СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ХЛАМИДИОЗА У ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способам получения биопрепаратов для лечения инфекционных болезней животных.

Перспективным направлением в специфической терапии хламидийных инфекций животных является применение лечебных гипериммунных сывороток [1, 2]. Существенными недостатками иммунных сывороток является низкая концентрация иммуноглобулинов (требует увеличения лечебных доз препаратов для достижения терапевтического эффекта) и различные побочные реакции, в т.ч. "сывороточная болезнь" и анафилактический шок. В распоряжении практикующих ветеринарных врачей нет иммуноглобулиновых биопрепаратов для пассивной профилактики и терапии при хламидиозе плотоядных животных.

В качестве прототипа изобретения рассматриваем способ получения иммуноглобулинов для лечения чумы, парвовирусного энтерита, аденовирусного гепатита плотоядных, разработанный сотрудниками Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения РАСХН (г. Новосибирск) [3], включающий иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм культуральных вирусных антигенов.

В качестве животных-доноров были использованы овцы или козы. Иммунизацию вирусным антигеном проводили вначале подкожно с неполным и полным адъювантом Фрейнда, а затем без адъюванта Фрейнда. Животных периодически ревакцинировали с тем же титром и дозой антигена без адъюванта Фрейнда. Забор крови у доноров осуществляли периодически с последующим выделением иммуноглобулинов и их очисткой. Иммуноглобулины выделяли осаждением их солями с последующей очисткой препаративной хроматографией.

Цель изобретения: получение в больших объемах иммуноглобулинов для специфической терапии хламидиоза у плотоядных животных (пушных зверей, собак и кошек), обладающих высокой специфичностью и активностью.

Поставленная цель решается тем, что способ включает иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм бактериального антигена с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител, после чего осуществляют забор крови с последующим выделением из нее специфических иммуноглобулинов.

Предлагаемый способ получения иммуноглобулинов для специфической терапии хламидиоза у плотоядных животных отличается от прототипа (иммуноглобулина против чумы, парвовироза и аденовироза плотоядных) тем, что в качестве антигена используются очищенные культуры хламидий, выделенные от плотоядных животных, в качестве животных-доноров используют быков, за 45 дней до начала собственно гипериммунизации проводится специфическая "грундировка" животных-продуцентов, иммунизацию хламидийным антигеном проводят вначале подкожно с полным адъювантом Фрейнда, а затем внутримышечно с неполным адъювантом Фрейнда с увеличением дозы на всех этапах иммунизации на 5 мл, забор крови у животных осуществляют периодически после достижения титра специфических хламидийных антител в крови животных доноров не менее 1:40 в реакции связывания комплемента, иммуноглобулины выделяют осаждением их насыщенным раствором сульфатом аммония.

Использование в качестве животных-доноров быков позволяет получать противохламидийные гипериммунные сыворотки с высоким содержанием специфических иммуноглобулинов [2], т.к. указанные животные обладают высокой реактивностью к антигенам хламидий. Кроме того, иммунизация быков позволяет получать более дешевые биопрепараты в больших объемах.

Способ получения лечебных иммуноглобулинов осуществляют следующим образом.

Пример 1. При изготовлении антигена, предназначенного для иммунизации быков-продуцентов, использовали штаммы хламидий: "БЛ-84" - возбудитель хламидиоза лисиц; "ПП-87" - возбудитель хламидиоза песцов; "КС-93" - возбудитель хламидиоза собак, "КК-99" - возбудитель хламидиоза кошек.

Биомассу хламидий получали из лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института. Клетки желточных мешков куриных эмбрионов, содержащие хламидии, разрушили трехкратным озвучиванием по 30 секунд на ультразвуковом дезинтеграторе.

От клеточного дебриса освобождались дифференциальным и градиентным центрифугированием по схеме:

I этап: Приготовление 10%-ной суспензии инфицированных желточных (3 раза) мешков КЭ на 0,2М ФБ (рН 7,2-7,4); центрифугирование взвеси при 2000g 20 мин; осаждение надосадка при 45000g 60 мин, гомогенизирование осадка в 0,2 М ФБ (рН 7,2-7,4);

II этап: Гомогенизированный после 3-го цикла осадок наслаивали на 30%-ный раствор сахарозы на 0,01М ФБ (рН 7,2-7,4) и "продавливали" при 45000g 60 мин.

III этап: Гомогенизация осадка, наслоение на ступенчатый градиент сахарозы (30, 45, 60%) и центрифугирование при 45000g 120 мин.

IV этап: Сбор фракций хламидий путем прокола стенки стакана и разбавление взвеси в 10-кратном объеме 0,2М ФБ (рН 7,2-7,4).

V этап: Отмывка хламидий от сахарозы путем осаждения при 45000g 60 мин, гомогенизация осадка в 0,15М раствор NaCl (рН 7,2-7,4).

VI этап: Стандартизация полученной взвеси по оптической плотности (ОП).

