СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОГО ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА, ХЛАМИДИЙНЫЙ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/571 G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается способа получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата, хламидийного люминесцирующего диагностического препарата и способа диагностики хламидийных инфекций. Изобретение может использоваться в клинической и лабораторной практике.

Известен способ получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата путем поэтапной иммунизации мышей плавно возрастающими дозами антигенного материала, представляющего собой суспензию, состоящую из смеси живых хламидий различных видов, причем на заключительном этапе иммунизации антигенный материал вводят внутривенно, введения мышам клеток асцит-саркомы, сбора иммунной асцитической жидкости (ИАЖ), выделения из ИАЖ гамма-глобулиновой фракции, метки полученной гамма-глобулиновой фракции, ампулирования и сушки полученного конъюгата (1,3).

Указанный способ позволяет получить хламидийный диагностический люминесцирующий препарат, однако при осуществлении данного способа на заключительном этапе иммунизации применяют внутривенную инъекцию, что усложняет процесс и приводит к потерям животных, и в качестве антигенного материала используют суспензию, состоящую из смеси живых хламидий различных видов без учета наличия в этой смеси всех форм развития хламидий, что ухудшает характеристики готового препарата.

Известен хламидийный люминесцирующий диагностический препарат на основе мышиных гамма-глобулинов к орнитозу, конъюгированных с флуорохромом, лиофильно высушенный (2).

Однако данный хламидийный люминесцирующий диагностический препарат чувствителен только к возбудителю орнитоза (вид Chl.psittaci); при среднем красящем титре 1/16 содержимого одной ампулы хватает на 160 исследований, что зачастую превышает недельную потребность даже крупных лабораторий (в течение недели сохраняется высокая специфическая активность препарата, а затем наблюдается заметное ее снижение); при использовании препарата необходимо добавлять контрастирующее вещество в достаточно сложной пропорции.

Известен способ диагностики хламидийных инфекций путем обработки исследуемого материала моноклональным хламидийным люминесцирующим диагностическим препаратом, чувствительным к хламидиям вида Chl.trachomatis, и последующего определения наличия антигенов этого вида хламидий в форме элементарных телец (8).

Указанный способ позволяет выявить наличие только айтигенов хламидий вида Chl.trachomatis в форме элементарных телец без диагностики стадии хламидийной инфекции.

Задачей настоящего изобретения является усовершенствование системы диагностики хламидийных инфекций за счет разработки такого способа получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата, который позволил бы упростить способ, снизить потери иммунизируемых животных и получить готовый препарат с улучшенными характеристиками, такого хламидийного люминесцирующего диагностического препарата, который выявлял бы не только один вид хламидий в форме элементарных телец, но и другие виды хламидий во всех формах их развития, и такого способа диагностики хламидийных инфекций, который позволил бы не только выявлять наличие антигенов одного вида хламидий в форме элементарных телец, но и других видов хламидий во всех формах их развития, и диагностировать стадию развития хламидийной инфекции.

Поставленная задача решается заявляемым способом получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата путем поэтапной иммунизации мышей антигенным материалом, представляющим собой суспензию, состоящую из смеси живых хламидий различных видов, введения мышам клеток асцит-саркомы, сбора иммунной асцитической жидкости (ИАЖ), выделения из ИАЖ гамма-глобулиновой фракции, метки полученной гамма-глобулиновой фракции, ампулирования и сушки полученного конъюгата, в котором в качестве антигенного материала используют суспензию, состоящую из смеси всех форм развития живых хламидий различных видов, на заключительном этапе иммунизации животным внутрибрюшинно вводят "ударную" удвоенную дозу антигенного материала.

В частном случае реализации заявляемого способа перед ампулированием меченую гамма-глобулиновую фракцию смешивают с контрастирующим веществом, например с альбумином, меченным родамином, или с Evans blue в рабочих разведениях для получения готового препарата, содержащего контрастирующее вещество.

В другом частном случае реализации заявляемого способа на стадии ампулирования меченую гамма-глобулиновую фракцию разливают в ампулы объемом 0,3-0,5 мл для получения удобного количества препарата, необходимого для 30-50 исследований, что составляет среднюю недельную потребность в нем.

