Штамм Chlamydia abortus "Chlamydia VNITIBP-21" для производства иммунобиологических лекарственных препаратов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 A61K39/02 

Настоящее изобретение относится к области микробиологии, ветеринарии, биотехнологии, фармации, в частности к новому штамму Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21», используемому для изготовления инактивированных вакцин и получения специфических диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к хламидиозу сельскохозяйственных животных. Заявленное изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве, а также в научно-исследовательской деятельности.

Уровень техники

Chlamydia abortus эта грамотрицательная бактерия являющаяся облигатным внутриклеточным патогеном эукариотических клеток. Эта бактерия имеет две мембраны и не имеет жгутиков. При попадании в окружающую среду через влагалищные выделения бактерии остаются живыми и могут легко распространяться, заражая другие организмы.

Chlamydia abortus обнаруживается у коров, коз, овец и свиней, где она вызывает прерывание беременности на более поздних сроках беременности путем колонизации в плаценте.

Chlamydia abortus является причиной энзоотического аборта у овец (ОЕА). Этот патоген с зоонозным потенциалом признан основной причиной репродуктивной недостаточности у мелких жвачных и других домашних животных [1-2].

Заболевание оказывает значительное экономическое влияние, поскольку представляет собой наиболее важную причину потери потомства у овец в некоторых частях Европы, Северной Америки, Африки Европе и других частях мира. Chlamydia abortus представляет потенциальный риск для беременных женщин, поскольку известно о нескольких случаях абортов после контакта с ягнящимися овцами или козами, заражнными Chlamydia abortus [3-5].

Из уровня техники известен штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления вакцины против хламидиоза кошек [6]. Недостатком данного штамма является то, что изготовленная из него живая вакцина обладает остаточной реактогенностью, и как следствие, не очень высокой иммуногенностью.

Штамм Chlamydia psittaci К-1 ДЕП известен в РФ для изготовления вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей [7].

Из уровня техники известен другой штамм Chlamydia abortis bovis при использовании которого, была изготовлена ассоциированная вакцина для профилактики респираторных заболеваний крупного рогатого скота, содержащая вирусы инфекционного ринотрахеита и диареи, антиген хламидий из штамма Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ» в титре 10^6,5-7,5 ЭЛД₅₀/мл, формалин и адъювант на основе минерального масла и ланолин [8].

Аналогом заявленного технического решения, был выбран штамм Chlamydia abortis bovis.

Недостатком выбранного аналога является непригодность в использовании для изготовления диагностикумов и для получения эффективных вакцин против патологий воспроизводства и других репродуктивных нарушений у овец, вызванных Chlamydia abortis, на территории Российской Федерации из-за отличий в антигенной структуре и по иммунобиологическим свойствам.

До настоящего времени неизвестны выделенные изоляты эпизоотического штамма Chlamydia abortus, гомологичного штамма для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Создание и получение нового вирулентного штамма Chlamydia abortus (хламидия), выделенного в Российской Федерации и обладающего стабильными культуральными свойствами и высокой биологической, иммуногенной антигенной активностью и используемый для производственного изготовления лечебно-профилактических и диагностических препаратов, что позволит усовершенствовать стратегии борьбы с этой проблемой, включая более эффективную диагностику и меры профилактики.

Раскрытие сущности изобретения

Технической задачей является получение штамма Chlamydia abortus (хламидий), обладающего стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, который может быть использован для изготовления иммунологических лечебно-профилактических препаратов, иммуноглобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к хламидиозу сельскохозяйственных животных.

Технический результат заключается в получении штамма хламидий, обладающего стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, который может быть использован для изготовления инактивированных вакцин для профилактики энзоотического аборта у овец (ОЕА); для получения специфических диагностических сывороток, иммуноглобулинов, в качестве антигена для обнаружения антител к хламидиозу сельскохозяйственных животных.

Используемые термины и определения.

