КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ СОБАКИ Российский патент 2005 года по МПК A61D19/02 

Техническая область

Настоящее изобретение относится к композициям для замораживания собачьей спермы, к способу замораживания собачьей спермы с использованием указанных композиций и к способу искусственного осеменения с использованием замороженной собачьей спермы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям для замораживания собачьей спермы, в которых количество сперматозоидов, живущих в сперме, а также их форма и жизнеспособность сохраняются при оттаивании спермы в течение определенного промежутка времени после ее замораживания, к способу замораживания собачьей спермы с использованием указанных композиций и к способу искусственного осеменения, включающему оттаивание замороженной собачьей спермы в подходящем месте и в подходящее время и введение ее во влагалище собаки женского пола.

Предпосылки к созданию изобретения

В соответствии с недавним промышленным развитием генная инженерия стала важной областью исследований. Генная инженерия является необходимой для сохранения и развития ценных пород животных и увеличения продолжительности человеческой жизни, и к настоящему времени она достигла достаточно высокого уровня по сравнению с первоначальной стадией.

В случае разведения домашнего скота или комнатных животных искусственное осеменение с использованием жидкой спермы позволяет оплодотворить несколько самок животных путем смешивания спермы, взятой у самца животного, с разбавляющей жидкостью для увеличения объема жидкости, имеющейся в распоряжении для инъекции. Таким образом, при осуществлении искусственного осеменения собирают улучшенную или чистую сперму, и можно оплодотворить нескольких самок животных одновременно, что способствует улучшению пород и сохранению чистых пород.

С целью достижения успешного искусственного осеменения, имеющего несколько преимуществ, описанных выше, важным вопросом становится разработка подходящих разбавляющих жидкостей. Поскольку поиск разбавляющих жидкостей начался несколько десятилетий назад, были разработаны и внедрены в практику разбавляющие жидкости, подходящие для свиней, лошадей и крупного рогатого скота. Однако разработка разбавляющих жидкостей, подходящих для собачьей спермы, еще не завершена.

Способ сохранения спермы животных в течение длительного периода времени без утраты свежести позволит по необходимости использовать превосходную сперму для оплодотворения самок животных, что внесет большой вклад в развитие животноводства и разведение комнатных животных.

Способ замораживания является наиболее удобным для сохранения спермы в течение длительного периода времени. Однако способ замораживания для собачьей спермы еще не разработан окончательно. Несмотря на отсутствие ясной формулировки, конкретная причина недостаточной разработки, возможно, заключается в том, что реагенты для замораживания спермы собак, сперматозоиды которых имеют некоторые особенности, а также способы замораживания с использованием указанных реагентов еще недостаточно разработаны.

Описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является создание композиций для замораживания собачьей спермы, с помощью которых собачью сперму, имеющую особенные сперматозоиды, можно замораживать для хранения.

Вторым объектом настоящего изобретения является создание способа замораживания собачьей спермы, взятой у самца собаки, с использованием указанных композиций, с помощью которого сперму можно хранить длительное время и удобно транспортировать и с помощью которого замороженную собачью сперму можно оттаивать в подходящее время для искусственного осеменения.

Третьим объектом настоящего изобретения является создание способа искусственного осеменения с использованием замороженной спермы на основе способа замораживания, с помощью которого можно разводить превосходных животных, и который может широко применяться.

Для реализации первого аспекта разработана композиция для замораживания собачьей спермы, включающая, на основе 100 мл дистиллированной воды, от 0,25 до 4,5 г цитрата натрия, от 0,45 до 4,0 г декстрозы, от 0,01 до 0,3 г пенициллина, от 50 000 до 500 000 ME стрептомицина, от 0,25 до 0,45 г каталазы, от 0,045 до 0,25 г желтка, от 1,5 до 15 мл глицерина и от 0,02 до 0,1 мкг сыворотки крови собаки.

