ВАКЦИНА ПРОТИВ ГИПЕРТОНИИ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/385 A61K38/17 A61P9/12 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и может быть использовано при терапии гипертонической болезни и профилактике гипертонических кризов.

Известны антигипертензивные средства, оказывающие влияние на ренин - ангиотензиновую систему - основной регулятор объема внеклеточной жидкости и артериального давления. Эта система представляет собой каскад взаимосвязанных ферментативных реакций, результатом которых является синтез многофункционального пептида ангиотензина-II, вызывающего повышение артериального давления; вазоконстрикцию; стимуляцию почечной реабсорбции натрия; высвобождение альдостерона, вазопрессина, катехоламинов и простагландинов; воздействие на высвобождение ренина по принципу отрицательной обратной связи; стимуляцию чувства жажды и др.

Известные антигипертензивные средства (лозартан, эналаприл, кандесартан, ирбесартан, эпросартан, валсартан и др.) приводят к снижению артериального давления.

[см., например, Русский медицинский журнал, Е. Нурмухаметова, Olivero Ml. Coffman TM. Angiotensin - II receptors: new targets for antihypertensive therapy. Chin Cardiol 1997; 20:3-6].

Известны также антигипертензивные препараты - пропранолол и его аналоги, анаприлин, обзидан и т.п., способные угнетать выброс ренина.

В последнее время появился новый класс лекарственных препаратов - блокаторов ангиотензинпревращающего фермента (капотен, рамиприл и др.), не только понижающих артериальное давление, но и уменьшающих степень гипертрофии левого желудочка, поражения сосудов и благоприятно влияющих на течение атеросклероза. [М.Д. Машковский, «Лекарственное средство», т. 1,2, М., 2000; Д.А.Харкевич, «Фармакология», М., 2004].

Однако все описанные выше средства и препараты требуют частого (1-3 раза в сутки) и длительного применения, и не обеспечивают иммунологической толерантности к ангиотензину-II (гипертензину-II).

Известна наиболее близкая по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению вакцина против гипертонии (вакцина PMD 3117, Protherics Molecular Design Ltd., Великобритания), представляющая собой конъюгат высокомолекулярного белка (предположительно, столбнячного токсина) с ангиотензином. Причем использован аналог ангиотензина-I, состоящий из 12-ти аминокислотных остатков. Более подробных сведений о составе вакцины до настоящего времени не опубликовано. [см. Медицинские новости Солвей Фарма, 22.05.2003. Источник: Cardiosite.ru].

При клинических исследованиях вакцины-прототипа ее авторами установлено длительное повышение титра антител к активным компонентам рениновой системы, время полужизни вакцины составляет 80-90 дней, однако какой-либо динамики со стороны артериального давления не наблюдалось даже после 3-4 инъекций, при этом в ряде случаев отмечалась отечность и зуд в месте инъекции.

Задачей настоящего изобретения является создание безвредной вакцины пролонгированного действия (6-12 месяцев), позволяющей проводить вакцинацию пациентов любого возраста и при различной степени развития гипертонической болезни, в т.ч. осложненных формах заболевания (стеноз почечных артерий и т.п.).

Поставленная задача решается тем, что в известной вакцине против гипертонии, представляющей собой конъюгат высокомолекулярного белка с ангиотензином, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ, конъюгат содержит ангиотензин-II при соотношении, вес.%:

высокомолекулярный белок: ангиотензин-II = 1:12÷55,

причем конъюгат модифицирован равновесным количеством иммунокомпетентного полиэлектролита - полиоксидония.

Ангиотензин-II - это пептидный гормон, поэтому его свойства в составе конъюгата изменяются, а при этом полиэлектролит обеспечивает адъювантные свойства вакцины в целом. Из регуляторного гормона ангиотензин-II становится полноценным антигеном и способен вызывать в организме человека иммунный ответ в виде выработки антител к избытку аналогичных молекул.

Предлагаемая вакцина вызывает процессы в рамках иммунной системы: миграцию и взаимодействие Т- и В-лимфоцитов, функционирование NK-клеток и макрофагов. Под влиянием вакцины развивается синтез антител в ответ на эндогенные вещества. Фагоциты активнее захватывают и переваривают частицы антигена. В течение 70 суток от начала иммунизации заявляемой вакциной индуцируется образование мононуклеарных клеток селезенки, в организме накапливаются антитела, способные связывать ангиотензин-II с развитием стойкого гипотензивного эффекта.

