СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ РИСКА НАРУШЕНИЙ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНА/ПЛОДА И РОЖДЕНИЯ РЕБЕНКА С РАЗЛИЧНОЙ НЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 G01N33/535 

Настоящее изобретение относится к области медицины, биохимии, иммунологии, акушерства и гинекологии, неонатологии, педиатрии.

В настоящее время участие иммунной системы в регуляции течения беременности и развитии эмбриона/плода не вызывает сомнений. Целый спектр иммунологических параметров связан с важными характеристиками репродуктивной функции женщин. Известно, что изменения показателей иммунной системы могут быть наиболее ранними признаками тех неблагоприятных изменений в организме женщины, которые пагубно влияют на течение самой беременности и развитие эмбриона и плода (Замалеева Р.С. и соавт., 2017; Цахилова С.Г. и соавт., 2016). Эти изменения могут быть индуцированы самыми разными эндогенными и экзогенными причинами. (Замалеева Р.С. и соавт., 2013; Marks K. Et al., 2020; Полетаев А.Б. и соавт., 2016). В то же время конкретные механизмы участия иммунной системы в процессах гестации и закладки органов и тканей эмбриона и плода во многом остаются неясными (Нефедова Д.Д. и соавт., 2013; Сотникова Н.Ю. и соавт., 2013; Абламуниц В.Г., 2016; Зубовская Е.Т. и соавт., 2018).

В норме иммунная система человека продуцирует антитела не только к чужеродным, но и практически ко всем собственным антигенам, т.е. аутоантитела (аАТ), которые участвуют практически во всех процессах, происходящих в организме. В условиях нормы сывороточное содержание аутоантител поддерживается в определенных границах. Патологическое повышение или снижение уровней аАТ может вести к различным патологическим состояниям. Изменения продукции аАТ различной специфичности могут быть следствием влияния как различных внешних, так и внутренних факторов (экологические факторы, стрессы, инфекции, эндокринно-метаболические нарушения и др.). (Полетаев А.Б. и соавт., 2016; Racanelli V., et. al., 2011; Atassi M.Z., et al., 2008). Причем эти изменения могут касаться и тех аАТ, поддержание физиологических концентраций которых критически важно для физиологического течения беременности и нормального развития эмбриона/плода (Замалеева Р.С. и соавт., 2013; Полетаев А.Б. и соавт., 2015; Замалеева Р.С. и соавт., 2017). Так, по данным Макарова О.В. с соавт. (2012), определение сывороточного уровня аАТ класса IgG к двуспиральной ДНК, антигенам мембран тромбоцитов (ТгМ-001-15; ТгМ-015-12), антигенам почек (KiM-05-300, KiS-07-120) и антигену митохондрий печени (НММР) существенно помогает в дифференциальной диагностике преэклампсии и хронических гипертензивных состояний у женщин в сроки 24-36 недель беременности, дает возможность прогнозировать развитие и тяжесть преэклампсии за 2-4 недели до появления ее первых клинических симптомов, и таким образом, принятие соответствующих мер позволяет улучшить перинатальные исходы, снизить материнскую и младенческую заболеваемость и смертность. Тесная взаимосвязь гестационного процесса и развития эмбриона/плода с сывороточным содержанием определенных материнских аАТ класса IgG, трансплацентарно проникающих к плоду, сегодня не вызывает сомнений (Замалеева Р.С. и соавт., 2017; Спиридонова Н.В. и соавт., 2015; Полетаев А.Б. и соавт., 2015; Edmiston Е. et.al., 2017). Однако вопрос о том, какие именно аАТ следует определять для прогноза течения беременности и развития эмбриона/плода во многом остается открытым. Следует отметить, что встречаемость генетически обусловленных пороков развития не превышает 3-14% от всех врожденных пороков. Остальная врожденная патология обусловлена различными неблагоприятными изменениями в организме матери (Полетаев А.Б. и соавт., 2001).

Изложенное выше послужило основанием для создания тест-системы для определения содержания аАТ к фракциям молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS - damage associated molecular patterns), изменения сывороточного уровня/аффинности которых коррелируют с осложненным течением беременности, нарушениями развития эмбриона/плода и рождением ребенка с различной патологией.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является способ прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с различными отклонениями (Патент РФ №2233121, 27 июля 2004 г.). В основе данного метода лежит определение сывороточного уровня аАТ к фракциям анионных белков хроматина ткани мозга и/или мембранных белков мозга. По степени отклонения одного или нескольких определяемых показателей судят о прогнозе течения беременности и ее исходах в соответствии с приведенными таблицами прогноза.

В то же время совершенно очевидно, что аАТ не ко всем антигенам используемых фракций имеют большую значимость для такого прогноза, что снижает прогностическую значимость данного способа. Поэтому задачей авторов состояла в идентификации из используемых ранее фракций тех белковых маркеров, антитела к которым наиболее диагностически значимы для решения поставленной задачи по повышению прогностической значимости таких тест-систем. В отличие от известного способа скринингового обследования заявленный способ, заключающийся в определении содержания аАТ к фракциям молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), позволяет повысить точность прогнозирования течения беременности и развития эмбриона/плода.

