СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИПЕРДОФАНЕМИИ И ГИПЕРСЕРОТОНЕМИИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, биологии, физиологии, биофизике и лабораторной диагностике. При различных стрессорных воздействиях в процессе адаптации организма для снижения концентрации катехоламинов, действующих на органы-мишени, происходит активация стресс-лимитирующей системы (СЛС) (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам. М., 1988, с. 92-107).

Основная задача СЛС заключается в модуляции эффектов симпатоадреналовой, вагоинсулярной, гипофизарно-адренокортикальной и ренинацгиотеизин-альдостероновой системы (Меерсонг Ф. 3. Адаптация к стрессорным ситуациям и стресс-лимитирующие системы организма // Физиология адаптационных процессов. - М.: Наука, 1986, с. 521 -621).

Центральные механизмы активации стресс-лимитирующей системы (СЛС) осуществляются за счет увеличения синтеза в головном мозге медиаторов - дофамина и серотонина, что сопровождается повышением их концентрации в крови.

СЛС - серотонинэргическая и дофаминэргическая, мобилизуясь, ограничивают возбуждение адренэргических центров (Antonaccio М., Robson R. Cardiovascular effects of 5-hydroxi-triptophan in anesthetized dogs //. J.Phann.-Pharmacol. - 1973. - Vol 25. p. 495) и тем самым лимитируют стресс-реакцию, например исчезает боль.

Важность ранней диагностики указанного адаптационного сдвига особенно актуальна, так как компенсаторные увеличения концентрации дофамина и серотонина предотвращают целый ряд угрожающих состояний для организма человека (инфаркт, инсульт, образование язв, купирование болевого синдрома, вегетативные кризы, стрессорную депрессию противоопухолевого иммунитета и т.д. (Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактики. - М.: 1981.- 278 с.)
Следует подчеркнуть, что активация стресс-лимитирующей системы развивается к самым разным факторам среды. Метаболиты этой системы - серотонин и дофамии обладают широким спектром адаптивных, защитных и аналгетических эффектов. Борьба с болью до настоящего времени продолжает оставаться одной из актуальных и трудных проблем биологии и медицины.

На передний план выдвигается нейрофизиологичсский аспект купирования болей, воздействие на нейрохимические процессы (Брагин Е.О. Системные нейрохимические механизмы регуляции болевой чувствительности // Теория и практика рефлексотерапии. -Л.: 1984, с. 8-9).

Процессы серотонинэргической и дофаминэргической медиации играют ключевую роль в регуляции иммунной, гормональной, ониоидной систем. Ранняя диагностика гипердофанемии и гиперсеротонемии позволяет предотвратить церебральную и сердечно-сосудистую катастрофу, позволит обнаружить патологическую поломку гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, пристрастие к наркотикам.

Известны различные способы (аналоги) определения гипердофанемии и гиперсеротенемии, например способ анальгетического эффекта акупунктуры (выброс дофамина и серотонина после сеанса акупунктуры (Nikol M., 1973 в кн.: Игнатов Ю.В. с соав. Акупунктурная аналгезия. - М.: 1990, с. 164), способ газо-жидкостной хроматографии (Энциклопедия клинических лабораторных тестов. - М. : 1997, с. 415; Химия. Справочное руководство. Ленинг. отд. 1975, раздел ФХ. 4), способ аналгетического эффекта (способ сенсорной детекции) - обнаружение сигналов испытуемого в зависимости от воздействия и предубежденности в ответе (используется два показателя - физиологический и психологический, способность испытуемого к различению антиболевых сигналов).

Недостатки способа;
- суггестивный подход к анальгетическому эффекту акупунктуры, преднамеренность ответов, роль психологического фактора;
- громоздкость исполнения способа.

Способ газо-жидкостной хроматографии основан на законе распределения Нернста (равновесие распределения вещества между двумя жидкими формами).

Этапы выполнения:
Пропитанное высококипящей жидкостью вещество-носитель помещается в узкую длинную колонку.

1. В начало подогреваемой колонки впрыскивается небольшое количество исследуемой смеси, содержащей нейромедиаторы, переходящей в парообразное состояние.

2.Проявление хромотограммы путем пропускания водорода или гелия.

3.Использование детекторов (ячеек для измерения теплопроводности).

Недостатки способа:
- использование дорогостоящего оборудования (колонка);
- нарушение нативности препарата (сыворотки, плазмы, ликвора, содержащих нейромедиаторы - дофамин и серотонин);
- применение водорода или гелия.