Новым в заявляемом способе являются:
- состав суспензии антигенного материала, включающий смесь всех форм развития живых хламидий различных видов, что позволяет получить препарат, способный выявлять все формы развития хламидий;
- увеличенная вдвое "ударная" доза антигенного материала, вводимого на заключительном этапе иммунизации мышей, что приводит к увеличению серологической активности ИАЖ и увеличению выхода готового препарата;
- внутрибрюшинное введение удвоенной дозы антигенного материала на заключительном этапе иммунизации мышей, что упрощает способ и снижает потери иммунизируемых животных.

Поставленная задача решается также заявляемым хламидийным люминесцирующим диагностическим препаратом на основе мышиных гамма-глобулинов к хламидиям, конъюгированных с флуорохромом, лиофильно высушенным, который в качестве мышиных гамма-глобулинов к хламидиям содержит мышиные гамма-глобулины к хламидиям видов Chl.psittaci, Chl.trachomatis, Chl.pneumoniae всех форм их развития, и контрастирующее вещество в рабочих разведениях.

Новым в заявляемом хламидийном люминесцирующем диагностическом препарате является состав мышиных гамма-глобулинов к хламидиям, включающий мышиные гамма-глобулины к хламидиям видов Chl.psittaci, Chl.trachomatis, Chl.pneumoniae всех форм развития хламидий и наличие контрастирующего вещества в рабочих разведениях.

Поставленная задача решается также заявляемым способом диагностики хламидийных инфекций путем обработки исследуемого материала диагностическим препаратом и последующего определения наличия антигенов хламидий, в котором в качестве диагностического препарата используют хламидийный люминесцирующий диагностический препарат на основе мышиных гамма-глобулинов к хламидиям, конъюгированных с флуорохромом, лиофильно высушенный, который в качестве мышиных гамма-глобулинов к хламидиям содержит мышиные гамма-глобулины к хламидиям видов Chl.psittaci, Chl.trachomatis, Chl.pneumoniae всех форм их развития, и контрастирующее вещество в рабочих разведениях, проводят анализ результатов обработки исследуемого материала указанным диагностическим препаратом и по наличию выявленных антигенов хламидий различных форм развития хламидий диагностируют хламидийную инфекцию разных стадий, причем при наличии только элементарных телец диагностируют острую стадию хламидийной инфекции или обострение хронической хламидийной инфекции, при наличии элементарных телец, ретикулярных телец и цитоплазматических включений одновременно - текущую хламидийную инфекцию, при наличии только персистирующей формы - хроническую латентную хламидийную инфекцию.

Новым в заявляемом способе диагностики являются:
- использование нового хламидийного люминесцирующего диагностического препарата, что расширяет спектр выявляемых возбудителей хламидийных инфекций;
- проведение анализа результатов обработки исследуемого материала указанным диагностическим препаратом с учетом наличия не только элементарных телец, но и иных форм развития хламидий, что позволяет диагностировать разные стадии хламидийной инфекции.

Возможность реализации настоящего изобретения с достижением заявляемого технического результата показана далее в подробных примерах.

Пример 1. Способ получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата
Для иммунизации брали беспородных белых мышей массой 18-20 г. В качестве антигенного материала использовали 10%-ную суспензию, содержащую равные количества живых хламидий пситтакоза, энзоотического аборта овец и венерической лимфогранулемы, находящихся во всех формах развития, полученных из органов инфицированных животных (мышей и куриных эмбрионов). Выбор хламидий экспериментально обоснован в изобретении по патенту РФ N 1700823 (3).

Иммунизацию проводили в два этапа.