Мембранная фильтрация - это процесс разделения под давлением, в котором используются мембраны для разделения компонентов в жидком растворе или суспензии в зависимости от их размера и различий в заряде. Ультрафильтрация представляет собой разновидность мембранной фильтрации, при которой гидростатическое давление прижимает жидкость к полупроницаемой мембране. Растворитель и низкомолекулярные растворенные вещества проходят через мембрану и называются пермеатом, тогда как взвешенные твердые частицы и высокомолекулярные растворенные вещества задерживаются (ретентат) [9-10].

Тангенциальная фильтрация - жидкость прокачивается тангенциально вдоль поверхности мембраны. Приложенное давление служит для проталкивания части жидкости через мембрану на сторону фильтрата. В тангенциальной фильтрации удерживаемые компоненты не накапливаются на поверхности мембраны, вместо этого они уносятся тангенциальным потоком.

Основными применениями тангенциальной фильтрации являются концентрирование, диафильтрация (обессоливание и замена буфера) и фракционирование крупных биомолекул из малых. Установки тангенциальной фильтрации также используются для осветления и удаления клеток или клеточного детрита из клеточной культуры или ферментационной среды.

Тангенциальная ультрафильтрация описана в источнике [11].

Диафильтрацией называется фильтрация продукта мембранными фильтрующими средствами с подачей вымывной жидкости к продукту, в результате чего уменьшается концентрация прошедших через фильтры компонентов продукта, т.е. происходит вымывание этих веществ без неизбежного повышения концентрации не прошедших через фильтры компонентов продукта или его концентрирование. В качестве вымывной жидкости используют посторонние для продукта вымывные жидкости, подаваемую отдельно воду или растворитель, собственный для продукта пермеат, отбираемый, например, у подключенной ступени диафильтрации, или смесь обоих [12-13].

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» выделен в 2021 г. из внутренних тканей абортированного плода овцы в животноводческом хозяйстве д. Турма, Медведевского района Республики Марий Эл, где наблюдались случаи абортов, мертворождения и появления нежизнеспособных плодов у овец. Штамм адаптирован к размножению в куриных эмбрионах (КЭ) и перевиваемых линиях культур клеток, прошел 25 пассажей при последовательном культивировании на желточных оболочках КЭ.

В 2021 году штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН), регистрационный номер В-1371 (Свидетельство о депонировании №29 от 26 ноября 2021 г. Chlamydia abortus «VNITIBP-21»).

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21», характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки. Элементарные тельца округленной формы диаметром 0,2-0,3 мкм, ретикулярные - 0,5-0,7 мкм, окрашиваются по Стемпу, Маккиавелло и Романовскому-Гимзе. Окраска по Стемпу придает элементарным тельцам хламидий красно-фиолетовый цвет на синем фоне препарата; по Маккиавелло хламидии окрашиваются в ярко-красный цвет, клетки патологического материала - в светло-синий, ядра клеток - в томно-синий цвет; по Романовскому-Гимзе элементарные включения хламидий приобретали красно-фиолетовый цвет, а ретикулярные тельца пораженной клетки - синий, ядра клеток - бордово-фиолетовый и их цитоплазма - голубой.

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» - это грамотрицательные бактерии, шаровидной формы, не образуют спор, нет жгутиков и капсулы. Клеточная стенка состоит из 2-х слойной мембраны. Имеют гликолипиды, основной метод окраски по Романовскому-Гимзе. Бактерии имеют 2 формы существования: элементарные тельца (неактивные инфекционные частицы, вне клетки); ретикулярные тельца (внутри клеток, вегетативная форма).

Биологические свойства. Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» хорошо размножается в желточных оболочках 6 - 7-дневных куриных эмбрионов или в перевиваемой культуре клеток McCoy. Титр хламидий при культивировании на указанных биологических субстратах при температуре 36 - 37°С в течение 40 -48 часов достигает максимальных значений 6,0±0,01 lg ТЦИД₅₀/мл. При репродукции в перевиваемой культуре клеток накапливается на 25 пассаже на уровне 5,5±0,5 lg ТЦИД₅₀/мл. В культуре клеток McCoy штамм не вызывает цитопатического действия. Штамм пассируется в организме белых мышей при интраназальном, внутрибрюшинном и интрацеребральном путях заражения.