Для реализации второго аспекта разработан способ замораживания собачьей спермы с использованием указанной композиции, включающий стадии (а) взятия спермы у самца собаки способом массажа или электрического шока, (b) центрифугирования собранной спермы для отделения и удаления надосадочной жидкости, оставляющего только низшие слои, содержащие сперму, (с) смешивания равных объемов низших слоев, содержащих сперму, и композиции и первичного охлаждения смеси, (d) дальнейшего добавления композиции к смеси, полученной на стадии (с), для уменьшения волюметрического соотношения спермы и композиции до 1:2, и вторичного охлаждения полученной смеси и (е) добавления жидкого азота к смеси, полученной на стадии (d), и замораживания полученной смеси.

Для реализации третьего аспекта разработан способ искусственного осеменения собак, включающий стадии: (а) обследования самки собаки на предмет подходящей овуляторной фазы для улучшения коэффициента фертильности, (b) добавления замороженной спермы, полученной способом, заявленным в пункте 2, к смеси от 0,3 до 1,5 мас.% раствора хлорида натрия и сыворотки крови собаки, нагретой до температуры от 30 до 40°С, и ее оттаивания, (с) изучения подвижности сперматозоидов в оттаявшей сперме под микроскопом, и (d) инъецирования оттаявшей спермы во влагалище самки собаки и массирования клитора самки собаки.

Были проведены обширные исследования для разработки способа замораживания собачьей спермы и композиций для использования в указанном способе и было установлено, что собачью сперму можно замораживать для хранения путем комбинирования малого количества сыворотки крови собаки с композицией, аналогичной обычной разбавляющей жидкости, используемой для крупного рогатого скота или свиней, для завершения настоящего изобретения.

Настоящее изобретение далее будет описано более подробно. Сначала будут описаны композиции для замораживания собачьей спермы.

Композиции для замораживания собачьей спермы по настоящему изобретению изготавливают гомогенным примешиванием к 100 мл дистиллированной воды, от 0,25 до 4,5 г цитрата натрия для регулирования буферной функции, кислотности (рН) и осмотического давления сперматозоидов, от 0,45 до 4,0 г декстрозы в качестве источника метаболизма и энергии, от 0,01 до 0,3 г пенициллина в качестве антибиотика для предупреждения инфекции, от 50 000 до 500 000 ME стрептомицина, от 0,25 до 0,45 г каталазы, от 0,045 до 0,25 г желтка, от 1,5 до 15 мл глицерина и от 0,02 до 0,1 мкг сыворотки крови собаки. Изготовленную таким образом композицию замораживают в единицах объемом около 2 мл, предназначенных для оттаивания перед их использованием в любое время.

Композиция по настоящему изобретению сохраняет сперму в течение длительного периода времени, поддерживая жизнеспособность и подвижность сперматозоидов, содержащихся в замороженной сперме, и содержит сыворотку крови собаки, демонстрируя нормальные коэффициенты фертильности и родов после оттаивания.

Далее будет описан способ замораживания собачьей спермы с использованием указанной композиции.

Для замораживания собачьей спермы сначала необходимо ее собрать. В качестве способа сбора спермы можно использовать известные в данной области способы без ограничения, предпочтительно, способ массажа или электрического шока. Далее будет коротко описан способ массажа, который применяется наиболее широко.

Поскольку при смешивании с мочой сперматозоиды быстро погибают, предпочтительно, чтобы самец собаки перед взятием у него спермы помочился. Затем половой орган самца собаки массируют с помощью пробирки со вставленной в нее искусственной вагиной, чтобы заставить самца собаки эякулировать в пробирку. Для ускорения взятия спермы указанным способом самке собаки, у которой в этот период времени наступила течка, позволяют находиться поблизости от самца собаки. Другой способ заключается в том, что при сборе спермы самцу собаки дают понюхать вату или губку, содержащую вагинальный секрет самки собаки, которые сначала замораживают, а перед употреблением оттаивают.