Нами в качестве прототипа использован флюорометрический способ определения серотонина и дофамина (Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. Под ред. Меньшикова В.В. М., 1987, с. 258-261; Комаров Ф.И., Коровник Б. Ф. , Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. - М.: 1976, с. 318-319; Колб ВТ., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск, 1976, с. 248-250).

Сущность способа состоит в измерении флюоресценции светящихся продуктов, образовавшихся в результате реакции. Флюорометрический способ включает 3 основных этапа:
1) сбор и хранение материала;
2) выделение из него нейромедиаторов (серотонина и дофамина);
3) их дифференцированное количественно определение.

Способ определения серотонина
(Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. Под ред. Меньшикова В.В. - М.: 1987, с.258-261).

Ход определения:
1. Кровь берут в пробирку с 1,34%-ным раствором оксалата натрия в соотношении 1:10.

2. К 1 мл крови приливают 1 мл воды и 1 мл 1н. хлорной кислоты, перемешивают и через 30 мин центрифугируют.

3. К 2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 5н. NaOH, 1г порошка хлорида натрия и 4 мл бутанол-хлироформенной смеси, встряхивают 3 мин, а затем центрифугируют для разделения слоев.

4. Водную фазу удаляют, а к органической добавляют 2 мл 0,1 н. NaOH, встряхивают и центрифугируют.

5. 3,5 мл органической фазы переносят в другие пробирки, где экстрагируют 2,5 мл 0,1 н. HСl.

6. К 1 мл кислотной фазы добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 8,0 и 0,2 мл 0,1 М раствора нингидрина.

7. Смесь инкубируют 30 мин при температуре 75^oС, выдерживают 1 ч при комнатной температуре, доводят объем до 5 мл и измеряют флюоресценцию в области 490 нм при возбуждении светом с длиной волны 365 им.

8. Для калибровки берут пробы, содержащие по 0,05 л 0,1 мкг серотонина, доводят водой до объема 1.5 мл и добавляют 0,5 мл 1 н. хлорной кислоты.

9. В холостой опыт берут 1,5 мл воды и 0,5 мл 1 н. хлорной кислоты. Свечение холостой пробы вычитают из результатов, полученных для опытных и калибровочных проб.

10. Калибровочную и холостую пробы экстрагируют бутанол-хлороформенной смесью после добавления 0,2 мл 5 н. NaOH.

11. Расчет производят по калибровочному графику, по данным которого рассчитывают содержание серотонина в пробе.

Недостатки способа:
1. Наличие химических реактивов.

2. Приготовление точных калибровочных проб.

3. Нарушение нативности препаратов.

4. Наличие дорогостоящего оборудования.

5. Трудоемкость процедуры.

Способ определения дофамина
(Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. - М.: 1976, с. 318-319; Колб B.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск, 1976, с. 248-250).

Ход определения:
1. Для исследования берут 25-30 мл крови, помещают в охлажденный на льду центрифужный стаканчик, содержащий смесь раствора хлористого натрия, гепарина и ЭДТА. После добавления равного объема 8% раствора хлорной кислоты кровь оставляют на холоде в течение 30 мин и затем центрифугируют.

2. Элюция дофамина из крови:
- через хроматографическую колонку пропускают 0,25 н. уксусную кислоту.

3. Определение дофамина:
- уксусноокислый элтюат доводят до pН 16,2;
- окисляют 0,2 мл 0,02 н. йода;
- добавляют 0,5 мл щелочною сульфита;
- пробу облучают в течение 15 мин кварцевой лампой;
- измеряют флюоресценцию раствора в кварцевой кювете;
- используют первичный светофильтр с максимумом пропускания 360 нм и вторичный, имеющий максимум пропускания 436 нм;
- по формуле производят расчет.

Недостатки способа:
1. Нарушение нативности пробы.

2. Использование реактивов.

3. Применение дорогостоящего оборудования.

4. Трудоемкость процесса.

Все вышеизложенное затрудняет одномоментное определение концентрации дофамина и серотонина у одного и того же лица для ранней ситуационной диагностики гипердофанемии и гиперсеротонемии.

Задачи предлагаемого изобретения:
1. Повышение достоверности показателей контроля за состоянием стресс-лимитирующсй системы (выброс дофамина и серотонина).

2. Повышение информативности.

3. Упрощение способа и снижение стоимости.

4. Экспресс-диагностика гипердофанемии и гиперсеротонемии.

5. Упрощение приготовления пробы.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения гипердофанемии и гиперсеротонемии сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при температуре 137-38^oС на протяжении 1,5-2 ч, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате кристаллов штриховатой, радиально-лучевой, звездчатой формы определяют гипердофанемию; платообразных агрегатов - гиперсеротонемию.