В отличие от известного способа скринингового обследования предлагаемый нами способ, заключающийся в определении содержания аАТ к фракциям молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), позволяет повысить точность прогнозирования течения беременности и развития эмбриона/плода.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет тест-системы для определения уровня аутоантител, содержащей планшеты для иммуноферментного анализа с по меньшей мере одной сорбированной фракцией молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), отмывочный буфер, сыворотку - эталон, раствор конъюгата фермента с антителами к иммуноглобулинам класса G человека, раствор субстрата и стоп-раствор для остановки реакции,

Как вариант реализации заявленного изобретения, указанная тест-система может дополнительно включать сорбированный белок S100, а также основной белок миелина.

Как вариант, сорбированная фракция молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS) может являться фракцией белков, относящихся к негистоновым ядерным белкам (DAMPs-ACBP-C), а также фракцией белков, относящихся к мембранным белкам и/или белкам межклеточного матрикса (DAMPs-MP-C).

Также технический результат заявленного изобретения достигается за счет способа прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста на ранних сроках беременности или до беременности, включающего забор крови у пациентки, получения сыворотки, определение в полученной сыворотке содержания аутоантител и отличающегося тем, что, определяют содержание аутоантител к по меньшей мере одной фракции молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), и, при отклонении значения содержания определяемых аутоантител от эталонных значений более, чем на 20% в сторону повышения или более, чем на 25% в сторону снижения, делают вывод о повышенном риске осложнений течения беременности, нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с патологией.

Как вариант, указанный выше способ может дополнительно включать стадию определения содержание аутоантител к белку S100, и, при отклонении значения определяемых аутоантител от эталонных значений более, чем на 20% в сторону повышения или более, чем на 25% в сторону снижения, делают вывод о повышенном риске осложнений течения беременности, нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с патологией.

Как вариант, указанный выше способ может дополнительно включать определение содержания аутоантител к основному белку миелина и, при отклонении значения содержания определяемых аутоантител от эталонных значений более, чем на 20% в сторону повышения или более, чем на 25% в сторону снижения, делают вывод о повышенном риске осложнений течения беременности, нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с патологией.

Как вариант, в качестве фракции молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS) может быть использована фракция белков, относящихся к негистоновым ядерным белкам (DAMPs-ACBP-C).

Как вариант, в качестве фракции молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS) может быть использована фракция белков, относящихся к мембранным белкам и/или белкам межклеточного матрикса (DAMPs-MP-C).

Определение содержания исследуемых аАТ может быть проведено также другими способами, например, с помощью оптического биосенсора или любым другим способом определения уровня аАТ, известными из уровня техники.

Высокая эффективность предлагаемого способа может быть объяснена следующим. Как известно, поврежденная ткань генерирует эндогенные соединения организма, высвобождающиеся при повреждении клеток, так называемые белки DAMPs, которые способны инициировать неинфекционный воспалительный ответ. Многие белки DAMPs находятся в клеточном ядре и внутриклеточной жидкости. Семейство белков DAMPs включает белки межклеточного матрикса, белки теплового шока, негистоновые ядерные белки и др.

Так, например, HMGB1 (high-mobility group protein B1) - белок из группы ядерных негистоновых белков - взаимодействует с ДНК ядра клетки. При некрозе клеток и тканей он высвобождается из клеток и может связываться с рецептором врожденного иммунитета TLR4, что приводит к секреции цитокинов макрофагами и последующей воспалительной реакции [Wang Н. с соавт., 1999].

Белок HMGN1 высвобождается из клеток секрецией эндоплазматического ретикулума или через непрограммируемую гибель клеток после клеточного стресса или повреждения. HMGN1 служит мощным иммунным стимулятором, который способствует активации и миграции дендритных клеток и активации иммунных ответов, опосредованных Т-хелперами типа 1, которые усиливают противоопухолевый иммунитет. HMGN1 представляет собой эндогенный лиганд TLR4, который может вызывать как острую стимуляцию продукции цитокинов, так и долгосрочную толерантность, и, таким образом, он может играть модулирующую роль в стерильных воспалительных процессах, например, вызванных инфекцией, травмой или ишемией [Arts RJW, Huang PK, Yang D, Joosten LAB, van der Meer JWM, Oppenheim J J, Netea MG, Cheng SC. High-Mobility Group Nucleosome-Binding Protein 1 as Endogenous Ligand Induces Innate Immune Tolerance in a TLR4-Sirtuin-1 Dependent Manner in Human Blood Peripheral Mononuclear Cells. Front Immunol. 2018 Mar 14; 9: 526. doi: 10.33 89/fimmu.2018.00526. PMID: 29593748; PMCID: PMC5861144.].

