СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ СТАФИЛОДЕРМИЙ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

Область техники: медицина, дерматология, иммунохимия

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пиококковые поражения кожи, в частности стафилодермии, относятся к часто встречающимся дерматозам. Несмотря на наличие в настоящее время множества антибактериальных и иммунокорригирующих препаратов, примерно в 10-15% случаев они имеют склонность к хронизации, что приводит к временной потере трудоспособности и возможной инвалидизации (А.А.Каламкарян. Гнойничковые поражения кожи. М.: Медицина,1984).

Известно, что резистентность организма к инфекциям во многом обусловлена активностью важнейших провоспалительных цитокинов (А. Роит с соавт. Иммунология. М.: Мир, 2000) и факторами, влияющими на нее. Большая роль в формировании гуморального и клеточного антимикробного иммунитета принадлежит фактору некроза опухолей-альфа (ФНОα) и гамма-интерферону (ИФ-γ), которые во многом определяют интенсивность течения воспалительного процесса (Ковальчук и соавт., 1999). Известно, что активность цитокинов регулируется различными растворимыми цитокинсвязывающими факторами и ингибиторами (Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина, 1995). Важная роль при этом принадлежит аутоантителам к цитокинам.

Согласно сетевой теории N. Jeme (Jerne N.K. The generative grammar of the immune system. Nobel Lecture, December 1984. - Bioscience Reports (Printed in Great Britain). - 1985. - Vol.5. - P.439-451) иммунная система здорового человека продуцирует идио-типические (α-АТ) и антиидиотипические (АИАТ) естественные антитела ко всем антигенам собственного организма, которые являются составными частями иммунной сети и принимают участие практически во всех процессах, происходящих в организме (Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Ковалев И.Е. Регуляторная метасистема. Иммунонейроэндокринная регуляция гомеостаза. М.: Медицина, 2002) (приведенные сокращения несколько условны, т.к., строго говоря, АИАТ тоже являются аутоантителами).

Создание теории идиотип-антиидиотипической регуляции (теория "иммунной сети") способствовало радикальному переосмыслению биологической роли иммунной системы и ее возможности влиять практически на все процессы, происходящие в организме.

Таким образом в циркуляции присутствует определенный уровень а-АТ практически ко всем аутоантигенам, что необходимо для осуществления данными а-АТ определенных физиологических функций. У этих а-АТ есть свои "функциональные противовесы" - антиидиотипические антитела (АИАТ), связывающие их подобно антигену. Есть основания полагать, что их концентрация в кровотоке также поддерживается в определенных физиологических пределах. По нашему мнению, эти открытия имеют огромный в настоящее время практически невостребованный потенциал в плане как создания диагностических систем нового поколения, так и разработки новых методов иммунокоррекции.

Описаны естественные а-АТ к ИЛ-1α, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНОα (Symons S. et al., 1992). При самых различных инфекционных и аутоиммунных заболеваниях титр а-АТ к цитокинам возрастает, однако во многом это зависит от характера патологического процесса. (Takemura Т., et al., 1992). Вслед за ростом сывороточных уровней цитокинов растет уровень и соответствующих а-АТ, которые обычно высокоаффинны и играют большую роль в регуляции активности самих цитокинов. Роль эта может быть двоякой. Как правило, такие а-АТ тормозят действие цитокинов. Однако при определенных условиях они могут выступать и в роли протекторов цитокинов, предохраняя их от протеолитического разрушения, и являются таким образом как бы носителями цитокинов в крови (Bendtzen К., et al., 1990). В то же время есть основания утверждать, что их роль этим не ограничивается. Так, в эксперименте было показано (Bakhiet M. с коллегами, 1997), что а-АТ к ИФ-γ ингибируют продукцию этого цитокина спленоцитами. Кроме того, они ингибируют индуцируемую самим ИФ-γ экспрессию макрофагами молекул МНС и индуцируемую ФНОα пролиферацию тимоцитов.

В литературе мы не обнаружили работ, касающихся АИАТ к цитокинам и соответственно идиотип-антиидиотипического равновесия антител к цитокинам при какой-либо патологии. В то же время это направление представляется очень перспективным, т.к. если а-АТ влияют на активность цитокинов, то и соответствующие АИАТ, связывающие их вариабельные участки, тоже должны влиять на их активность, а тем самым и на клиническую картину самого заболевания. Поэтому исследование данных механизмов может дать возможность глубже понять процессы регуляции активности цитокинов и разработать новые эффективные методы коррекции, направленные на повышение иммунореактивности организма.

Нами была разработана тест-система, которую можно использовать для прогнозирования течения стафилококковых поражений кожи. С помощью данной тест-системы определяют уровень а-АТ к ФНОα (или его иммунохимическим аналогам) и уровень соответствующих специфических АИАТ, после чего рассчитывают коэффициент I, представляющий собой отношение уровней а-АТ/АИАТ.