Использование предлагаемой вакцины также эффективно при осложненных формах гипертонической болезни, например, стенозе почечных артерий (одном из ведущих патогенетических факторов гипертонической болезни), нарушении мозгового кровотока, облитерации периферических сосудов, гипертрофии миокарда.

При этом заявляемые соотношения компонентов в вакцине против гипертонии необходимы и достаточны для развития продолжительной толерантности к гипертензивным пептидам (ангиотензин-II) без применения антигипертензивной лекарственной терапии. Это позволяет:

- избежать побочных действий фармакологических средств;

- получить физиологическую реакцию организма на длительный срок (6-12 месяцев);

- применять вакцинацию в любом возрасте и при различной степени развития гипертонической болезни.

Следует отметить, что из литературных источников известны синтетические иммуногены, состоящие из носителя - полиоксидония (N-оксидированного производного полиэтиленпиперазина с высоким молекулярным весом) и гаптена - высокомолекулярного соединения, например фермента гиалуронидазы, или смеси гемагглютинина и нейрамидазы, или холерного токсина, или тритонового экстракта (гликопептида) клеточных стенок микобактерий БЦЖ, или др.

[см., например, п. РФ №2021816, МПК А 61 К 39/106, заявл. 5.06.91 г., опубл. 30.10.94 г.; ж. «Иммунология» №6, тематический выпуск, 2002, и др.].

Несмотря на то, что входящий в состав известных иммуногенов полиоксидоний обладает уникальными свойствами (способностью приводить в движение все факторы защиты организма, воспроизводимостью химической структуры, отсутствием балластных примесей, ярко выраженной иммуностимулирующей активностью, детоксицирующим, антиоксидантным и мембраностабилизирующим эффектами), описанные препараты могут быть применены только для лечения острых и хронических бактериальных или вирусных инфекций из-за наличия в них специфических гаптенов.

Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня исследуемой техники, что свидетельствует о его соответствии критерию «новизна».

Сущность настоящего изобретения для специалиста не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «изобретательский уровень».

Возможность приготовления вакцины против гипертонии из доступных промышленно-выпускаемых компонентов на традиционном оборудовании с помощью известных методик свидетельствует о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Для приготовления заявляемой вакцины против гипертонии использовали следующие промышленно-выпускаемые или самостоятельно синтезированные компоненты, приведенные в табл.1.

Таблица 1.

ВеществаПроизводительАльбумин бычий сывороточныйПредприятие по производству бактерийных препаратов Бел. НИИЭМ, сертификат №17 Московская химическая компания «Лаверна», расфасовка ЗАО «Индикатор»,Синтетические полипептиды, состоящие из хаотично полимеризованных L- и D-аминокислотСамостоятельный синтез из аминокислот производства компании «Реанал», БолгарияМикробные токсины (дифтерийный, столбнячный, стрептококковый, ботуллинистический)Выделены из культурАнгиотензин -IIICN Biomedicals is now MP BiomedicalsПолиоксидонийГНЦ «Институт иммунологии»

Приготовление вакцины против гипертонии осуществляли по известным традиционным методикам.

Методика 1.

Для синтеза использовали высокомолекулярный белок (альбумин бычий сывороточный, синтетические полипептиды, микробные токсины: дифтерийный, столбнячный, стрептококковый, ботуллинистический) и ангиотензин - II при соотношении, вес.%:

Высокомолекулярный белок: ангиотензин-II = 1:12÷55.

К раствору 50 мг (0,1 ммоль) - 50 вес.% ангиотензина - II (или 12 мг - 12 вес.% или 55 мг - 55 вес.%) добавляли глутаровый альдегид 80 мг (0,08 ммоль) и раствор высокомолекулярного белка - столбнячного токсина 120 мг ( 0,001 ммоль) - 1 вес.% (или других микробных токсинов, или альбумина бычьего сывороточного, или синтетических полипептидов). Полученный состав инкубировали при комнатной температуре в течение часа при постоянном перемешивании, затем проводили диализ в течение суток, добавляли антитела и снова инкубировали в таких же условиях.