Гомогенность взвеси и содержание в ней элементарных телец хламидий контролировали путем световой микроскопии в иммерсионной системе. К бактериальной суспензии добавляли формальдегид (0,2% в конечной концентрации) и инактивировали хламидии при 37-38°С в течение 48 часов.

Готовый для иммунизации антиген тестировали на стерильность путем посева на питательные общепринятые среды (МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро), а также на инфекционность путем контрольного заражения белых мышей. Стерильные в отношении неспецифической бактериальной и грибковой микрофлоры, не вызывающие гибель белых мышей суспензии, использовали для гипериммунизации быков. Схема гипериммунизации представлена в таблице 1.

Таблица 1
1. Схема гипериммунизации быков-продуцентовЭтапы иммунизацииДни иммунизацииДоза антигена (мл)Состав инъекционной дозыСпособ введения"Грундировка"1-ый5АГ+ПАФподкожноI45-ый10АГ+НАФвнутримышечноII60-ый15АГ+НАФвнутримышечноIII75-ый20АГ+НАФвнутримышечноIV90-ый25АГ+НАФвнутримышечноОбозначения: АГ - антиген, ПАФ - полный адъювант Фрейнда, НАФ - неполный адъювант Фрейнда.

"Грундировку" животных-продуцентов проводили за 45 дней до начала собственно гипериммунизации. Первое введение антигена проводили подкожно (предварительно эмульгировав его в ПАФ), последующие - внутримышечно (в качестве эмульгатора использовали НАФ).

Первое введения антигена собственно гипериммунизации производили через 45 дней после "грундировки", предварительно отобрав животных с иммунным ответом на первое введением антигена. Интервалы между 2-ым и последующими введениями антигенов составляли 14-15 дней. Доза первого введения эмульсии антигена составляла 5 мл, на каждом последующем этапе гипериммунизации дозу антигена увеличивали на 5 мл.

Крововзятие проводили через 20 дней после последнего, предусмотренного схемой, введения антигена. Производственное крововзятие проводили, если уровень специфических противохламидийных антител в сыворотке крови животного-продуцента не ниже 1:40 в реакции связывания комплемента.

Пример 2. Материалом для изготовления иммуноглобулина являлась стерильная сыворотка, полученная из крови быков-продуцентов.

Для выделения иммуноглобулина применялась одна из модификаций способа, основанного на фракционировании сывороточных белков с помощью сульфата аммония при комнатной температуре. Осадок глобулинов после последнего центрифугирования растворяли дистиллированной водой (в объеме 1/4 часть от первоначального объема сыворотки).

Диализ раствора глобулина проводили против дистиллированной воды, содержащей 0,01% тиомерсаля в течение 2-х суток при комнатной температуре, меняя дважды в сутки дистиллированную воду. После диализа концентрацию иммуноглобулина доводили до 5 или 10%±0,5.

Препарат осветляли путем пропускания через крупнопористые фильтры. Осветленные растворы подвергли стерилизующей фильтрации через асбестовые пластины, керамические свечи или нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 22 мкм, рН раствора иммуноглобулина доводили до 7,0-7,5.

Пример 3. Определение безвредности иммуноглобулина осуществляли на клинически здоровых лабораторных животных путем введения биопрепарата морским свинкам и белым мышам. В течение 5 дней после введения препарата у свинок не было ни реакций на месте введения, ни падения в весе, мыши оставались клинически здоровыми.

При проведении испытания на пирогенность ни у одного из трех клинически подопытных кроликов температура не повышалась более чем на один градус.

Реактогенность препарата была испытана на здоровых собаках и кошках, которые предварительно были исследованы в отношении хламидийных инфекций. Из животных, которые дали отрицательные результаты лабораторных исследований, были сформированы четыре группы: две группы собак и две - кошек (по 5 животных в каждой). Одной группе собак и одной группе кошек специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных наносили при помощи пипетки на конъюнктиву (одного глаза) в количестве 3-4 капли на одно животное. Другим группам собак и кошек специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных вводили внутримышечно в области бедра в дозе 0,2 мл на кг массы животного. За подопытными животными вели наблюдение в течение 10 дней, обращая внимание на клиническое состояние и температуру тела животных. В результате было установлено, что препарат не вызывает изменения клинического состояния и повышения температуры опытных животных.

Лечебную эффективность препарата в лабораторных условиях испытывали на экспериментально зараженных хламидиями белых мышах. 30 лабораторных животных внутрибрюшинно заражали вирулентной культурой хламидий штамма "250". Специфический иммуноглобулин против хламидиоза плотоядных животных вводили 20 инфицированным белым мышам, начиная с 4 дня после заражения, трехкратно с интервалом 24 часа подкожно (10 голов) и внутримышечно (10 голов) в дозе 0,01 мл на одно животное. Контролем служили 10 зараженных белых мышей. Все контрольные животные после заражения пали.