Белки синдекана являются ключевыми компонентами эндотелиального гликокаликса и выделяются при воспалении. Синдеканы принадлежат к семейству трансмембранных гепарансульфатных протеогликанов типа I, которые у позвоночных состоят из четырех членов (Sdcl, Sdc2, Sdc3 и Sdc4). Основной белок этих протеогликанов состоит из внеклеточного, трансмембранного и внутриклеточного домена. Разрушение гликокаликса происходит под действием металлопротеиназ, гепараназ и гиалуронидаз. Эти шеддазы активируются активными формами кислорода и провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли альфа и интерлейкин-1бета. Обнаружено, что дезинтегринподобные металлопротеиназы ADAMTS1 и ADAMTS4 способны расщеплять эктодомен SDC-4 (S4ED) в положении рядом с N-концом. Более того, выделение S4ED с помощью ADAMTS1 приводит к клеточным ответам, таким как ингибирование миграции, изменения распределения F-актина, которые коррелируют с округлением клеток и уменьшением количества очаговых адгезий. ММР14 (матриксная металлопротеиназа 14 - мембранная эндопептидаза подсемейства матриксных металлопротеиназ), ММР2, ММР7 и ММР9 все имеют сайты расщепления внутри эктодоменов SDC-1 и SDC-4, в то время как ММРЗ также может расщеплять S1ED на одном сайте. Недавно было показано, что S2ED расщепляется ММР14 с образованием нескольких фрагментов. Тромбин (сериновая протеаза относится к ферментам класса гидролаз) может расщеплять эктодомен SDC-3, SDC-4 на фрагменты, которые взаимодействуют с эндотелиальными клетками, вызывая параклеточную гиперпроницаемость. Это может иметь важное значение в патогенезе сосудистой дисфункции во время сепсиса или состояний тромботической болезни, когда тромбин активируется.

Существует гипотеза, что фрагменты S3ED и S4ED могут действовать как молекулярные паттерны, связанные с повреждениями (DAMP). Рецепторы для S3ED и S4ED изучены недостаточно. Участие толл-подобного рецептора 4 (TLR4) остается спорным. Необходимы дальнейшие исследования для определения рецептора для фрагментов S3ED и S4ED, ответственных за эффекты разрушения барьера [Roh JS, Sohn DH. Damage-Associated Molecular Patterns in Inflammatory Diseases. Immune Netw. 2018 Aug 13; 18(4): e27. doi: 10.4110/in.2018.18.e27. PMID: 30181915; PMCID: PMC6117512.], [Jannaway M, Yang X, Meegan JE, Coleman DC, Yuan SY. Thrombin-cleaved syndecan-3/-4 ectodomain fragments mediate endothelial barrier dysfunction. PLoS One. 2019 May 15; 14(5): e0214737. doi: 10.1371/journal.pone.0214737. PMID: 31091226; PMCID: PMC6519803], [Bertrand J, Bollmann M. Soluble syndecans: biomarkers for diseases and therapeutic options. Br J Pharmacol. 2019 Jan; 176(1): 67-81. doi: 10.1111/bph.14397. Epub 2018 Jul 23. PMID: 29931674; PMCID: PMC6284332.], [Roh JS, Sohn DH. Damage-Associated Molecular Patterns in Inflammatory Diseases. Immune Netw. 2018 Aug 13; 18(4): e27. doi: 10.4110/in.2018.18.e27. PMID: 30181915; PMCID: PMC6117512.].

Бигликан - это белок внеклеточного матрикса. Бигликан состоит из белкового ядра, содержащего богатые лейцином области повторов, и двух цепей гликозаминогликанов (GAG), состоящих либо из хондроитинсульфата (CS), либо из дерматансульфата (DS), причем DS более распространены в большинстве соединительных тканей [10. Roughley PJ, White RJ. Dermatan sulphate proteoglycans of human articular cartilage. The properties of dermatan sulphate proteoglycans I and II. Biochem J. 1989 Sep 15; 262(3): 823-7. doi: 10.1042/bj2620823. PMID: 2590169; PMCID: PMC1133347.]. Бигликан в его растворимой форме действует как сигнал опасности, соединяющий врожденную и адаптивную иммунные системы. После тканевого стресса и повреждения бигликан протеолитически высвобождается из внеклеточного матрикса и превращается в немикробный сигнал опасности (DAMP). Белковое ядро бигликана может расщепляться несколькими протеолитическими ферментами, такими как ВМР1, матриксная металлопротеиназа (ММР)-2, ММР-3, ММР-13 и Granzyme В. В растворимой форме бигликан способен связываться как с TLR2/4 вызывая быструю активацию митоген-активируемой протеинкиназы р38, киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (Erk), и усилителя каппа-легкой цепи ядерного фактора активированного В клетки (NF-κВ) и, следовательно, секреция TNF-α. Посредством TLR2/4-зависимой передачи сигналов бигликан запускает синтез различных хемоаттрактантов для нейтрофилов и макрофагов, таких как MIP-1α (воспалительный белок макрофагов - lα), MIP-2, МСР-1 (хемоаттрактантный белок моноцитов - 1) и RANTES. (регулируется при активации, нормальные Т-клетки экспрессируются и секретируются) [Nastase MV, Young MF, Schaefer L. Biglycan: a multivalent proteoglycan providing structure and signals. J Histochem Cytochem. 2012 Dec; 60(12): 963-75. doi: 10.1369/0022155412456380. Epub 2012 Jul 20. PMID: 22821552; PMCID: PMC3527886], [Zindel J, Kubes P. DAMPs, PAMPs, and LAMPs in Immunity and Sterile Inflammation. Annu Rev Pathol. 2020 Jan 24; 15: 493-518. doi: 10.1146/annurev-pathmechdis-012419-032847. Epub 2019 Nov 1. PMID: 31675482].