К заявленному штамму Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» восприимчивыми животными (естественно-восприимчивыми и лабораторными) являются овцы, козы, кролики, коровы, свиньи, лошади.

Антигенные свойства. При интраназальном введении в организме кроликов или мышей штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» индуцирует образование антител в титре от 1:256 до 1:512 в реакции связывания комплимента (далее - РСК). Имеется видоспецифический и общий для всех хламидии группоспецифические антигены. При окраске возбудителя по Маккиавелло и Романовскому-Гимзе морфология типична для Chlamydia abortus. В РСК со специфическими диагностическими сыворотками аборта овец в разведении 1:40 активность (титр) антигена не менее 1:64; в разведении сыворотки 1:80 активность (титр) антигена не менее 1:128.

Заявленный штамм сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность. Стабилен по антигенным и генетическим характеристикам при пассировании на клеточной культуре McCoy в течении 20 пассажей (срок наблюдения), в желточных мешках 6-7 дневных развивающихся КЭ в течении 15 пассажей (срок наблюдения).

Иммуногенность заявленного штамма проверяли на белых мышах (нелинейные лабораторные мыши ICR (CD-1)). Размещение, содержание и уход за лабораторными грызунами, используемыми в научных целях проводили согласно ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами»[14].

Молодых животных, здоровых и равных по весу и возрасту разделяли на девять групп от 7-10 мышей в каждой, где с первой по третью группам вводили двукратно с интервалом 3 недели инактивированный антиген Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с содержанием белка 20-40 мг/мл, другим группам (с четвертой по шестую) вводили двукратно с интервалом 3 недели антиген Chlamydia abortis «Chlamydia VNITIBP-21» с содержанием белка 40-60 мг/мл, следующим группам (с седьмой по девятую) двукратно с интервалом 3 недели вводили Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с содержанием белка 60-80 мг/мл. Были сформированы три контрольные группы по 7-10 из не иммунизированных животных.

Индекс резистентности ≥2,5. Изготовленный из штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» антиген в инактивированной адсорбированной эмульгированной вакцине обеспечивает формирование у привитых животных напряженного и длительного иммунитета.

В экспериментальных опытах на белых мышах установлено, что двукратная иммунизация вакциной на основе штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» предохраняла белых мышей от развития хламидиозной инфекции после искусственного (экспериментального) заражения на 93-95% известным штаммом Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ» и на 90-93% от штамма Chlamydia psittaci «К-8-К ВИЭВ».

Патогенные свойства. Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» патогенен для белых мышей, куриных эмбрионов и для овец.

После заражения культурой штамма у больных животных отмечают явления анорексии, ринита, конъюнктивита, паралича конечностей, а также аборты, рождение мертвых детенышей. Полную гибель белых мышей (100%) устанавливают на 6 - 10 сутки.

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» устойчив к действию стрептомицина; чувствителен к действию антибиотиков тетрациклинового ряда, в меньшей степени - пенициллина (см. табл. 2).

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность на протяжении 25 пассажей.

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» сохраняет свои биологические свойства в течение одного года при температуре минус 70°С, в лиофилизированном виде - не менее 3 лет.

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» свободен от бактериальных, грибковых, микроплазменных и вирусных контаминантов.

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» применяют для изготовления (производства) иммунологических лекарственных препаратов: вакцин, диагностических сывороток.

В вакцинных композициях на основе штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» могут быть использованы масляные адъювантные композиции типа вода-в-масле или вода-масло-вода или масло-в-воде [15-16].

Возможность осуществления заявленного изобретения раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Культивирование и выделение штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с использованием куриных эмбрионов.

Исходным материалом для выделения штамма послужила 20-25% суспензия из растертых тканей абортированного плода овцы в 0,01-0,02 М фосфатно-буферном растворе с рН 7,2-7,4.

Суспензию растертых тканей получают путем растирания внутренних органов абортированного плода овцы до гомогенного состояния с использованием любых известных специалисту из данной области материалов, приборов и/или устройств.