В настоящее время дать прогноз течения стафилококкового поражения кожи возможно с помощью анализа клинической картины заболевания, принимая во внимание такие признаки, как частота рецидивов, длительность рецидивов и их тяжесть (А.А.Каламкарян. Гнойничковые поражения кожи. М.: Медицина, 1984). В то же время отсутствие параклинических критериев прогноза течения стафилодермий создает для клиницистов определенные сложности, т.к. не всегда предоставляется возможность при манифестации заболевания достаточно точно определить, следует ли ожидать рецидивов заболевания, какова будет их тяжесть.

Предлагаемый нами способ позволяет:

- оценивать сывороточный уровень а-АТ к ФНОα или их иммунохимическим аналогам;

- оценивать сывороточный уровень АИАТ к ФНОα или их иммунохимическим аналогам;

- определять коэффициент I, т.е. значения соотношения уровней а-АТ/АИАТ;

- по значению коэффициент I оценивать прогноз течения стафилодермий.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа возможно повысить надежность прогноза течения стафилодермий, т.е. определить степень риска хронизации процесса. Указанное осуществляется с помощью определения коэффициента I, представляющего собой соотношение уровней а-АТ и АИАТ к ФНОα.

В результате такого обследования выявляются лица с патологически повышенными значениями коэффициента I, выходящими за границы эмпирически установленного диапазона нормы.

Реализация существенных признаков предлагаемого изобретения осуществляется следующим образом.

I. На планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) сорбируют ФНОα или его иммунохимические аналоги, например F(ab)₂-фрагменты специфических АИАТ к нему.

II. На планшеты для ИФА сорбируют антитела (идиотипические) к ФНОα или их вариабельные участки, например F(ab)₂-фрагменты.

III. На планшеты наносят образцы тестируемых сывороток и эталонной сыворотки.

IV. Выявляют связывающиеся из тестируемых сывороток антитела (идиотипические или антиидиотипические) с помощью конъюгатов антивидовых (вторичных) антител с ферментом, например пероксидазой хрена. Реакцию в лунках планшета проявляют субстратом, например о-фенилендиамином и H₂O₂.

V. Обрабатывают полученные данные. Определяют интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими эталонную сыворотку. Определяют коэффициент I, который представляет собой отношение уровней а-АТ/АИАТ.

Не вытекает из известного уровня техники тот факт, что по значениям коэффициента I, представляющего собой соотношение уровней а-АТ и АИАТ к ФНОα, можно судить о течении стафилококкового поражения кожи.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ФНОα, АНТИТЕЛ К ФНОα

Получение F(ab)₂-фрагментов молекул АИАТ к ФНОα, т.е. его иммунохимических аналогов, проводили следующим образом. Кроликов породы "шиншилла" иммунизировали F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к ФНОα. Из получаемой антисыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к ФНОα выделяли соответствующие АИАТ и в результате протеолитический обработки получали их F(ab)₂-фрагменты, которые использовали для активации планшет.

Для получения поликлональных антител к ФНОα использовали коммерческие препараты данного цитокина фирмы Sigma (США).

ПРОВЕДЕНИЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИФА

1. Растворы каждого из компонентов тест-системы (F(ab)₂-фрагменты идиотипических и антиидиотипических антител к ФНОα; вместо F(ab)₂-фрагментов АИАТ к ФНОα может быть использован сам ФНОα), диализованные против карбонатного буфера рН 9,2-9,8, вносят в отдельные лунки стандартных 96-луночных плоскодонных планшет для ИФА. Затем планшеты инкубируют 12-18 ч при температуре +2-4°С.

2. Удаляют (стряхиванием) из лунок растворы с несвязавшимися компонентами и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0.15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37°С.

3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (с 0.05% твин-20).

4. Вносят на планшеты образцы тестируемых и эталонной сывороток в разведении 1:200 на отмывочном буфере. Инкубируют 12-18 ч при температуре +4°С.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции осуществляют следующим образом. Раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антивидовыми антителами к IgG человека вносят во все лунки планшета. Затем планшеты инкубируют 60-90 мин при температуре +37°С или 12-16 ч при температуре +2-4°С, после чего коньюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером. Сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0.01-0.05% о-фенилендиамина с 0.001-0.005% перекиси водовода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 10-20 мин при комнатной температуре.

7. По достижении оптимального уровня окрашивания реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М серной кислоты.

8. Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

9. Обрабатывают полученные данные.

а) Из трех дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной и тестируемых образцов сыворотки выбирают среднее.

б) Рассчитывают относительную интенсивность реакции с компонентами тест-системы тестировавшихся сывороток по отношению к реакции эталонной сыворотки (в процентах) по полученным значениям оптической плотности лунок. Рассчитывают коэффициент I, представляющий собою отношение уровней а-АТ/АИАТ к ФНОα.

