Способ получения иммунной хламидийной сыворотки Советский патент 1992 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к способу получения иммунных сывороток, и может быть использовано при производстве диагностических препаратов.

Известен способ получения иммунной хламидийной сыворотки путем заражения суягных овцематок возбудителем хламидиозного аборта овец и забора крови через 1 мес после аборта.

Недостатками прототипа являются: зависимость от физиологического состояния овец; отсутствие точного метода определения срока суягности овец; использование живого возбудителя хламидиозного аборта овец - в некоторых случаях наблюдается

гибель и неспецифические аборты из-за токсического действия хламидий; невысокая активность сыворотки при получении в производственных условиях.

Целью изобретения является упрощение способа получения иммунной хламидийной сыворотки, повышение ее активности и специфичности.

Поставленная цель достигается тем, что несуягным овцам или баранам однократно внутримышечно вводят очищенные и концентрированные элементарные тельца возбудителя хламидиозного аборта овец после инактивации формалином в смеси с неполным адъювантом Фрейнда в

vj о

СА) 00 U

соотношении 1:2. Через 1 мес после инъекции антигена овец тотально обескровливают,

П р и м е р 1. Возбудителем хламидиоз- ного аборта овец заражают 300 куриных эмбрионов (КЭ) в желточный мешок. КЭ, погибшие в первые 3 дня после инокуляции, выбраковывают, а погибшие на 4-10 дни вскрывают для отбора желточной оболочки.

Для приготовления антигена -иммуно- гена используют 10%-ную взвесь желточных оболочек КЭ, приготовленную на 0,2 М фосфатном буфере (ФБ) рН 7,2-7,4 путем растирания в ступке. Хламидии из 10%-ной взвеси концентрируют и очищают путем центрифугирования дифференциального и в ступенчатом градинте сахарозы по следующей схеме:

10%-ная хламидийсодержащая взвесь;

центрифугирование при 2500 об/мин в течение 20 мин;i

центрифугирование надосадочной жидкости при 18000 об/мин в течение 40 мин;

гомогенизация осадка в 0,01 М ФБ рН 7,2-7,4, наслоение на 30%-ную сахарозу на 0,ОШ ФБ и центрифугирование при 20000 об/мин в течение 60 мин;

гомогенизация осадка в 0,01 М ФБ и наслоение на ступенчатый градиент сахарозы (снизу вверх 60%, 45% и 30%) и центрифугирование при 20000 об/мин в течение 60 мин;

сбор хламидий между 45 и 30%-ными растворами сахарозы и отмывание в 0,01 М ФБ путем центрифугирования при 18000 об/мин в текчение 40 мин; j

гомогенизация осадка в 0,2М ФБ, определение оптической плотности взвеси хламидий на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм и вычисление количества белка в 1 мл.

Взвесь хламидий с содержанием белка 120 мкг/мл инактивируютО,4%-ным формалином (конечная концентрация) при 37°С. в течение 5 сут, смешивают с неполным адь- ювантом Фрейнда в соотношении 1:2 и вводят несуягным овцам или баранам внутримышечно с внутренней поверхности бедра в обе конечности (по 5 мл в каждую сторону). Через 1 месяц после иммунизации производят тотальное обескровливание и исследуют сыворотки в РСК и РЭМА на содержание специфических хламидийных антител (табл.1).

Как свидетельствуют данные табл.1, внутримышечное введение несуягным овцам как живых, так и инактивированных хламидий в смеси с неполным адьювантом Фрейнда позволяет получить высокоактив

5

0

5

0

5

0

5

0

0

5

ные сыворотки. Антитела к контрольному антигену, изготовленному из желтолчных оболочек неинфицированных КЭ, в хламидийных сыворотках ни в РСК, ни в РЭМА не обнаружены.

П р и м е р 2. Проводились опыты с целью выяснения влияния способа введения специфического антигена на серологическую активность иммунной сыворотки.

Антиген для иммунизации готовят так же, как и в примере 1.

Смесь антигена с неполным адъюван- том Фрейнда в соотношении 1:2 вводят несуягным овцам или баранам внутрикожно вдоль позвоночника с обеих сторон (в 15 точек с каждой стороны по 0,35 мл). Общий объем введенной смеси составляет 10 мл. Через 1 месяц после инъекции антигена производят тотальное обескровливание и исследование сывороток крови в РСК и РЭМА на содержание специфических хламидийных антител (табл,2).

Как видно из табл.2 внутрикожное введение хламидий в смеси с неполным адъю- вантом Фрейда также приводит к выработке высокоактивных и специфических антител. Однако следует заметить трудоемкость внут- рикожного способа инъекции антигена по сравнению с внутримышечными, особенно в производственных условиях,

П р и м е р 3. Опыты по сравнительному испытанию предложенного способа по изобретению и по прототипу,

С этой целью в качестве подопытных животных берут 3 группы по 5 голов:

1группа (прототип) - овцы 2,5-месячной суягности, которых заражают интратрахе- ально и подкожно по 5 мл 20%-ной взвесью желточных оболочек КЭ, инфицированных возбудителем аборта овец, имеющей инфекционный титр в 107 КЭЛД 50/0,3 мл;

2группа (по изобретению) - несуягные овцы;

3группа (по изобретению) - бараны возраста 2-3 лет, с живой массой не менее 45 кг. Животных 2 и 3 групп иммунизируют согласно схеме по примеру 1 инактивиро- ванным возбудителем.

Из 1 группы 1 овца оказалась несуягной. Иммунная хламидийная сыворотка у овец этой группы получена через 2 месяца после заражения, у животных 2 и 3 групп - через 1 месяц. Результаты излучения активности сывороток в РЭМА и РСК представлены в табл.3.

Данные таблицы показывают, что предлагаемый способ позволяет изготовить высокоактивную и специфическую хла- мидийную сыворотку и упростить технологию ее производства за счет замены суягных овец несуягными или баранами.

Технико-экономическая эффективность предложенного технического решения в сравнении с прототипом заключается в замене суягных овец несуягными или баранами для получения иммунной сыворотки, необходимой для набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хла- мидиозного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз и разрабатываемых наборов для выявления хлами- дийных антител и антигенов в РЭМА.

Формула изобретения

Способ получения иммунной хламидий- ной сыворотки, предусматривающий однократную иммунизацию продуцентов антигеном из очищенных и концентрированных хламидий, взятие крови с последующим выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения

способа, повышения активности, специфичности и выходе сыворотки, в качестве продуцентов используют несуягных овец или баранов, а иммунизацию проводят внутримышечно антигеном из иннактивированной

культуры возбудителя хламидиоза с неполным альювантом Фрейнда, взятых в объемном соотношении 1:2 соответственно,

Использование ветеринарная микробиология, биотехнология, иммунная сыворотка, диагностические препараты, хламидиоз. Сущность изобретения: возбудитель хламидиозного аборта овец, выращенный на желточной оболочке куриных эмбрионов, подвергается очистке и концентрированию путем центрифугирования дифференциального и в ступенчатом градиенте сахарозы. В дальнейшем взвесь элементарных телец хламидий (содержание белка 120 мкг/мл) инактивируется 0,4%-ным формалином (конечная концентрация), смешивается с неполным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:2 и однократно внутримышечно вводится несуягным овцам в количестве 10 мл (по 5 мл с внутренней поверхности бедра в обе конечности). Через 1 месяц после инъекции антигена овцы тотально обескровливают, отделяют сыворотку и консервируют фенолом. 3 табл. (Л С

Приведены обратные величины титров антител.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3