Связанный со сплайсосомой белок 130 (SAP 130), субъединица гистондеацетилазы (Гистондеацетилазы представляют собой класс ферментов, которые удаляют ацетильные группы из аминокислоты ε-N-ацетиллизина на гистоне, позволяя гистонам более плотно обволакивать ДНК), находится в ядре нормальных живых клеток, но диффундирует из умирающих или поврежденных клеток и попадает во внеклеточную среду). SAP 130 является одним из новых DAMP и специфически связывается с рецептором Mincle (индуцируемый макрофагами лектин С-типа, CLEC4E), что приводит к запуску провоспалительной передачи сигналов при различных инфекциях и асептическом воспалении. Mincle - это трансмембранный рецептор, который высоко экспрессируется на активированных миелоидных клетках и инициирует сигнальную ось тирозинкиназы селезенки (Syk) для передачи нижестоящих сигналов для опосредования воспалительного ответа. SAP 130 повышен в слизистой оболочке кишечника и в кровообращении у пациентов с болезнью Крона [Liu K, Liu D, Feng Y, Zhang H, Zeng D, Liu Q, Qu J. Spliceosome-associated protein 130: a novel biomarker for idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Transl Med. 2020 Aug; 8(16): 986. doi: 10.21037/atm-20-4404. Erratum in: Ann Transl Med. 2021 Jul; 9(13): 1111. PMID: 32953786; PMCID: PMC7475450, [Relja B, Land WG. Damage-associated molecular patterns in trauma. Eur J Trauma Emerg Surg. 2020 Aug; 46(4): 751-775. doi: 10.1007/s00068-019-01235-w. Epub 2019 Oct 14. PMID: 31612270; PMCID: РМС7427761].

Известно, что те белки, которые активируют сигналы воспаления, как правило, блокируют сигналы апоптоза [Бурместер Г.-Р., 2020; Brien М.-Е. et al., 2019; Nadeau-Vallee М., et al., 2016]. Молекулы DAMPs, высвобождающиеся в организме женщины в ответ на повреждение любой локализации, индуцируют повышенный синтез аАТ, их связывающих. Во время беременности те из них, которые относятся к классу IgG, проходят плацентарный барьер и влияют на процессы апоптоза при развитии эмбриона/плода. Апоптоз имеет огромное значение в эмбриогенезе (включая имплантацию и органогенез). Так, например, нарушение гибели клеток в межпальцевых промежутках может привести в синдактилии, а отсутствие апоптоза избыточного эпителия при слиянии небных отростков или тканей, окружающих нервную трубку, приводит к нарушению слияния тканей с двух сторон, что проявляется расщеплением твердого неба и дефектом в тканях, ограничивающих спинномозговой канал (spina bifida), соответственно. Поэтому изменения физиологических уровней аАТ в крови матери, способных влиять на процессы апоптоза, могут иметь дизонтогенетические последствия.

Для проведения предлагаемого анализа требуется 0,01-0,02 мл сыворотки крови женщины (например, из подушечки пальца).

Фракция белков DAMPs может быть получена смешиванием различных коммерческих белков DAMPs. В качестве эффективного компонента заявляемой тест-системы может быть фракция молекул DAMPs, относящихся к негистоновым ядерным белкам (DAMPs-ACBP-C). Данный концентрат может быть получен, например, следующим способом.

Из 2 кг ткани свежего или свежезамороженного мозга крупного рогатого скота, хранившегося до использования не более 3 мес.при температуре не выше -20°С, выделяют фракцию клеточных ядер, используя общепринятые методы, например:

A. Мозг гомогенизируют в пяти объемах 0,01 М трис-хлоридного буферного раствора, рН 7,5, содержащего 0,15 М NaCl.

Б. Гомогенат центрифугируют при температуре 2-4°С в течение 5 мин при 1000 g.

B. Полученный осадок ресуспендируют в 0,32 М растворе сахарозы.

Г. Повторно центрифугируют в течение 5 мин при 1000 g и температуре 2-4°С.

Д. Повторяют процедуры по п. В и по п. Г по 5 раз.

Полученные ядра гомогенизируют в 0,01 М трис-хлоридном буферном растворе, рН 8,0, содержащем 2М NaCl, 2М мочевины и 0,01 об. % тритона X-100.

Суспензию центрифугируют, собирают супернатант, диализуют его против того же буферного раствора, но не содержащего NaCl (5 смен по 1 л; не менее 4 часа в каждой смене). Диализованный раствор белков наносят на хроматографическую колонку с анионообменником, уравновешенную 0,01 М трис-хлоридным буферным раствором, рН 7,5, содержащим 5 мМ ЭДТА.

В ходе последующей элюции белков с помощью раствора NaCl на том же буфере отбирают фракцию, элюируемую в диапазоне концентраций NaCl 0,3-0,7 М. Полученный препарат диализуют против буферного раствора. Диализат наносят на хроматографическую колонку с полибуферным обменником РВЕ-94 и проводят элюцию в линейном градиенте 0,1-1,0 М раствора роданистого калия с детекцией на длине волны 280 нм. Полученный материал используют в работе.