В случае взятия спермы с помощью способа массажа сперму разделяют на три образца, собранных в различные пробирки. В этом случае образец спермы, содержащий сперматозоиды, представляет собой второй образец. Каждый образец собирают в течение интервала времени около 10-20 секунд. Однако в некоторых случаях интервал между первым и вторым образцами слишком короток, чтобы быть различимым. В настоящем изобретении предпочтительно используют второй образец. Однако в случае, когда невозможно различить первый и второй образцы, все три образца собирают в одну пробирку, которая предназначена для использования.

Затем собранную таким способом сперму разделяют центрифугированием, и надосадочную жидкость сливают, после чего остается низший слой осажденной спермы. Центрифугирование осуществляют приблизительно на 500-1100 об/мин в течение 6 минут.

Равные объемы низшего слоя осажденной спермы и композиции, приготовленной, как описано выше, смешивают при комнатной температуре, а затем смесь первично охлаждают. В этом случае время охлаждения составляет приблизительно от 10 до 20 минут, а температура охлаждения составляет приблизительно 5°С. Смесь спермы и композиции в волюметрическом соотношении 1:2 далее смешивают с первично охлажденной смесью при комнатной температуре, а затем вторично охлаждают при той же температуре и в течение того же периода времени. В продолжении стадий первичного и вторичного охлаждения сперму и композицию гомогенно смешивают.

Затем определенное количество вторично охлажденной смеси отбирают с помощью пипетки и 2-3 капли капают на поверхность сухого льда. Поскольку температура поверхности сухого льда составляет приблизительно -79°С, смесь на всем протяжении замерзает. Замороженную смесь отделяют от сухого льда и помещают в контейнер с жидким азотом с температурой около -196°С, который затем герметично закрывают, завершая, таким образом, процесс замораживания собачьей спермы. Этот способ называют "способом гранул", поскольку замороженная смесь в жидком азоте имеет форму гранулы.

Помимо описанного выше способа гранул, собачью сперму можно замораживать с помощью способа, при котором используется соломинка, и который далее будет кратко описан.

Вторично охлажденную смесь еще раз разделяют на образцы приблизительно по 0,5 мл и помещают в соломинки. Каждые 20-30 соломинок группируют и погружают в контейнер с жидким азотом. Когда соломинки погружают в контейнер для замораживания, их погружают постепенно, а не погружают сразу на дно контейнера. Их погружают сначала на глубину верхней части контейнера и оставляют так на определенное время, затем их погружают на глубину середины контейнера и оставляют так на определенное время, а затем - до дна контейнера.

Замороженную таким способом сперму можно переносить и хранить длительное время и использовать в случае необходимости для искусственного осеменения после оттаивания.

Затем будет описан способ искусственного осеменения с использованием замороженной спермы.

Сначала, с целью осуществления искусственного осеменения проводят тест для определения наличия у самки собаки овуляторной фазы. Тест на овуляторную фазу выполняют способами, известными специалистам, для которых предназначено настоящее изобретение, такими как тест клеток влагалища или гормональный тест.

Затем замороженную сперму оттаивают добавлением замороженной спермы к смеси от 0,3 до 1,5 мас.% раствора хлорида натрия и малого количества собачьей спермы, нагретой до температуры от 30 до 40°С, которая является благоприятной для поддержания жизнеспособности и формы сперматозоидов. Также, хотя смесь можно подогревать непосредственно, поскольку достаточно сложно должным образом контролировать температуру, предпочтительно помещать герметично закрытый контейнер, содержащий смесь раствора хлорида натрия и собачьей спермы, в горячую воду с температурой около 50°С и нагревать.

Перед использованием оттаявшей с помощью такого способа спермы для искусственного осеменения изучают количество, форму и подвижность живых сперматозоидов под микроскопом. Успешное искусственное осеменение зависит от количества сперматозоидов, движущихся вперед. Сперматозоиды классифицируют в соответствии с четырьмя типами на основе их подвижности.