На первом этапе иммунизации мышам делали две внутримышечных инъекции антигенного материала, полученного из органов инфицированных мышей, смешанного с адъювантом типа адъюванта Фрейнда в равных объемах по 0,1 мл, с интервалом в 7 дней (в 1-й и 8-й дни). Затем, через 28 дней, проводили повторную иммунизацию, в ходе которой мышам делали три внутрибрюшинных инъекции плавно возрастающими дозами антигенного материала, полученного из оболочек желточных мешков инфицированных куриных эмбрионов, без добавления адъюванта (0,2 мл, 0,3 мл и 0,4 мл) с интервалом в три дня (в 37-й, 40-й и 43-й дни с начала иммунизации), затем в 47-й день с начала иммунизации мышам внутрибрюшинно вводили "ударную" удвоенную дозу того же антигенного материала без добавления адъюванта (0,8 мл), после чего в 50-й день мышам внутрибрюшинно вводили 0,2 мл взвеси клеток асцит-саркомы TG-180 в разведении 1:10.

Сбор ИАЖ проводили по мере ее накопления, начиная с 10-11 дня после последней инъекции (60-61 день с начала иммунизации) путем повторных пункций брюшной полости. Порции ИАЖ, взятые одновременно у нескольких мышей, далее подвергали центрифугированию при 3000-4000 об/мин, в течение 20 минут для освобождения от клеточных элементов и фибрина.

Выделение из ИАЖ гамма-глобулиновой фракции проводили либо солевым, либо спиртовым методом. Оба метода известны и описаны (6,7).

Контроль качественного состава выделенной гамма-глобулиновой фракции проводили методом электрофореза в агаровом геле в 0,1 М веронал-мединаловом буфере при pH 8,6. На электрофореграмме должен полностью отсутствовать альбумин. Допускается наличие следовых количеств балластных глобулинов. Определение содержания белка в растворе проводили методом Биурета.

Далее к выделенной гамма-глобулиновой фракции присоединяли люминесцирующий флуорохром, например, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), в карбонат-бикарбонатном буфере при pH 9,0-9,1 и температуре 0+4^oC в течение 6-18 часов.

После очистки конъюгата от свободного флуорохрома методами диализа и ионообменной хроматографии на Дауэкс в Cl^-, проверяли качество полученного препарата методом восходящей бумажной хроматографии. На хромограмме должно быть одно четкое очерченное пятно конъюгата на старте.

Далее полученный конъюгат разливали по ампулам и лиофильно высушивали.

В частном случае, для получения готового препарата, содержащего контрастирующее вещество, перед ампулированием полученный конъюгат смешивали с контрастирующим веществом (например, с альбумином, меченным родамином) в рабочих разведениях.

В другом частном случае, полученный конъюгат (смешанный или несмешанный с контрастирующим веществом) разливали в ампулы объемом 0,3-0,5 мл для получения удобного количества готового препарата, необходимого для 30-50 исследований, что составляет среднюю недельную потребность в нем.

Пример 2. Хламидийный люминесцирующий диагностический препарат.

Полученный по способу, описанному в Примере 1, хламидийный люминесцирующий диагностический препарат, содержащий мышиные гамма-глобулины к хламидиям видов Chl.psittaci, Chl.trachomatis, Chl.pneumoniae всех форм их развития и контрастирующее вещество, лиофильно высушенный, представляет собой таблетку сиреневого цвета (цвет зависит от используемого контрастирующего вещества, в данном случае это альбумин, меченный родамином). Качественный состав препарата определяется визуально с помощью люминесцентного микроскопа. Специфическая активность (подлинность) определяется величиной "красящего" титра, т. е. тем максимальным разведением препарата, которое обеспечивает яркую (не менее, чем на 3+) зеленую люминесценцию различных форм развития хламидий (элементарных и ретикулярных телец, цитоплазматических включений, персистирующих форм). Для осуществления контроля содержимое ампулы с сухим препаратом растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды и готовили рабочие разведения, затем тонким слоем наносили препарат на подготовленные мазки, содержащие различные серовары хламидий, после чего промытые и высушенные мазки обрабатывали нефлюоресцирующим иммерсионным маслом и просматривали с помощью люминесцентного микроскопа. Результаты сравнительных исследований заявляемого хламидийного люминесцирующего диагностического препарата и препарата-прототипа приведены в таблице 1.