Для выделения штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» использовали куриные эмбрионы 6-8-дневного возраста, мембраны их желточных мешков инокулировали тканевой суспензией (0,2 мл) внутренних органов абортированных плодов по процедуре известной специалисту из данного уровня техники. Изоляты хламидий размножали в эпителиальных клетках желточных оболочек куриных эмбрионов, вызывая их гибель на 5-10 день после заражения, достигая инфекционного титра до 10^6,5 ЭЛД₅₀/0,3 мл. Очистку и концентрирование возбудителя хламидиоза производили путем тангенциальной ультрафильтрации. Концентрированный антиген Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» имеет титр в реакции связывания комплимента 1:128-1:256. Далее инактивированный кипячением 15-20 минут, концентрированный материал для экстракции антигена обрабатывают известным специалисту из данной области техники эфирно-ацетоновой экстракцией.

Было выделено несколько изолятов Chlamydia Abortus (хламидий) из внутренних органов абортированного плода овцы, одному из наиболее продуктивных, иммуногенных и антигенных было присвоено название - штамм Chlamydia Abortus «Chlamydia VNITIBP-21».

Пример 2. Определение чувствительности к антибиотикам штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21».

Использовали известный метод определения чувствительности к антибиотикам-диффузионный метод с использованием стандартных бумажных дисков с антибиотиками.

Заявленный штамм Chlamydia Abortus «Chlamydia VNITIBP-21» наиболее устойчив к действию стрептомицина; наиболее чувствителен к действию антибиотиков тетрациклинового ряда, в меньшей степени к пенициллину из антибиотиков пенициллинового ряда.

Пример 3. Подтверждение иммуногенных свойств штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21»

Для подтверждения иммуногенных свойств штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» сравнивали со штаммами Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ» и Chlamydia psittaci «К-8-К ВИЭВ».

Подтверждение иммуногенных свойств заявленного штамма, проводили на белых нелинейных лабораторных мышах путем внутрибрюшинного двукратного введения им инактивированного антигена в дозе 0,4-0,5 мл. Были отобраны здоровые молодые лабораторные мыши одинаковые по весу и возрасту (размещение, содержание и уход согласно ГОСТ 33216-2014). Отобранных мышей разделили на девять групп не менее 7-10, где первым трем группам мышей вводили антиген Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с содержанием белка 20-40 мг/мл, следующим трем группам мышей вводили антиген Chlamydia abortis «Chlamydia VNITIBP-21» с содержанием белка 40-60 мг/мл, следующим трем группам мышей вводили Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с содержанием белка 60-80 мг/мл. Были сформированы три контрольные группы (одинаковые по возрасту и весу) по 7-10 из не иммунизированных животных. По истечении 21-28 дней после последней иммунизации опытных и контрольных мышей заражают интраназально 10% взвесью желточных оболочек куриных эмбрионов, инфицированных штаммом хламидий.

Одну контрольную группу А, опытные группы мышей 1-ую, 4-ую и 7-ую заражали штаммом Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с инфекционной активностью 10^5,0-10^5,5 ЭЛД₅₀/0,3 мл в дозе 0,05 мл. Контрольную группу В, опытные группы мышей 2-ую, 5-ую и 8-ую заражали Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ» с инфекционной активностью 10^5,0-10^5,5 ЭЛД₅₀/0,3 мл в дозе 0,05 мл. Контрольную группу С, опытные группы мышей 3-ью, 6-ую и 9-ую заражали Chlamydia psittaci «К-8-К ВИЭВ» с инфекционной активностью 10^5,0-10^5,5 ЭЛД₅₀/0,3 мл в дозе 0,05 мл. В контрольных группах А, В и С у невакцинированных мышей наблюдалась 100% гибель после заражения. Результаты данного опыта представлены в таблице 3.

Вывод. В результате проведенных исследований было доказано, что двукратное внутрибрюшинное введение инактивированных хламидий штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» защищает 98,5-99,5% белых мышей от интраназального заражения этим штаммом, на 93-95% от заражения известным штаммом Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ» и на 90-93% от заражения штаммом Chlamydia psittaci «К-8-К ВИЭВ» (см. табл. 3).

Пример 4. Подтверждение антигенных свойств штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21».