Класс 0 означает случай, когда сперматозоиды двигают хвостиками без продвижения вперед, класс 1 означает случай, когда менее 20% сперматозоидов двигаются вперед, класс 2 означает случай, когда от 20 до 50% сперматозоидов двигаются вперед, класс 3 означает случай, когда от 50 до 80% сперматозоидов двигаются вперед, и класс 4 означает случай, когда более 80% сперматозоидов двигаются вперед. Когда оттаявшую сперму помещают на предметное стекло и рассматривают под микроскопом, только сперму с классом подвижности 2 и выше можно использовать для искусственного осеменения.

Затем оттаявшую сперму инъецируют во влагалище самки собаки, которая находится в фазе овуляции, и массируют клитор самки собаки для завершения искусственного осеменения.

Помимо описанного выше способа искусственного осеменения, оттаявшую сперму можно инъецировать в матку самки собаки хирургическим путем. Иными словами, нижнюю часть пупка рассекают приблизительно на 2 см, чтобы поднять матку, и сперму самца собаки инъецируют непосредственно в матку самки собаки с помощью шприца для инъекций. Затем последовательно зашивают брюшину, брюшную мышцу и кожу самки собаки.

Наилучший вариант осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1

Приготовление композиции для замораживания собачьей спермы

Смесь, имеющую следующий состав, гомогенно смешивали с использованием миксера, для получения композиции для замораживания собачьей спермы, на основе 100 мл дистиллированной воды.

Цитрат натрия 0,35 гДекстроза 2,5 гПенициллин 0,02 гСтрептомицин 100000 МЕКаталаза 0,35 гЖелток 0,05 гГлицерин 2 млСыворотка крови собаки 0,05 мкг

Способ замораживания собачьей спермы

Сперму брали у 6-летней овчарки весом 43 кг методом электрического шока. Количество собранной спермы составило 6,2 мл. Затем собранную сперму разделяли центрифугированием для удаления надосадочной жидкости и оставления только нижнего осадочного слоя. Центрифугирование выполняли на 500-1100 об/мин в течение 6 минут.

Равные объемы отделенного таким способом нижнего слоя спермы и композиции, приготовленной описанным выше способом, смешивали при комнатной температуре, а затем подвергали первичному охлаждению. В этом случае время охлаждения составляли 10-20 минут, а температура охлаждения составляла около 5°С. Композицию дополнительно добавляли к первично охлажденной смеси, так, что объемное соотношение спермы и композиции становилось равным 1:2. Эту полученную смесь затем подвергали вторичному охлаждению при той же температуре и в течение такого же периода времени.

Затем определенное количество вторично охлажденной смеси набирали пипеткой и 2-3 капли капали на поверхность сухого льда. Поскольку температура поверхности сухого льда составляет приблизительно -79°С, смесь на всем протяжении замерзала. Замороженную смесь отделяли от сухого льда и помещали в контейнер с жидким азотом с температурой около -196°С, который затем герметично закрывали, завершая, таким образом, процесс замораживания собачьей спермы.

Искусственное осеменение с использованием замороженной спермы

Для искусственного осеменения использовали трех 3-летних овчарок женского пола весом 30 кг. Для определения фазы овуляции у самок собак использовали тест вагинальных клеток.

Затем необходимо было оттаять сперму, замороженную описанным выше способом. Оттаивание осуществляли следующим образом: замороженную сперму добавляли к смеси 0,3-1,5 мас.% раствора хлорида натрия и малого количества собачьей спермы; смесь нагревали до температуры 38°С, а затем оставляли для оттаивания в течение 5 часов.

Затем, перед использованием оттаявшей спермы для искусственного осеменения, исследовали подвижность живых сперматозоидов путем помещения оттаявшей спермы на предметное стекло и изучения ее под микроскопом. Успешное искусственное осеменение зависит от количества сперматозоидов, движущихся вперед. Процентная доля сперматозоидов, движущихся вперед, составляла приблизительно 85%, что подходит для искусственного осеменения.