Ангиотензин-NH₂+O=СН-(СН₂)₃-СН=O + Столбнячный токсин-NH₂> Ангиотензин-N=СН-(СН₂)₃-СН=Н-Столбнячный токсин

Для образования прочной ковалентной связи между коньюгированным пептидом - ангиотензином-II и высокомолекулярным белком проводили реакцию восстановления основания Шиффа. Для этого через час добавляли боргидрид натрия. Затем проводили диализ против фосфатного буфера.

Ангиотензин-N=CH-(CH₂)₃-CH=N-Столбнячный токсин + NaBH₄> Ангиотензин-NH-CH₂-(CH₂)₃-CH₂-HN- Столбнячный токсин

Конъюгат модифицировали равновесным количеством иммунокомпетентного полиэлектролита - полиоксидония, предварительно активированного известным путем (см., например, п. №1580617, в котором N-гидроксисукцинимид заменен на р-нитрофенол).

Методика 2.

Готовили смесь: 12,5 мг (12 вес.%, или 41,6 мг - 40 вес.% или 57,3 мг - 55 вес.%) ангиотензина-II, 30 мг (1 вес.%) столбнячного токсина (или других микробных токсинов, или альбумина бычьего сывороточного, или синтетических полипептидов), 12 мг водорастворимого карбодимида в 5 мл воды.

Реакционную смесь выдерживали 10 часов при 4°С, и получаемый конъюгат выделяли гель-хроматографией на сефадексе G-25.

Конъюгат модифицировали полиоксидонием так же, как описано в методике 1.

Вакцину вводили экспериментальным животным в виде раствора внутримышечно в количестве 0,5 мл. Время активной иммунной реакции определяли стандартными методами: РИГА, РТПГА, ИФА, РИА.

Доклинические исследования.

В специальной серии опытов методом биологической пробы была выяснена возможность использования вакцины против гипертонии на животных. Группе контрольных животных - четыре неиммунизированных кролика и опытной группе - четыре иммунизированных кролика внутривенно вводили по 1 мг ангиотензина-II в 1 мл воды для инъекций. Было установлено, что все четыре кролика контрольной группы показали увеличение артериального давления до гипертензивных показателей (более 130/80 мм рт. ст.). Среди иммунизированных кроликов увеличения гипертензивных показателей не зарегистрировано ни в одном из четырех случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита.

Также проводили исследования сыворотки крови иммунизированных животных.

Восемь кроликов весом каждый по 2 кг иммунизировали вакциной против гипертонии, которую вводили внутримышечно по 30 мг/кг. В сыворотке крови животных до иммунизации и после нее определяли наличие антител к препаратам: ангиотензиногену, ангиотензину-I (AT-I), ангиотензину-II (AT-II), ангиотензину-III (АТ-III) и изучали их специфичность в реакции торможения пассивной гемагглютинации стандартными методами.

Иммунизация кроликов вакциной по приведенной схеме приводила к появлению в сыворотке крови высоких титров антител к иммунокомплексу вакцины (1:2560). В реакции торможения пассивной гемагглютинации было установлено, что образующиеся антитела связывают AT-I, AT-II, AT-III: титр антител к иммунокомплексу уменьшался до 1:320 при использовании концентрации 0,001, что свидетельствует о наличии антител к этим соединениям.

Таким образом, синтезированная вакцина специфически связывает AT-II не только in vitro, но и в целом организме.

Специфичность антител против Ангиотензиногена, AT-I, AT-II, AT-III в кроличьей иммунной сыворотке, представлена в табл.2.

Таблица 2

НаименованиеОтносительная специфичность антител, %Ангиотензиноген0,05AT-I0,06AT-II100AT-III100

Из полученных данных видно, что связывание AT-II зависит от наличия в их молекулах определенных аминокислотных последовательностей. Так, в частности, высокая специфичность антител к AT-II и AT-III обусловлена отсутствием в вакцине аминокислот, присутствующих в AT-I и ангиотензиногене. Таким образом, образующиеся антитела обладают высокой специфичностью к AT-II и AT-III.