Также эффективным компонентом заявляемой тест-системы может быть фракция молекул DAMPs, относящихся к мембранным белкам и/или белкам межклеточного матрикса (DAMPs-MP-C). Данный концентрат может быть получен, например, следующим способом.

Из 1 кг ткани свежего или свежезамороженного мозга крупного рогатого скота, хранившегося до использования не более 3 мес. при температуре -20°С, выделяют фракцию клеточных мембран. Мозг гомогенизируют в десяти объемах 0,01 М трис-хлоридного буферного раствора, рН 7,5, содержащего 0,15 М NaCl. Центрифугируют при температуре 2-4°С в течение 5 мин при 1000 g, полученный осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сахарозу до концентрации 0,32 М; повторно центрифугируют при температуре 2-4°С в течение 10 мин при 3000 g, осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют равный объем 0,32 М раствора сахарозы. Процедуру повторяют 2-3 раза. Полученный супернатант разбавляют дистиллированной водой в 2 раза и центрифугируют при температуре 2-4°С в течение 60 мин при 20000 g. Собирают осадок клеточных мембран.

Полученные мембраны гомогенизируют в 0,01 М трис-хлоридном буферном растворе, рН 7, содержащем 0,2 М NaCl. После центрифугирования собирают осадок, суспендируют его в 0,01 М трис-хлоридном буферном растворе, рН 7,5. После повторного центрифугирования осадок гомогенизируют в 0,01 М трис-хлоридном буферном растворе, рН 7,5, содержащем 0,1 об. % тритона Х-100 и 2М мочевины.

После центрифугирования при 20000g при температуре 2-4°С в течение 60 мин собирают супернатант, диализуют его против того же буферного раствора 5 смен по 1 л; не менее 4 ч в каждой смене) и наносят на хроматографическую колонку с полибуферным обменником РВЕ-94, уравновешенную 0,01 М трис-хлоридным буферным раствором, рН, 7,5(КП-5), содержащим 5 мМ ЭДТА.

При последующей ступенчатой элюции белков с помощью раствора NaCl на указанном буфере отбирают фракцию, элюируемую в диапазоне концентраций NaCl 0,1-0,3 М.

После диализа против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,5, содержащего 0,01 об % тритона Х-100 и 1 М мочевины, белки наносят на хроматографическую колонку с анионообменником.

Элюцию проводят линейным градиентом 0,01-0,40 М раствора роданистого калия, содержащего 0,01 об. % тритона Х-100 с детекцией на длине волны 280 нм. Полученный материал используют в работе.

При проведении анализа возможно определение аАТ к одной или нескольким фракциям белковых антигенов DAMPs, а также определение аАТ к различным очищенным антигенам, входящим в состав DAMPs. Например, в качестве таких белков может выступать белок S100, белки теплового шока. Также возможно включение в тест-систему отдельных других очищенных белков или белковых фракций, аАТ к которым могут оказывать влияние на развитие эмбриона/плода, например, основного белка миелина (ОБМ). Наиболее оптимально, когда диагностическая система состоит из 3-5 тест-антигенов, включая фракции белков DAMPs, относящихся к негистоновым ядерным белкам (DAMPs-ACBP-C) и белкам межклеточного матрикса (DAMPs-MP-С). Методика проведения иммуноферментного анализа представлена ниже.

1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовят растворы полученных фракций белковых антигенов на карбонатном буфере. Приготовленные растворы вносят в отдельные лунки планшета. Накрытые крышками планшеты инкубируют ночь при 2-4°С.

2. Удаляют из лунок растворы белков и заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0.15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37°С.

3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (0.15 М NaCl с 0.05% твин-20).

4. Внесение тестируемых сывороток:

а) готовят разведения сывороток 1:200 на отмывочном буфере;

б) вносят разведенные сыворотки в лунки;

в) планшеты инкубируют ночь при 2-4°С.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции:

а) Исходный раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека разводят в необходимое число раз (в зависимости от его активности) отмывочным буфером;

б) раствор конъюгата вносят во все лунки планшета;

в) Планшеты инкубируют 60-90 мин при 37°С, либо 12-16 час при 2-4°С.

Конъюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером;

г) Сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0.01% тетраметилбензидина с 0.01% перекиси водорода на 0.05 М цитрат-фосфатном буфере рН 4.5-5 в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 10-15 мин при комнатной температуре.

7. По достижении оптимального уровня окрашивания (через 10-15 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М серной кислоты.

8. Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

9. По полученным значениям оптической плотности содержимого лунок, рассчитывают относительную интенсивность реакции тестировавшихся сывороток с фракциями белковых антигенов по отношению к эталону (в процентах). В качестве эталона использовали образец сыворотки со средними значениями иммунореактивности с используемыми в работе системами антигенов.

10. Производят интерпретацию полученных данных. Если значения иммунореактивности анализируемой сыворотки крови с любым из антигенов лежат в диапазоне от 75 до 120% от соответствующих значений иммунореактивности эталона, предполагается, что сыворотка крови получена от женщины, относящейся к группе нормореактивных.