Как показывают данные, приведенные в таблице, заявляемый хламидийный люминесцирующий диагностический препарат выявляет разные формы развития различных видов хламидий. Кроме того, для проведения исследований к сухому хламидийному люминесцирующему диагностическому препарату-прототипу после его разведения в дистиллированной воде необходимо добавлять контрастирующее вещество в достаточно сложной пропорции, что требует высокой квалификации персонала. Заявляемый препарат уже в сухом виде содержит контрастирующее вещество в рабочих разведениях, что упрощает подготовку препарата для проведения исследований.

Пример 3. Способ диагностики хламидийных инфекций.

Исследуемый клинический или экспериментальный материал, подозрительный на инфицирование хламидиями, наносили на предметное стекло, обрабатывали подготовленным хламидийным люминесцирующим диагностическим препаратом, описанным в Примере 2, затем полученный образец исследовали под масляной иммерсией люминесцентного микроскопа в соответствии с известным методом МФА и визуально определяли наличие антигенов хламидий в исследуемом материале. Результат исследования считали положительным, если в образце обнаруживали морфологически типичные формы развития хламидий с зеленым свечением не менее чем на 3+.

На основании изучения большого числа (более 50000) экспериментальных и клинических материалов было установлено, что существует корреляция между формой развития хламидий и стадией развития хламидийной инфекции. В заявляемом изобретении предложены критерии постановки диагноза стадии развития хламидийной инфекции в зависимости от наличия в исследуемом материале тех или иных форм развития хламидий.

При наличии в исследуемом образце только элементарных телец диагностируют острую стадию хламидийной инфекции или обострение хронической хламидийной инфекции, при наличии элементарных телец, ретикулярных телец и цитоплазматических включений одновременно - текущую хламидийную инфекцию, при наличии только персистирующей формы - хроническую латентную хламидийную инфекцию.

Таким образом, описанные выше способ получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата, хламидийный люминесцирующий диагностический препарат и способ диагностики хламидийных инфекций при их осуществлении позволяют повысить в целом эффективность системы диагностики хламидийных инфекций.

Список литературы:
1. Гольдин Р.Б., Красник Ф.И., Прусакова З.М., Опыт получения орнитозных глобулинов из иммунных асцитических жидкостей. Труды ИЭМ им. Пастера, XXXVII, Ленинград, 1970.

2. Гольдин Р.Б., Прусакова З.М., Нуралова И.В., Родина В.Я., Сыворотка орнитозная диатостическая люминесцирующая мышиная сухая. ТУ-42 КВС N 128-77, Ленинград, 1977.

3. Патент РФ N 1700823 на изобретение "Способ получения хламидийной иммунной асцитической жидкости" с приоритетом от 10.07.1989.

4. Volker R. H. , Monoclonal antibodies in microbiologic immunoassay., Lab. Manag., 1983, 21, N. 9, 49-51.

5. Maclean J. W., Peeling R.W., Brunham R.C., Characterization of Chl. trachomatis antigens with monoclonal and polyclonal antibodies. Canad. J. Microbiol., 1988, 34, 2, 141-147.

6. Kibrick A., Blonstein M., Fractionation of serum into albumin and α- , β- and γ-globulin by sodium sulfate., J. Biological Chemistry., 1948, v. 176, N. 2, 983.

7. Пономарева Н.А., Нечаева А.С., Гамма-глобулин., Москва, 1965, 177.