Антигенную активностью штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» подтверждают в реакции связывания комплемента путем сравнения титров антител в гипериммунных сыворотках морских свинок, полученных к штаммам хламидий: Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21», Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ», Chlamydia psittaci «К-8-К ВИЭВ» (при двукратной иммунизации с интервалом 3 недели в дозе 0,9-1,0 мл), а также антигенов из этих штаммов. Характеристика антигенности указанного штамма в сравнении с другими известными штаммами представлена в таблице 4.

Приведенные данные подтверждают, что антигенная активность при исследовании с гомологичной сывороткой штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» превосходит в два раза известные штамм Chlamydia abortis bovis «К-8 ВИЭВ» и штамм Chlamydia psittaci «К-8-К ВИЭВ».

Пример 5. Получение вакцины из инактивированного культурального сырья из штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» с применением роллерного метода культивирования.

Вакцину против хламидиоза инактивированную эмульсионную готовят из матровой расплодки штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» (см. пример 1), которую используют для заражения перевиваемой культуре клеток McCoy 2-3-суточного возраста с концентрацией более 100000 кл/мл и получение посевной расплодки. Выращенные хламидии соответствуют следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток McCoy не менее 5,0 lg ТЦИД50/мл, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации.

Монослой клеток McCoy диссоциируют посредством трипсинизации (смесью трипсина и версена) из конфлюэнтных (сливающихся) культур, а затем переносят в среду ДМЕМ, содержащую 5% фетальной телячьей сыворотки, не загрязненную пестивирусом (среда ДМЕМ), с конечной концентрацией около 400000 клеток на 1 мл. Фракции этой суспензии аликвотами по 100 мл смешивают с 20-миллилитровыми аликвотами фракций матровой расплодки штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» и окончательную смесь после предварительной выдержки в течение 1-2 часов при температуре 37°С для адсорбции хламидий переносят в роллерные сосуды. Добавляют питательную среду ДМЕМ с 5% фетальной сыворотки и антибиотиком (гентамицин в концентрации 50 мкг/мл или его аналоги) и затем инкубируют при температуре 37°С в течение 76-92 часов в атмосфере CO2.

После этой последней инкубации роллерные сосуды подвергают трем последовательным циклам замораживания/оттаивания. Полученный материал освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Полученный материал контролируют на инфекционную активность.

Очищенную суспензию подвергают инактивации. Инактивацию проводят формалином в количестве 0,14-0,16% и в течение 120-122 часов при температуре 37°С.

Эмульсионную вакцину готовят путем смешивания культурального инактивированного сырья - штамма хламидий Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» и масляного адъюванта в виде эмульсии типа вода-масло-вода.

К полученному таким образом инактивированному сырью добавляют масляный адъювант - остальное, и тщательно перемешивают, и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, масс %:

Культуральная инактивированная смесь, включающая штамм хламидий Chlamydia abortus 50,00 «Chlamydia VNITIBP-21» (антиген) Масляный адъювант остальное.

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Полученную вакцину фасуют в стерильных условиях в стеклянные флаконы по 2,0, укупоривают, и контролируют в соответствии с требованиями на стерильность, безвредность и антигенную активность. Флаконы, содержащие полученную вакцину упаковывают в наборы, в которые вкладывают инструкцию по применению.

Вакцину проверяют на стерильность посевом на следующие питательные среды: МПБ, МПА, МППБ, среду Сабуро и тиогликолевую среду. Во всех случаях роста микрофлоры не отмечается.

Вакцина сохраняет свои биологические свойства в течение 18 месяцев при условии хранения в сухом, темном помещении при температуре 4 - 8°С.

Пример 6. Подтверждение безвредности заявленной вакцины.

Заявленную вакцину вводят внутримышечно в двукратной дозе от оптимальной дозы пяти морским свинкам, отобранным в соответствии с ГОСТ 33216-2014. В течение 14 дней наблюдали за изменением поведения животных.

Вывод. Все животные живы и здоровы, поведение соответствует физиологической норме.

Пример 7. Определение антигенной активности вакцины.

