

- Упрощение приготовления пробы.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения гиперацетилхолинемии сыворотку крови исследуемого лица наносят на кварцевую подложку толщиной 10 мм, накрывают покровным стеклом, сушат при температуре 37-38^oС на протяжении 1,5-2 ч, выдерживают на открытом воздухе 3-4 ч, затем исследуют в проходящем свете и при наличии скелетных кристаллов: клиновидных - узких, широких, определяют гиперацетилхолинемию.

Способ осуществляют следующим образом:
1. Для забора берут кровь из вены - 3,0 мл натощак.

2. Полученный объем крови центрифугируют 5 мин для получения сыворотки.

3. Сыворотку в виде капель объемом 0,01-0,02 мл каждая наносят тарированной пипеткой на кварцевую подложку толщиной 10 мм, накрывают покровным стеклом.

4. Высушивают в термостате при 37-38^oС на протяжении 1,5-2 ч.

5. Выдерживают на открытом воздухе 1,5-2 ч.

6. Под микроскопом в проходящем свете изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате скелетных кристаллов: клиновидных - узких и широких, определяют гиперацетилхолинемию.

Нами предварительно были смоделированы эталоны - кристаллограммы (модульные композиты), приготовленные из сыворотки крови здорового человека, обогащенной рабочими растворами, содержащими известные концентрации ацетилхолина. Для этого сыворотку крови соединяли с рабочими растворами ацетилхолина и инкубировали 40 мин в кварцевой кювете при 37^oС. Затем капли коарцевата (смеси) наносили на кварцевую подложку, накрывали покровными стеклами, сушили 1,5-2 ч в термостате, выдерживали на открытом воздухе 1,5-2 ч и микроскопировали в проходящем свете.

Приводим кристаллограммы (Кг) модельных композитов (МК) (фиг. 1 а,б).

На фиг. 1 а,б представлен МК сыворотки здорового человека, обогащенной ацетилхолином. Присутствуют скелетные кристаллы: широкие (б). Концентрация ацетилхолина соответственно составила 160 нмоль/л и 180 нмоль/л.

Наши экспериментальные исследования проведены на 1780 наблюдениях.

ПРИМЕРЫ:
Пример 1, фиг. 2 а, б. Больная А., история болезни (ИБ) 2134. Диагноз: Хроническая рецидивирующая крапивница. На фиг. 2 а, б приведена КГ сыворотки крови (СК) больной при поступлении в отделение. Присутствуют скелетные кристаллы: клиновидные, узкие (а) и клиновидные, широкие (б).

Технология: Из вены больной взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,02 мл каждая. Нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 38^oС на протяжении 1,5 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 3 ч и исследовали в проходящем свете. Найдены скелетные кристаллы ацетилхолина: клиновидные - узкие и широкие, одновременно в СК определили уровень ацетилхолина, который оказался повышен и составил 165 нмоль/л, норма - 148 нмоль/л гиперацетилхолинемия, обусловленная хронической рецидивирующей крапивницей, подтвердилась.

Пример 2, фиг. 3 а, б. Больная М., История болезни 2139. Диагноз: Бронхиальная астма (аллергическая). На фиг. 3 а, б приведены КГ СК больной при поступлении в отделение. Присутствуют скелетные кристаллы ацетилхолина - клиновидные, узкие (а) и клиновидные, широкие (б).

Технология: из вены больной М. взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (3) объемом 0,01 мл каждая, нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 37^oС на протяжении 2 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 4 ч, изучили в проходящем свете. Найдены скелетные кристаллы ацетилхолина: клиновидные, узкие и широкие. Одновременно в СК определили уровень ацетилхолина (Ах), который оказался повышен и составил 172 нмоль/л (норма 148 нмоль/л). Гиперацетилхолинемия, обусловленная аллергической астмой, подтвердилась.

Пример 3, фиг. 4 а, б. Больной К., История болезни 19816. Диагноз: Болезнь Паркинсона. На фиг. 4 а, б приведена КГ СК больного при поступлении. Присутствуют клиновидные кристаллы: узкие (а) и широкие (б).

Технология: из вены больного К. взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (5) объемом 0,01 мл каждая нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 37^oС на протяжении 2 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 4 ч и исследовали в проходящем свете. Найдены клиновидные кристаллы ацетилхолина - узкие и широкие. В СК одновременно определили уровень Ах, который оказался повышенным и составил 178 нмоль/л, при норме 148 нмоль/л. Гиперацетихолинемия, обусловленная болезнью Паркинсона, подтвердилась.