10. Интерпретируют полученные данные.

В случае, если значения коэффициента I превышают 1,3, то в 73% случаев следует ожидать хронизацию стафилококкового поражения кожи. Если значения коэффициента I менее 0,8, то следует ожидать полное клиническое выздоровление (в 97% случаев). Если значения коэффициента I находятся в диапазоне 0,8-1,3, то риск хронизации процесса составляет 10-15%. Т.о., чем выше значение коэффициента I, тем больше степень риска перехода процесса в хроническую форму.

В качестве эталонной сыворотки брали пулированную сыворотку здоровых лиц от 16 до 50 лет.

Положительный эффект от реализации изобретения сводится к получению описанной тест-системы, с помощью которой можно выявить тех пациентов со стафилодермиями, у которых следует ожидать хронизацию процесса. Прогностическим признаком перехода стафилодермии в хроническую форму является значение коэффициента I выше 1,3.

При проведении анализа следует учитывать, что наличие различных инфекционных, эндокринных и других сопутствующих заболеваний может влиять на исследуемые параметры, что может привести к неточной интерпретации исследуемых показателей.

ПРИМЕРЫ

Пример-1

Пациент А., 24 года. На коже волосистой части головы, задней поверхности шеи, появились болезненные узелки красного цвета, которые в дальнейшем превращались в пустулы, пронизанные волосом. В течение 3-4 дней процесс супурации продолжался, сопровождаясь некрозом соединительной ткани, на фоне общей слабости, недомогания и субфебрильной температуры. Был поставлен диагноз: стафилодермия.

Результаты тестирования:

Уровень а-АТ к ФНОα - 98; уровень АИАТ к ФНОα - 109; значение коэффициента I - 0,9.

Прогноз: полное выздоровление без хронизации процесса. После проведенного комплексного лечения с помощью антибиотиков и иммунокорректоров высыпания разрешились. В течение последующих 3 лет рецидивов заболевания отмечено не было.

Пример-2

Пациент Н., 37 лет. В области подмышечных впадин в начале заболевания определялись одиночные плотные холмообразные узлы, сопровождающиеся небольшой болезненностью. В течение 7 дней узлы быстро увеличивались в размерах, приобрели грушевидную форму. Кожа над ними сине-красной окраски, отечна, резко болезненна.

Через 2-3 дня узлы слились, размягчились, появилась флюктуация.

Диагноз - гидраденит (стафилодермия).

Результаты тестирования:

Уровень а-АТ к ФНОα - 180; уровень АИАТ к ФНОα - 90; значение коэффициента I - 2,0.

Прогноз: следует ожидать хронизацию процесса.

После проведенного комплексного лечения с помощью антибиотиков и иммунокорректоров процесс удалось скомпенсировать, однако рецидив возник через 2 мес.

Катамнестическое последующее наблюдение в течение последующих 3 лет показало, что у пациента заболевание рецидивировало не реже чем 2-3 раза в год.

ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ И СОЦИАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Применение диагностической тест-системы, с помощью которой определяют сывороточный уровень идиотипических и антиидиотипических антител к ФНОα с последующим расчетом коэффициента I, представляющего собой соотношение уровней а-АТ/АИАТ к ФНОα, позволяет выявлять тех больных со стафилококковыми поражениями кожи, у которых следует ожидать хронизацию процесса. Это дает возможность клиницистам своевременно проводить профилактику обострений стафилодермии у таких пациентов.

Исследование проводится в лаборатории для иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии и иммунохимии. Для прогнозирования течения стафилодермий с помощью иммуноферментного анализа определяют уровни идиотипических (а-АТ) и антиидиотипических антител (АИАТ) к ФНОα или его иммунохимическим аналогам. Рассчитывают коэффициент I, представляющий собой отношение уровней а-АТ/АИАТ. При значениях коэффициента I выше 1,3 прогнозируют хроническое течение стафилококкового поражения кожи. При значениях коэффициента I ниже 0,8 прогнозируют полное клиническое выздоровление. Использование способа позволяет повысить надежность прогноза и выявить лиц, у которых следует ожидать хронизацию процесса. Это дает возможность своевременно проводить профилактику обострений стафилодермии у таких пациентов.

Способ прогнозирования течения стафилодермий, включающий забор крови, проведение клинико-биохимического исследования, отличающийся тем, что с помощью иммуноферментного анализа определяют сывороточные уровни идиотипических (а-АТ) и антиидиотипических антител (АИАТ) к ФНОα или его иммунохимическим аналогам с последующим расчетом коэффициента I, представляющего собой отношение уровней а-АТ/АИАТ, и при значениях данного коэффициента выше 1,3 прогнозируют хроническое течение стафилодермии, при значениях ниже 0,8 прогнозируют полное клиническое выздоровление.