Для оценки антигенной активности вакцину вводят серонегативным к хламидийной инфекции четырем овцам 3-5 месячного возраста романовской породы с соблюдением правил асептики и антисептики внутримышечно в объеме 2,0 мл. До иммунизации и через 21 день после вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие специфических антител в ИФА с использованием диагностического набора «Непрямой иммуноферментный анализ для обнаружения антител, направленных против Chlamydophila abortus у жвачных животных, свиней и лошадей» («ID Screen® Chlamydophila abortus Indirect Multi-species») производства ID.Vet., Франция, согласно инструкции производителя. Учет результатов наличия антител к хламидиям в лаборатории проводят по оценке процентного отношения S/P (исследуемый образец/позитивное отношение), используя при спектрофотометрии длину волны 405 нм. Расчет S/P производят по формуле, указанной в инструкции производителя. Результат анализа проб, имеющих процентное значение S/P:

- меньший либо равный 50% считается отрицательным;

- между 50% и 60% считается неопределенным;

- больший либо равный 60% считается положительным.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что до иммунизации в сыворотках крови овец антител к хламидиям не было выявлены, а через 21 день после вакцинации во всех 4 пробах выявляли специфические антитела -отношение S/P значительно превышала 60% (от 78 до 84).

Таким образом, полученная вакцина инактивированная эмульсионная из штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21» является стерильным, безвредным препаратом и обладает достаточной антигенной активностью. Однократное введение вакцины обеспечивает высокий уровень антител в сыворотке крови у привитых животных.

Пример 8. Определение иммуногенной активности вакцины на лабораторных животных-мышах.

Формируют 2 группы белых мышей живой массой 18 - 20 г по 20 голов в каждой. Белых мышей 1-ой группы прививают подкожно в дозе 0,2 мл инактивированной вакциной против хламидиоза из штамма Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21», приготовленной по примеру 5.

Белых мышей 2-ой группы не прививают (контроль). На 21 сутки после вакцинации лабораторных животных 1 и 2 группы заражают подкожно в дозе 0,3 мл культурой подтитрованного контрольного штамма Chlamydia abortus с титром 10^6,5 ЭИД₅₀/0,3 мл. Не устанавливают гибель белых мышей в 1-ой опытной группе и устанавливают полную гибель белых мышей (100%) во 2-й контрольной группе.

Пример 9. Определение иммуногенной активность вакцины на целевых животных.

Высокая иммуногенная активность заявляемой вакцины подтверждена также в остром опыте на восприимчивых животных суягных овцематках. В опыт были отобраны 60 суягных овцематок из хозяйства благополучного по сальмонеллезу, хламидиозу, кампилобактериозу и лептоспирозу. Вакцина против хламидиоза предохраняла от абортов 100% овцематок, после их заражения полевым изолятом. В невакцинированных группах (7 голов) от хламидиоза абортировало 5 голов из 7, от двух голов получены 2 нежизнеспособных приплода.

Таким образом, вакцинация овцематок вакциной против хламидиоза, обеспечивает 100%-ную иммунологическую защиту от этих заболеваний.

Пример 10. Определение иммуногенной активности вакцины на последнем месяце срока годности (18 месяц).

Формируют 2 группы белых мышей живой массой 18 - 20 г по 20 голов в каждой. Белых мышей 1-ой группы прививают подкожно в дозе 0,2 мл заявленной инактивированной вакциной после ее хранения, на последнем месяце срока годности вакцины (см. пример 5).

Белых мышей 2-ой группы не прививают (контроль). На 21 сутки после вакцинации лабораторных животных 1 и 2 группы заражают подкожно в дозе 0,3 мл культурой подтитрованного контрольного штамма Chlamydia abortus с титром 10^6,5 ЭИД₅₀/ 0,3 мл. Не устанавливают гибель белых мышей в 1-ой опытной группе и устанавливают полную гибель белых мышей (100%) во 2-й контрольной группе.

Вывод. Вакцина сохраняет иммуногенную активность на 18 месяце хранения.

Все приведенные примеры подтверждают реализацию технического решения.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного технического решения.