Пример 4, фиг. 5 а, б. Больной Ж., история болезни 18938. Диагноз: Приступ желчекаменной болезни. На фиг. 5 а, б приведены КГ СК больной при поступлении в отделение. Присутствуют клиновидные узкие кристаллы (а, б).

Технология: из вены больного взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,02 мл каждая нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 37^oС на протяжении 2 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 3 ч и исследовали в проходящем свете. Найдены клиновидные кристаллы ацетилхолина - узкие. Одновременно в СК определили уровень Ах, который оказался повышенным и составил 176 нмоль/л, при норме 148 нмоль/л. Гиперацетихолинемия, обусловленная приступом желчекаменной болезни, подтвердилась.

Пример 5, фиг. 6 а, б. Больная Н., история болезни 31456. Диагноз: Рецидивирующий отек Квинке. Поливалентная лекарственная аллергия. На фиг. 6 а, б приведена КГ СК больной при поступлении. Присутствуют клиновидные узкие (а) и клиновидные широкие (б) кристаллы.

Технология: из вены больной Н. взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (3) объемом 0,01 мл каждая нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 37^oС на протяжении 1,5 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 4 ч и исследовали в проходящем свете. Найдены клиновидные кристаллы ацетилхолина - узкие и широкие. Одновременно в СК определили уровень Ах, который оказался повышенным и составил 176 нмоль/л, при норме 148 нмоль/л. Гиперацетихолинемия, обусловленная рецидивирующим отеком Квинке, поливалентной лекарственной аллергией, подтвердилась.

Пример 6, фиг. 7 а, б. Больной Ц., история болезни 1139. Диагноз: Кластерная мигрень. На фиг. 7 а, б приведена КГ СК больного после сеанса акупунктурной аналгезии. Присутствуют клиновидные узкие (а) и широкие (б) кристаллы.

Технология: из вены больного Ц. взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,02 мл каждая нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 37^oС на протяжении 2 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 3 ч и исследовали в проходящем свете. Найдены клиновидные кристаллы ацетилхолина - узкие и широкие. Одновременно в СК определили уровень Ах, который оказался повышенным и составил 179 нмоль/л. Гиперацетихолинемия, обусловленная сеансом акупунктурной аналгезии, подтвердилась.

Пример 7, фиг. 8 а, б. Больная А., история болезни 14839. Диагноз: Астматический статус. На фиг. 8 а, б приведена КГ СК больного после сеанса акупунктурной аналгезии. Присутствуют клиновидные узкие (а) и широкие (б) кристаллы.

Технология: во время астматического статуса из вены больной взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,02 мл каждая нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 38^oС на протяжении 1,5 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 4 ч и исследовали в проходящем свете. Найдены клиновидные кристаллы ацетилхолина - узкие. Одновременно в СК определили уровень Ах, который оказался повышенным и составил 169 нмоль/л. Гиперацетихолинемия, обусловленная астматическим статусом, подтвердилась.

Пример 8, фиг. 9 а, б. Больная Ф., история болезни 1699. Диагноз: Поливалентная лекарственная аллергия. Отек Квинке. На фиг. 9 а, б приведена КГ СК больной во время поступления в отделение. Присутствуют клиновидные широкие кристаллы.

Технология: из вены больной Ф. взято 3 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (5) объемом 0,02 мл каждая нанесли на кварцевую подложку толщиной 10 мм, каждую каплю накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при 38^oС на протяжении 1,5 ч. Затем препарат выдержали на открытом воздухе 4 ч и изучили в проходящем свете. Найдены кристаллы ацетилхолина клиновидные широкие. Одновременно в СК определили уровень Ах, который оказался повышенным и составил 172 нмоль/л. Гиперацетилхолинемия, обусловленная отеком Квинке, подтвердилась.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике. Способ позволяет повысить достоверность и информативность определения гиперацетилхолинемии и упростить исследование. Сыворотку крови пациента наносят на кварцевую подложку толщиной 10 мм, накрывают покровным стеклом, сушат при 37-38^oС на протяжении 1,5-2 ч, выдерживают на открытом воздухе 3-4 ч, затем исследуют в проходящем свете и при наличии скелетных кристаллов: клиновидных - узких, широких, определяют гиперацетилхолинемию. 9 ил.

Способ определения гиперацетилхолинемии, отличающийся тем, что сыворотку крови исследуемого лица наносят на кварцевую подложку толщиной 10 мм, накрывают покровным стеклом, сушат при +37-38^oС на протяжении 1,5-2 ч, выдерживают на открытом воздухе 3-4 ч, затем исследуют в проходящем свете и при наличии скелетных кристаллов: клиновидных - узких, широких, определяют гиперацетилхолинемии.