Учитывая результаты экспериментов, авторы пришли к выводу о том, что AT-II пригоден для синтеза вакцины против гипертонии. Его химическая структура содержит аминокислотную последовательность для формирования иммунного ответа и синтеза высокоаффинных антител к AT-II.

Заявляемую вакцину против гипертонии синтезировали в условиях кафедры фармакологии Уральской медицинской академии и многократно испытывали на лабораторных животных.

Контролем эффективности считали отсутствие гипертензивной реакции на введение ангиотензинамида или синтетического аналога ангиотензина-II. Кроме этого, для контроля эффективности вакцинации проводили количественный анализ содержания антител в плазме крови 1 раз в 3-12 месяцев. Самыми информативньми методами являются радиоиммунный анализ (РИА) и иммуноферментный анализ (ИФА). При снижении количества антител в крови ниже необходимого уровня следует проводить ревакцинацию. Никаких отрицательных явлений, связанных с вакцинацией, не наблюдали.

Пример 1.

Тридцать половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали вакциной против гипертонии, содержащей высокомолекулярный белок - альбумин бычий сывороточный (1 вес.%), ангиотензин-II (12 вес.%) и полиоксидоний, из расчета 50 мг/кг.

Вводили 1 мг ангиотензина-II внутривенно.

Аналогичным образом осуществляли исследование вакцины против гипертонии в примерах 2 и 3, в которых варьировали используемые высокомолекулярные белки и соотношение компонентов конъюгата в заявляемых пределах.

Составы вакцины против гипертонии и ее фармакологическое действие приведены в таблице.

Как видно из примеров и данных таблицы использование заявляемой вакцины против гипертонии по сравнению с опубликованньми данными об известной, взятой за прототип, вакциной PMD 3117, Protherics Molecular Design Ltd., Великобритания [см. Медицинские новости Солвей Фарма, 22.05.2003. Источник: Cardiosite.ru], обеспечивает следующие технические и общественно-полезные преимущества:

- отсутствие побочных действий фармакологических средств;

- устойчивую физиологическую реакцию организма на длительный срок (6-12 месяцев);

- возможность применения вакцинации в любом возрасте и при различной степени развития гипертонической болезни.

Составы вакцины против гипертонии и ее фармакологическое действие, представлена в табл.3.

Таблица 3ПримерыСостав вакцины:СоотношениеФармакологическое 1.ВысокомолекулярныйВысокомолекулярныйдействие вакцины белокбелок: 1. Отсутствие 2. Ангиотензин-IIАнгиотензин-II,побочных действий 3. Полиоксидонийвес.%лекарств   2. Устойчивость   физиологической   реакции организма   РИА 1 мл - пмоль:   а) через 3 месяца,   б) через 6 месяцев,   в) через 12 месяцев11. Альбумин бычий1:121.+ сывороточный 2. 2.+ а)10500, 3.+ б)10300,   в)1020021. Столбнячный 1:301.+ токсин 2. 2.+ а)12500, 3.+ б)12400,   в)1225031. Стрептококковый1:551.+ токсин 2. 2.+ а)13000, 3.+ б)12950,   в)12770

Примечание: при использовании в вакцине в качестве высокомолекулярного белка синтетических пептидов или других микробных токсинов (например, дифтерийного, ботуллинистического и т.д.) или варьировании соотношения (высокомолекулярный белок: ангиотензин-II), фармакологическое действие вакцины аналогично указанному в таблице.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, терапии гипертонической болезни и профилактики гипертонических кризов. Сущность изобретения: вакцина против гипертонии представляет собой конъюгат высокомолекулярного белка с ангиотензином-II при соотношении, вес.%: высокомолекулярный белок: ангиотензин-II - 1:12÷55, причем конъюгат модифицирован равновесным количеством иммунокомпетентного полиэлектролита - полиоксидония. Преимущество изобретения заключается в устойчивой физиологической реакции организма на длительный срок (6-12 месяцев). 3 табл.

Вакцина против гипертонии, представляющая собой конъюгат высокомолекулярного белка с ангиотензином, отличающаяся тем, что конъюгат содержит ангиотензин-II при соотношении, вес.%: высокомолекулярный белок: ангиотензин-II = 1:12÷55, причем конъюгат модифицирован равновесным количеством иммунокомпетентного полиэлектролита - полиоксидония.