Если значение иммунореактивности анализируемой сыворотки крови с хотя бы одним из используемых антигенов составляет менее 75% от соответствующих значений иммунореактивности эталона, и, при этом, каждое из значений иммунореактивности анализируемой сыворотки крови с остальными антигенами не превышает 120% от соответствующих значений иммунореактивности эталона, предполагается, что сыворотка получена от женщины, относящейся к группе гипореактивных.

Если значение иммунореактивности анализируемой сыворотки хотя бы с одним из используемых антигенов превышает 120% от соответствующих значений иммунореактивности эталона, и, при этом, каждое из значений иммунореактивности анализируемой сыворотки с остальными антигенами составляет не менее 75% от соответствующих значений иммунореактивности эталона, предполагается, что сыворотка получена от женщины, относящейся к группе гиперреактивиых.

В том случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с разными используемыми антигенами различается более чем на 30%, то это свидетельствует о нескоординированных изменениях определяемых показателей, независимо от их значений.

Многочисленные исследования показали, что наиболее точный прогноз течения беременности и здоровья родившегося ребенка можно дать не при однократном исследовании указанных выше аАТ во время беременности, а при мониторинге беременности под контролем данной технологии. Оптимальным представляется трехкратное обследование на сроках 7-8, 14-15 и 20-22 неделях беременности. Особенно важно обследование в 1 триместре беременности, когда происходит закладка органов и тканей будущего ребенка.

В зависимости от динамики уровней исследуемых аАТ для наиболее точного прогноза течения беременности и здоровья родившегося ребенка нам представляется оптимальным деление беременных на следующие группы:

1 группа - женщины со стабильными нормореактивными сыворотками по результатам исследования и использованием заявленного изобретения;

2 группа - женщины со стабильно гиперреактивными сыворотками по результатам исследования и использованием заявленного изобретения;

3 группа - женщины со стабильно гипореактивными сыворотками по результатам исследования и использованием заявленного изобретения;

4 группа - женщины, у которых во время беременности гиперреактивность сывороток по результатам исследования и использованием заявленного изобретения;

5 группа - женщины, у которых во время беременности гипо- или нормореактивность сывороток по результатам исследования и использованием заявленного изобретения.

Дети были разделены на те же 5 групп, к которым относились их матери. Состояние здоровья детей оценивали при рождении, а также в возрасте 1-1,5 года по стандартной схеме обследования, включающей общие анализы крови и мочи, нейросонограмму, УЗИ брюшной полости и почек, консультации невропатолога, оториноларинголога, окулиста, ортопеда. В зависимости от показателей здоровья дети были отнесены к одной из следующих диспансерных групп здоровья: I - практически здоровые дети; IIa - дети с функциональными нарушениями и со склонностью к хроническим заболеваниям; IIб - часто болеющие дети, дети с хроническими заболеваниями; III - дети с грубыми отклонениями в состоянии здоровья, ведущими к инвалидизации.

У женщин 1 группы условия развития эмбриона/плода являются оптимальными; риск осложнений беременности и рождения детей с пороками развития минимален. В остальных группах он повышен. Особенно неблагоприятной в плане такого прогноза является 5 группа.

У женщин, относящихся к группе с разнонаправленными изменениями, возможны отклонения в иммунном звене регуляции эмбриона/плода и риск осложнений течения беременности, а также рождения ребенка с пороками развития. Степень этого риска зависит от степени и характера наблюдаемых отклонений в содержании исследуемых антител.

Данные, полученные при анализе течения беременности 742 женщин, обследованных с помощью данной технологии, состояния здоровья их новорожденных и показателей их здоровья в возрасте 1-1,5 года выявили закономерности, представленные в таблицах 1, 2 и 3. Обследование во время беременности проводили трехкратно на сроках, указанных выше.

Анализируя представленные таблицы, мы видим, что наилучшие показатели здоровья были у детей 1 группы, худшие - у детей 5 группы.

Данный анализ можно рекомендовать проводить перед планируемой беременностью. Это важно, потому что, если мы видим отклонения в содержании исследуемых аАТ, то характер наблюдаемых отклонений косвенно свидетельствует о тех причинах, которые вызвали эти отклонения. Так, например, снижение содержания определяемых аАТ свидетельствует, чаще всего, о наличии вирусной, вирусоподобной или другой инфекции, о возможном контакте с вредными веществами, приеме некоторых фармпрепаратов, нарушениях питания психоэмоциональных стрессах. Повышенный уровень исследуемых аАТ говорит о наличии острого инфекционного или аллергического процесса, аутоиммунных процессах. Если при проведении анализа с использованием фракциями DAMPs или в комплексе с различными очищенными антигенами наблюдаются нескоординированные или разнонаправленные изменения иммунореактивности по отношению к разным тест-антигенам, то у женщины, как правило, наблюдаются различные эндокринно-метаболические расстройства. Подобные изменения показателей наблюдаются также при инфекционно-воспалительных процессах в стадии манифестации или разрешения.