Результаты трех серий опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2
2. Выживаемость инфицированных белых мышей после лечения специфическим иммуноглобулином против хламидиозаСпособ введения биопрепаратаКоличество животныхРезультаты контрольного инфицированияЭффективность лечения (%)Паловыжилоподкожно30161446,7внутримышечно30121860,0ВСЕГО60283253,3контроль3030-0,0

Пример 4. Испытания терапевтической эффективности препарата проводились на собаках и кошках, владельцы которых обращались за ветеринарной помощью в клиники. Подозрительные по заражению домашние плотоядные подвергались исследованию на хламидиоз лабораторными методами. В случае установления диагноза лабораторными методами животным назначали лечение, которое включало: этиотропную, патогенетическую и симптоматическую терапию.

В качестве этиотропных средств животным назначали антибиотики: макролиды, фторхинолоны и тетрациклины. При конъюнктивитах наряду с общей антибиотикотерапией местно применяли тетрациклиновую или эритромициновую глазную мазь 3-6 раз в сутки.

Патогенетическая терапия включала применение: пробиотиков, иммуностимуляторов, десенсибилизирующих препаратов, интерферона, гепатопротекторов и витаминов.

В качестве симптоматической терапии животным промывали слизистые оболочки глаз, носа и половых органов антисептическими растворами: фуроциллина, перманганата калия, риванола и т.п.

Всего лечению было подвергнуто 39 животных с различными симптомами, которым лабораторными методами был поставлен диагноз: "хламидиоз". 26 животным из числа вышеназванных, кроме указанных лечебных мероприятий, назначали специфическую терапию с использованием разработанного иммуноглобулина против хламидиоза плотоядных животных. Препарат вводили больным собакам и кошкам внутримышечно в области бедра один раз в сутки пять дней подряд в дозе 0,2 мл/кг массы.

Назначая собакам и кошкам, больным хламидиозом, разработанный препарат, удалось вылечить на 15,4% животных больше, чем используя только традиционные схемы лечения заболевания.

Источники информации

1. Обухов И.Л., Панин А.Н., Груздев К.Н., Васильев Д.А., Юртаев П.В. Гипериммунная сыворотка против хламидиоза животных / Тез. докл. 2-ой Меж-дунар. науч.-практ. конф. "Актуал. пробл. вет.-санитар. контроля с.-х. продукции". - М., 1997. - Ч.2. - С.122.

2. Хамадеев Р.Х., Шарафутдинова К.Н., Васлянина В.И. и др. Изготовление полиспецифической сыворотки против вирусов адено-, парагриппа-3 и хламидий, выделенных от овец / Сб. науч.тр. КВИ. - Казань, 1985. - С.23-26.

3. Шестопалов А.М., Константинов А.П., Дурыманов А.Г. Способ получения иммуноглобулинов для лечения чумы ("Иммуночум") или парвовирусного энтерита ("Иммунопарв"), или аденовирусного гепатита ("Иммуногепс") плотоядных. - Патент РФ №94014835, опубл. 20.10.98 г.

Изобретение относится к области ветеринарии. В качестве антигена используют очищенные культуры хламидий, выделенные от плотоядных животных. В качестве животных-доноров используют быков. Иммунизацию хламидийным антигеном проводят вначале подкожно с полным адъювантом Фрейнда, а затем внутримышечно с неполным адъювантом Фрейнда с увеличением дозы на всех этапах иммунизации на 5 мл. Забор крови у животных осуществляют периодически после достижения титра специфических хламидийных антител в крови животных доноров не менее 1:40 в реакции связывания комплемента. Иммуноглобулины выделяют осаждением их насыщенным раствором сульфатом аммония. Для изготовления антигена, предназначенного для иммунизации, используют штаммы хламидий, выделенные от лисиц, песцов, собак и кошек. Препарат стерилен, безвреден для лабораторных животных, не обладает пирогенностью, не реактогенен для собак и кошек, снижает вирулентность хламидий на 53,3%, на 15,4% повышает эффективность терапии хламидийных инфекций при сочетании с традиционными схемами лечения. 2 табл.

Способ получения иммуноглобулинов для специфической терапии хламидиоза у плотоядных животных, включающий иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм бактериального антигена с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител, после чего осуществляют забор крови с последующим выделением из нее специфических иммуноглобулинов, отличающийся тем, что в качестве антигена используют очищенные культуры хламидий, выделенные от плотоядных животных, в качестве животных-доноров используют быков, за 45 дней до начала собственно гипериммунизации проводится специфическая «грундировка» животных-продуцентов, иммунизацию хламидийным антигеном проводят вначале подкожно с полным адъювантом Фрейнда, а затем внутримышечно с неполным адъювантом Фрейнда с увеличением дозы на всех этапах иммунизации на 5 мл, забор крови у животных осуществляют периодически после достижения титра специфических хламидийных антител в крови животных доноров не менее 1: 40 в реакции связывания комплемента, иммуноглобулины выделяют осаждением их насыщенным раствором сульфата аммония.