Промышленная применимость

Поставленная техническая задача, а именно, получение штамма Chlamydia abortus (хламидий), обладающего стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, который может быть использован для изготовления иммунологических лекарственных препаратов иммуноглобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к хламидиозу сельскохозяйственных животных, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Практическое применение заявленного технического решения позволяет использовать для изготовления инактивированных вакцин и получения специфических диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к хламидиозу сельскохозяйственных животных.

Список литературных источников:

1. Halbert G. Diseases of sheep. Can Vet J. 2008; 49(7):702.

2. Longbottom, D.; Coulter, L.J. Animal chlamydioses and zoonotic implications. J. Comp. Pathol. 2003, 128, 217-244.

3. Rodolakis A., Mohamad K.Y. Zoonotic potential of Chlamydophila. Vet. Microbiol. 2010 Jan; 140(3-4):382-391.

4. Pospischil A., R. Thoma R., Hilbe M., Grest P., Gebbers F.-O. Abortion in woman caused by caprine Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci serovar 1), 2002. Swiss Medical Weekly, vol. 132, no. 5-6, pp. 64-66.

5. Walder G., Hotzel H., Brezinka C. et al., "An unusual cause of sepsis during pregnancy: recognizing infection with Chlamydophila abortus," Obstetrics & Gynecology, 2005. vol. 106, no. 5, pp. 1215-1217.

6. Mitzel Jr. et al. Vaccination Against Feline Pneumonitis, Am. J. Vet. Res., 1977, 38 (9), pp. 1361 – 1364.

7. Патент 2122579 Штамм CHLAMYDIA PSITTACI, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей. Заявка №97104467. Дата подачи заявки: 1997.03.21. Опубликовано: 1998.11.27.

8. Авт.св. СССР N 1789219, кл. A61K 39/118, опубл. 1993.

9. Брок Т. Мембранная фильтрация. М.: Мир; 1987. 462 с.

10. Anthony Bennett, «Membrane technology: Developments in ultrafiltration technologies» // Filtration + Separation V. 49, Issue 6, November-December 2012, Pages 28-33, doi.org/10.1016/S0015-1882(12)70287-2.

11. Shiloach J, Martin N, Moes H. Tangential flow filtration. Adv Biotechnol Process (1988),8: 97-125; Van Reis R, Zydney A. Membrane separations in biotechnology. Curr Opin Biotechnol (2001), 12:208-211).

12. Madsen R.F., Design of sanitary and sterile UF- and diafiltration plants, Separation and Purification Technology, 22-23 (2001). p. 79-87.

13. Патент №2338433 РФ Способ диафильтрации продукта и устройство для осуществления способа. Опубликовано: 20.11.2008 Бюл. №32).

14. ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.

15. Leroux Roels G., Cheng W.F. (2011). Vaccine adjuvants. Perspectives in Vaccinology, 1, 89-113.

16. Edwige Boogie On, Elodie Gonsalves, Alexander Shevtsov, Polina Mezonnas, Stepan Remyga, Oleg Goryushev, Sebastian Deville, Nicolas Bertaud and Juliette Ben ArusA New Adjuvant Combined with Inactivated Influenza Enhances Specific CD8 T Cell Response in Mice and Decreases Symptoms in Swine Upon Challenge. Article in Viral Immunology(2015) 28(9):524-31. doi: 10.1089/vim.2014.0149.

17. Патент 2085213 Вакцина для профилактики и лечения хламидиоза сельскохозяйственных животных и пушных зверей. Заявка №95 95108959. Дата подачи заявки: 1995.06.05. Опубликовано: 1997.07.27.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму Chlamydia VNITIBP-21, обладающему стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью. Штамм Chlamydia VNITIBP-21 позволяет производить на его основе высокоиммуногенную вакцину против хламидиоза животных, получать гипериммунные сыворотки, а также использовать антиген и полученную из него сыворотку в серологических реакциях для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных. Заявленное изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве, а также в научно-исследовательской деятельности. 4 табл.

Штамм Chlamydia abortus «Chlamydia VNITIBP-21», для получения иммунологических лекарственных препаратов против хламидиоза сельскохозяйственных животных, депонированный в коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко» (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН), регистрационный номер В-1371.