Правильно подобранная терапия, как правило, приводит к нормализации данных аАТ и тем самым риск рождения нездорового ребенка будет сведен к минимуму. Однако, в связи с тем, что во время беременности могут активироваться новые неблагоприятные факторы, прогностическая значимость такого исследования до беременности - женщин тогда можно условно относить к 1, 2 или 3 группе, т.е. к нормореактивным, гиперреактивным и гопореактивным по данному тесту, будет несколько снижена по сравнению с данными, представленными в таблицах (на 10-15%). Но, в любом случае, на беременность лучше выходить с нормальными уровнями данных аАТ.

В том случае, если содержание определяемых аАТ выходит за границы нормы, рекомендуем провести дополнительные уточняющие лабораторные исследования, чтобы выявить и устранить причину выявляемых отклонений и тем самым свести к минимуму риск неблагоприятного исхода беременности. Причем это актуально как во время предгравидарной подготовки, так и во время беременности.

Если при проводимой терапии как в период предгравидарной подготовки, так и во время беременности наблюдается тенденция к нормализации показателей предложенного теста, можно сделать вывод о ее эффективности. Таким образом, данная технология может быть использована для мониторинга проводимой терапии и оценки ее эффективности.

Предложенный метод может применяться как независимо от других, так и в комплексе с другими известными методами обследования, в результате чего возможен более точный прогноз течения и исхода беременности.

Заявленное изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

Обследуемая А.Л., 19 лет. Первая беременность. Наследственность не отягощена. Результаты диагностического теста приведены в таблице 4. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни всех исследуемых аАТ в норме на всех исследуемых сроках (1 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога на 22 нед. получен неблагоприятный прогноз течения беременности.

Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: Физиологическое течение беременности. Своевременные срочные роды. Новорожденный без признаков патологии. Мальчик, по шкале Апгар 9 баллов, рост 52 см, вес 3200 г. В возрасте 1,5 года I группа здоровья.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Пример 2.

Обследуемая О.Ю., 36 лет. Первая беременность. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста приведены в таблице 5. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни исследуемых аАТ, в целом, выше нормы (2 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога на 7 и 15 неделях получены результаты, ассоциирующиеся с благоприятным течением беременности.

Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: Токсикоз первой половины беременности. Срочные роды, родился мальчик с врожденным пороком развития сердца. По шкале Апгар 6 баллов. Вес 3040 г. Рост 50 см. В возрасте 1 год - группа здоровья III.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка.

Пример 3.

Обследуемая Е.И., 32 года. Вторая беременность. Первая беременность закончилась самопроизвольным выкидышем на сроке 7-8 нед. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста приведены в таблице 6. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни исследуемых аАТ ниже нормы (3 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога получены результаты, ассоциирующиеся с неблагоприятным течением беременности.

Исход беременности: Самопроизвольный выкидыш на сроке 10-11 нед.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза развития эмбриона/плода.

Пример 4.

Обследуемая С.А., 37 лет. Вторая беременность. Есть ребенок, 9 лет, здоров. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста приведен в таблице 7. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни исследуемых аАТ ниже нормы (3 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога за 1 месяц до беременности получены результаты, ассоциирующиеся с благоприятным течением беременности.

Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: Беременность осложнилась гестозом средней тяжести. Срочные роды, признаки гипотрофии и внутриутробного инфицирования плода. По шкале Апгар 6 баллов, Рост 50 см, вес 2800 г. В возрасте 1,5 года группа здоровья Пб (часто болеющий ребенок).

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка.

Пример 5.

Обследуемая В.Б., 37 лет. Планирует первую беременность. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста приведены в таблице 8. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни исследуемых аАТ, в целом, выше нормы (2 группа). Наблюдаются разнонаправленные нескоординированные изменения в содержании исследуемых аАТ. По результатам диагностического теста с использованием аналога получены результаты, ассоциирующиеся с благоприятным течением беременности.

В результате дополнительного лабораторного обследования выявлены хламидиоз и умеренный гипертиреоз. Проведено лечение, в результате которого в крови нормализовался уровень гормонов щитовидной железы; хламидии методом ПНР не выявлялись.

Результаты теста после лечения приведены в таблице 9.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни всех исследуемых аАТ в норме (1 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога получены результаты, ассоциирующиеся с благоприятным течением беременности.

Во время беременности повторные обследования не проводились. Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: Физиологическое течение беременности. Новорожденный без признаков патологии. Девочка. По шкале Апгар 9 баллов. Вес 3400 г. В возрасте 1 год - 1 группа здоровья.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Пример 6.

Обследуемая А.С. 27 лет. Вторая беременность. В анамнезе медицинский аборт. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста приведены в таблице 10. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения наблюдается снижение уровней определяемых аАТ от высоких до нормальных значений (4 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога получены схожие результаты, однако на 14 неделе результат оказался не интерпретируемым (по полученным результатам не представлялось возможным сделать какие-либо выводы).

Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: Нефропатия II степени. Фетоплацентарная недостаточность. Преждевременные роды на сроке 31 нед. Вес 1150 г. Гипотрофия, морфо-функциональная незрелость. По шкале Апгар 5-6 баллов. В возрасте 1 года диагностирован детский церебральный паралич. Группа здоровья III.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Пример 7.