Способ осуществляют следующим образом:
1. Для забора берут кровь из вены - 3,0 мл натощак.

2. Полученный объем центрифугируют 5 мин для получения сыворотки.

3. Сыворотку крови в виде капель объемом 0,01-0,02 мл каждая наносят тарированной пипеткой на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

4. Высушивают в термостате при температуре +37-38^oС на протяжении 1,5-2 ч.

Под микроскопом в проходящем свете изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате кристаллов штриховатой, радиально-лучевой, звездчатой формы определяют гипердофанемию; платообразных агрегатов гиперсеротонемию.

Нами предварительно были смоделированы эталонные кристаллограммы, приготовленные из рабочих растворов дофамина и серотонина, а также из сыворотки крови здорового человека, обогащенной рабочими растворами, содержащими дофамин и серотонин. Концентрация дофамина составила - 224, 240 и 270 мкг/c, серотонина - 250-410 н/моль.

Приводим кристаллограммы (КГ), полученные из рабочих растворов дофамина (фото 1) и серотонина (фото 2).

КГ дофамина представлены штриховатыми, радиально-лучевыми и звездчатыми агрегатами (фото 1).

КГ серотонина выполнены платообразными агрегатами (фото 2).

На фото 3 представлены КГ модельных композитов (МК) сыворотки крови, обогащенной раствором дофамина. Присутствуют штриховатые, радиально-лучевые и звездчатые агрегаты. Концентрация дофамина соответственно -224,240 и 270 мкг/с.

На фото 4 представлены КГ МК сыворотки крови здорового человека, обогащенной серотонином. Присутствуют платообразные агрегаты. Концентрация cepoтoнинa 250 и 410 н/моль.

Экспериментальные исследования подтверждены 1980 наблюдениями.

Примеры
Пример 1, фото 5 а,б. Б-ной А., 56 лет; диагноз: паркинсонизм; истории болезни (ИБ) 1379. На фото 5 а,б приведена КГ сыворотки крови б-го при поступлении в отделение. Присутствуют штриховатые, радиально-лучевые (а) и звездчатые агрегаты (б).

Технология: из вены б-го взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,01-0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +37-38^oС на протяжении 1,5 часов. Затем препарат исследовали в проходящем свете. Обнаружены кристаллы дофамина - штриховатые, радиально-лучевые и звездчатые агрегаты. Одновременно в СК определяли уровень дофамина, который оказался повышенным и составил 260 мкг/с (норма - 218 ± 0,36 мкг/с). Гипердофанемия, обусловленная заболеванием, подтвердилась.

Пример 2, фото 6. Б-ная К., 40 лет. Диагноз: распространенный остеохондроз с болевым синдромом; истории болезни 4391. На фото 6 представлена КГ сыворотки крови больной после акупунктуры. Присутствует платообразный агрегат серотонина.

Технология определения: из вены больной взято 3,0 мл кроки, которая отцентрифугирована. Капли СК (5) объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +37-38^oС на протяжении 2 ч. Затем препарат исследовали под микроскопом в проходящем свете. Найдены платообразные агрегаты серотонина. Одновременно в СК определяли уровень серотонина, который оказался повышен и составил 249 н/моль, норма - 236 ±0,18 н/моль. Гиперсеротонемия, вызванная акупунктурой, подтвердилась.

Пример 3, фото 7. Б-ной Б., 49 лет. Диагноз: ИБС, стенокардия напряжения; истории болезни 3198. На фото 7 представлена КГ сыворотки крови, видны радиально-лучевые кристаллы дофамина.

Технология определения: из вены больной взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (3) объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +38^oС на протяжении 1,5 ч. Образец микроскопировали в проходящем свете. Найдены радиально-лучевые кристаллы дофамина. Одновременно в СК определяли уровень дофамина, он оказался повышен и составил 250 мкг/с, норма - 218 ± 0,36 мкг/с. Выброс дофамина во время приступа стенокардии подтвердился.

Пример 4, фото 8 а,б.. Б-ная И., 48 лет. Диагноз: климактерический синдром. Пременопауза: истории болезни 4318. На фото 8 а,б приведены КГ сыворотки крови, видны платообразные агрегаты (а), штриховатые кристаллы (б).

Технология определения: из вены больной взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (5) объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +37^oС на протяжении 1,5 ч. Затем образец микроскопировали в проходящем свете. Найдены платообразные агрегаты серотонина и штриховатые кристаллы дофамииа. Одновременно в СК определяли уровень этих веществ, который оказался повышенным и составил - серотонин - 270 н/моль (норма - 236 ±0,18 н/моль), дофамии - 226 мкг/с (норма - 218±0,36 мкг/с). Выброс дофамина и серотонина, обусловленный климактерическим синдромом, подтвердился.