Затем оттаявшую сперму разделяли на три порции и инъецировали во влагалище самок собак, которые находились в фазе овуляции. Затем клитор каждой из самок собак массировали в течение 5 минут для завершения искусственного осеменения.

Тест на беременность выполняли спустя 1 месяц после выполнения искусственного осеменения, и все три самки собаки оказались беременными. Позднее у трех самок собак родилось 4, 6 и 9 здоровых щенков, соответственно.

Пример 2

В этом примере композицию для замораживания собачьей спермы готовили, как описано в примере 1, за исключением того, что использовали 0,02 мкг сыворотки крови собаки.

Впоследствии замораживание собачьей спермы и искусственное осеменение с использованием указанной композиции осуществляли, как описано в примере 1.

В этом варианте осуществления использовали 5-летнего самца овчарки весом 40 кг и трех 3-летних самок овчарки весом 25 кг, 30 кг и 28 кг.

Тест на подвижность сперматозоидов в оттаявшей сперме показал, что процентная доля сперматозоидов, движущихся вперед, составляла 60%, что является подходящим условием для искусственного осеменения.

Тест на беременность выполняли спустя 1 месяц после выполнения искусственного осеменения, и две самки собаки оказались беременными. Позднее у двух самок собак родилось 5 и 6 здоровых щенков, соответственно.

Сравнительный пример 1

В этом сравнительном примере композицию для замораживания собачьей спермы готовили, как описано в примере 1, и сперму замораживали, как описано в примере, за исключением того, что волюметрическое соотношение композиции и собачьей спермы составляло 1:1. Собачью сперму собирали, как описано в примере 1, у того же самца собаки.

Замороженную сперму оттаивали, как описано в примере 1, и изучали подвижность сперматозоидов в оттаявшей сперме. Тест показал, что процентная доля сперматозоидов, движущихся вперед, составляла менее 20%, что не является подходящим условием для искусственного осеменения.

Сравнительный пример 2

В этом сравнительном примере композицию для замораживания собачьей спермы готовили, как описано в примере 1, за исключением того, что в композиции не было сыворотки крови собаки. Способы замораживания и оттаивания были те же, что и в примере 1, и собачью сперму собирали, как описано в примере 1, у того же самца собаки.

Тест на подвижность сперматозоидов в замороженной и оттаявшей сперме, согласно данному сравнительному примеру, показал, что у сперматозоидов наблюдалось лишь движение хвостиков, без продвижения вперед, что не является подходящим условием для искусственного осеменения.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к способу замораживания собачьей спермы, которую трудно замораживать для хранения в силу особенностей, присущих сперматозоидам собачьей спермы, и к композициям для использования в указанном способе. Таким образом, собачью сперму можно хранить в замороженном состоянии, что способствует сохранению собак хороших породных линий. Также замороженную собачью сперму можно использовать для искусственного осеменения в подходящее время и подходящем месте, что способствует повышению коэффициента рождаемости.

Изобретение относится к области ветеринарии. Композиция содержит, на основе 100 мл дистиллированной воды, от 0,25 до 4,5 г цитрата натрия, от 0,45 до 4,0 г декстрозы, от 0,01 до 0,3 г пенициллина, от 50 000 до 500 000 ME стрептомицина, от 0,25 до 0,45 г каталазы, от 0,045 до 0,25 г желтка, от 1,5 до 15 мл глицерина и от 0,02 до 0,1 мкг сыворотки крови собаки. Изобретение сохраняет сперму в течение длительного периода времени, поддерживает жизнеспособность и подвижность сперматозоидов, обеспечивает высокую фертильность спермы после оттаивания.

Композиция для замораживания спермы собаки, включающая на основе 100 мл дистиллированной воды 0,25÷4,5 г цитрата натрия, 0,45÷4,0 г декстрозы, 0,01÷0,3 г пенициллина, 50 000÷500 000 ME стрептомицина, 0,25÷0,45 г каталазы, 0,045÷0,25 г желтка, 1,5÷15 мл глицерина и 0,02÷0,1 мкг сыворотки крови собаки.