Обследуемая Н.А., 30 лет. Один ребенок 2 года с атопическим дерматитом. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста представлены в таблице 11. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения наблюдается подъем уровней определяемых аАТ от нормальных до высоких значений (5 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога на сроке 14 недель были получены результаты, ассоциирующиеся с благоприятным течением беременности.

Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: Беременность осложнилась нефропатией III степени. Преждевременные роды на сроке 36 нед.; мальчик 2800 г, по шкале Апгар 7 баллов, признаки внутриутробного инфицирования плода. В 1,5 года группа здоровья IIб.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Пример 8.

Обследуемая А.С., 24 года. Первая беременность. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста представлены в таблице 12. Для сравнения точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии в качестве аналога заявленного изобретения использовалось решение, указанное в патенте РФ №2233121.

Заключение: По результатам диагностического теста с использованием заявленного изобретения уровни исследуемых аАТ, в целом, ниже нормы (3 группа). По результатам диагностического теста с использованием аналога на сроке 6-7 недель были получены результаты, ассоциирующиеся с благоприятным течением беременности.

На 8-9 неделях беременности в ходе проведения дополнительного лабораторного обследования у пациентки была обнаружена цитомегаловирусная инфекция с повышенными титрами антител класса IgM. Пациентке было проведено трехкратно внутривенное введение препарата Пентаглобин с интервалом в 1 неделю, а затем, начиная с 16 недели беременности было проведено 2 пятидневных курса иммуномодулирующим препаратом, разрешенным при беременности, Виферон-2 с интервалом 2 недели.

Течение беременности, исход родов, состояние здоровья ребенка в возрасте 1-1,5 года: в первой половине беременности наблюдался ранний токсикоз (рвота беременных). В дальнейшем беременность протекала без осложнений. Срочные роды. Живой доношенный мальчик, рост 52 см, вес 3500; по шкале Апгар 9-10 баллов. В возрасте 1,5 года - I группа здоровья.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет повысить точность прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Пример 9.

Обследуемая М.К, 34 года. Детей нет. Предгравидарная подготовка. У женщины болезнь Шегрена.

Результаты диагностического теста представлены в таблице 13.

Заключение: Уровни исследуемых аАТ выше нормы.

Проводимые лечебные мероприятия не дали существенного снижения показателей, исследуемых аАТ. Беременность не рекомендована.

Изобретение относится к области биохимии. Описана тест-система для прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста на ранних сроках беременности или до беременности. Также описан способ прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста на ранних сроках беременности или до беременности, включающий использование описанной тест-системы. Техническим результатом является повышение точности прогноза течения беременности, развития эмбриона/плода, состояния здоровья будущего ребенка, оценки эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 13 табл.,9 пр.

1. Тест-система для прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста на ранних сроках беременности или до беременности, содержащая планшеты для иммуноферментного анализа с по меньшей мере одной сорбированной фракцией молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), отмывочный буфер, сыворотку-эталон, раствор конъюгата фермента с антителами к иммуноглобулинам класса G человека, раствор субстрата и стоп-раствор для остановки реакции.

2. Тест-система по п. 1, дополнительно включающая сорбированный белок S100.

3. Тест-система по п. 1, дополнительно включающая сорбированный основной белок миелина.

4. Тест-система по п. 1, где сорбированная фракция молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), является фракцией белков, относящихся к негистоновым ядерным белкам (DAMPs-ACBP-C).

5. Тест-система по п. 1, где сорбированная фракция молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), является фракцией белков, относящихся к мембранным белкам и/или белкам межклеточного матрикса (DAMPs-MP-C).

6. Способ прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста на ранних сроках беременности или до беременности, включающий забор крови у пациентки, получение сыворотки, определение в полученной сыворотке содержания аутоантител, отличающийся тем, что определяют содержание аутоантител к по меньшей мере одной фракции молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), с использованием тест-системы по п. 1, и при отклонении значения содержания определяемых аутоантител от эталонных значений более чем на 20% в сторону повышения или более чем на 25% в сторону снижения делают вывод о повышенном риске осложнений течения беременности, нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с патологией.

7. Способ по п. 6, дополнительно включающий определение содержания аутоантител к белку S100, и при отклонении значения определяемых аутоантител от эталонных значений более чем на 20% в сторону повышения или более чем на 25% в сторону снижения делают вывод о повышенном риске осложнений течения беременности, нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с патологией.

8. Способ по п. 6, дополнительно включающий определение содержания аутоантител к основному белку миелина, и при отклонении значения содержания определяемых аутоантител от эталонных значений более чем на 20% в сторону повышения или более чем на 25% в сторону снижения делают вывод о повышенном риске осложнений течения беременности, нарушений развития эмбриона/плода и рождения ребенка с патологией.

9. Способ по п. 6, где фракция молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), является фракцией белков, относящихся к негистоновым ядерным белкам (DAMPs-ACBP-C).

10. Способ по п. 6, где фракция молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPS), является фракцией белков, относящихся к мембранным белкам и/или белкам межклеточного матрикса (DAMPs-MP-C).