Пример 5, фото 9. Б-ной В., 50 лет. Диагноз; инфаркт миокарда (острый период): истории болезни 3819. На фото 9 приведена КГ сыворотки крови, присутствуют штриховатые кристаллы и звездчатый кристалл.

Технология: из вены больного взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (4) объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +38^oС на протяжении 2 ч. Исследовали в проходящем свете. Найдены кристаллы дофамина штриховатые и звездчатые. Одновременно в СК определяли уровень дофамина, который оказался, повышен и составил 260 мкг/с (норма - 218 ± 0,36 мкг/с). Гипердофанемя, обусловленная острым периодом инфаркта миокарда, подтвердилась.

Пример 6, фото 10 а,б. Б-ной 3.,42 года. Диагноз: плечевой посттравматический плексит; истории болезни 1628. На фото 10 а,б приведены КГ сыворотки крови, полученной после сеанса акупунктуры, присутствуют платообразные агрегаты (а), радиально-лучевые и штриховатые кристаллы (б).

Технология определения: из вены больного взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (5) объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +38^oС на протяжении 2 ч. Образец микроскопировали в проходящем свете. Найдены платообразные агрегаты серотонина и радиально-лучевые и штриховатые кристаллы дофамина. Одновременно в СК определяли уровень этих веществ, который оказался повышенным и составил - серотонин -263 н/моль (норма - 236±0,18 н/моль), дофамин - 258 мкг/с (норма - 218±0,36 мкг/с). Гиперсеротонемия и гипердофанемия, обусловленные выбросом нейромедиаторов после сеанса акупунктуры, подтвердились.

Пример 7, фото 11. Б-ная М., 38 лет. Диагноз: подозрение на феохромоцитому; истории болезни 1539. На фото 11 представлен звездчатый кристалл.

Технология: из вены больной взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (б) объемом 0,01 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +37^oС на протяжении 1,5 ч. Образец микроскопировали в проходящем свете. Найдены звездчатые кристаллы дофамииа. Одновременно в СК определяли уровень дофамина, который оказался повышенным и составил 278 мкг/с (норма 218 ± 0,36 мкг/с). Гипердофанемия, обусловленная феохромоцитомой, подтвердилась.

Пример 8, фото 12. Б-ная Ж., 53 года. Диагноз: климактерический синдром; истории болезни 1695. На фото 12 представлены радиально-лучевые и штриховатые кристаллы.

Технология определения: из вены больной взято 3,0 мл крови, которая отцентрифугирована. Капли СК (3) объемом 0,02 мл каждая нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при температуре +38^oС на протяжении 1,5 ч. Образец микроскопировали в проходящем свете. Найдены радиально-лучевые и штриховатые кристаллы дофамина. Одновременно в СК определяли уровень дофамина, который оказался повышенным и составил 249 мкг/с (норма - 218±0,36 мкг/с). Гипердофанемия, обусловленная климактерическим синдромом, подтвердилась.

Преимущества предлагаемого способа
1. Упрощение операции подготовки биологического материала для исследования.

2. Отсутствие технического дорогостоящего оснащения, приборов, реактивов для количественного определения дофамина и серотонина.

3. Экономические преимущества.

4. Экспресс-диагностика.

Медико-социальный эффект
Применение способа позволяет повысить достоверность полученных результатов, значительно снизить трудозатраты, упростить способ определения гипердофанемии и гиперсеротонемии, осуществлять экспресс-диагностику выброса нейромедиаторов.

Изобретение относится к медицине, биологии, биофизике, физиологии и лабораторной диагностике и может быть использовано для качественной экспресс-диагностики гипердофанемии и гиперсеротонемии. Способ включает высушивание капель сыворотки крови между двумя стеклянными пластинками в контролируемых условиях с последующим микроскопированием в проходящем свете. При наличии в препарате кристаллов: штриховых, радиально-лучевых и звездчатых определяют гипердофанемию, платообразных агрегатов - гиперсеротонемию. Способ прост в использовании, может быть использован для ранней диагностики предпатологических и патологических и физиологических состояний, обусловленных выбросом дофамина и серотонина. 12 ил.

Способ определения гипердофанемии и гиперсеротонемии, отличающийся тем, что сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при температуре 37-38^oС, микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате кристаллов - штриховых, радиально-лучевых, звездчатых определяют гипердофанемию, платообразных агрегатов - гиперсеротонемию.