8. Антиген "Хламисет". , Рекламный буклет фирмы "Орион Диагностика", Финляндия, 1985.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может использоваться в клинической и лабораторной практике. Предложен способ получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата, основанный на поэтапной иммунизации мышей антигенным материалом, представляющим собой суспензию, состоящую из смеси живых хламидий различных видов. После иммунизации мышам вводят клетки асцит-саркомы. Собирают иммунную асцитическую жидкость (ИАЖ) и выделяют из нее гамма-глобулиновую фракцию. Полученную гамма-глобулиновую фракцию метят и ампулируют. Сушат полученный конъюгат. При этом в качестве антигенного материала используют суспензию, состоящую из смеси всех форм развития живых хламидий видов Chl. psittaci, Chl. trachomatis, Chl. pneumoniae. На заключительном этапе иммунизации животным внутрибрюшинно вводят удвоенную дозу антигенного материала. Предложен также хламидийный люминесцирующий диагностический препарат на основе мышиных гамма-глобулинов к хламидиям, конъюгированных с флуорохромом, лиофильно высушенный. В качестве мышиных гамма-глобулинов к хламидиям препарат содержит мышиные гамма-глобулины к хламидиям видов Chl. psittaci, Shl. trachomatis, Chl. pneumoniae всех форм их развития, а также дополнительно может содержать контрастирующее вещество. Предложен также способ диагностики хламидийных инфекций путем обработки исследуемого материала заявляемым диагностическим препаратом и последующего определения наличия, антигенов хламидии различных форм развития. Причем при наличии только элементарных телец диагностируют острую стадию хламидийной инфекции или обострение хронической хламидийной инфекции. При наличии элементарных телец, ретикулярных телец и цитоплазматических включений одновременно диагностируют текущую хламидийную инфекцию. А при наличии только персистирующей формы диагностируют хроническую латентную хламидийную инфекцию. Полученный диагностический препарат позволяет повысить эффективность системы диагностики хламидийных инфекций. 3 с. и 4 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения хламидийного люминесцирующего диагностического препарата путем поэтапной иммунизации мышей антигенным материалом, представляющим собой суспензию, состоящую из смеси живых хламидий различных видов, введения мышам клеток асцит-саркомы, сбора иммунной асцитической жидкости (ИАЖ), выделения из ИАЖ гамма-глобулиновой фракции, метки полученной гамма-глобулиновой фракции, ампулирования и лиофильного высушивания полученного конъюгата, отличающийся тем, что в качестве антигенного материала используют суспензию, состоящую из смеси всех форм развития живых хламидий видов Chl. psittaci, Chl.trachomatis, Chl.pneunoniae, и на заключительном этапе иммунизации внутрибрюшинно вводят двойную дозу антигена. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед ампулированием полученную меченую гамма-глобулиновую фракцию смешивают с контрастирующим веществом в рабочих разведениях. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на стадии ампулирования меченую гамма-глобулиновую фракцию разливают в ампулы объемом 0,3 - 0,5 мл для получения удобного количества препарата, необходимого для 30 - 50 исследований, что составляет среднюю недельную потребность в нем. 4. Хламидийный люминесцирующий диагностический препарат на основе мышинных гамма-глобулинов к хламидиям, конъюгированных с флуорохромом, лиофильно высушенный, отличающийся тем, что в качестве мышинных гамма-глобулинов к хламидиям он содержит мышинные гамма-глобулины к хламидиям видов Chl.psittaci, Chl.trachomatis, Chl.pneunaniae всех форм их развития. 5. Хламидийный люминесцирующий диагностический препарат по п.4, отличающийся тем, что он содержит контрастирующее вещество в рабочих разведениях. 6. Способ диагностики хламидийных инфекций путем обработки исследуемого материала диагностическим препаратом и последующего определения наличия антигенов хламидий, отличающийся тем, что в качестве диагностического препарата используют хламидийный люминесцирующий диагностический препарат на основе мышинных гамма-глобулинов к хламидиям видов Chl.psittaci, Chl.trachomatis, Chl. pneunaniae всех форм их развития, конъюгированных с флуорохромом, лиофильно высушенный, проводят анализ результатов обработки исследуемого материала указанным диагностическим препаратом и по наличию тех или иных форм развития выявленных антигенов хламидий диагностируют хламидийную инфекцию, причем при наличии только элементарных телец диагностируют острую или обостренную хроническую хламидийную инфекцию, при наличии элементарных телец, ретикулярных телец и цитоплазматических включений одновременно-текущую хламидийную инфекцию, при наличии только персистирующей формы - хроническую латентную хламидийную инфекцию. 7. Способ диагностики хламидийных инфекций по п.6, отличающийся тем, что в качестве диагностического препарата используют хламидийный люминесцирующий диагностический препарат, содержащий контрастирующее вещество в рабочих разведениях.