СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕРТЫХ ФОРМ ВРОЖДЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) при вирильных синдромах и инциденталомах.

Заболевания, протекающие с нарушением функции гипофизарно-надпочечниковой системы, привлекают пристальное внимание эндокринологов ввиду сложности их диагностики и лечения. Авторы отмечают многообразие форм вирильного синдрома - идиопатический гирсутизм, функциональная гиперандрогения (ГА), ВГКН (явные и стертые формы), синдром поликистозных яичников (СПЯ), смешанные формы ГА. По мнению ряда авторов, опухоли чаще выявляются у больных, страдающих врожденной дисфункцией коры надпочечников, и ферментные нарушения могут способствовать их развитию. Стертые формы ВГКН могут быть также причиной образования поликистозных яичников (вторичный СПЯ). Особенно трудно диагностировать стертые формы ВГКН у мужчин.

ВГКН может быть обусловлена генетически запрограммированным снижением активности любого из ферментов надпочечникового стероидогенеза. Дефицит 21-гидроксилазы (21-ОНД) и 11β-гидроксилазы (11β-ОНД) являются наиболее частыми вариантами ВГКН и по данным большинства авторов обуславливают более 99% заболевания, тогда как дефекты других ферментных систем встречаются редко. В литературе описаны также пациенты с комбинированными дефектами 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы.

Многие авторы отмечают сложности в дифференциальной диагностике яичниковой и надпочечниковой ГА. Это обусловлено отсутствием каких-либо характерных клинических симптомов, позволяющих диагностировать эти заболевания. Длительно существующая надпочечниковая ГА приводит к формированию вторичного поликистоза яичников, являющегося результатом каскада биохимических и метаболических влияний андрогенов (и прежде всего тестостерона) на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую регуляцию. Поликистозные яичники, в свою очередь, являются дополнительным источником андрогенов, что значительно затрудняет дифференциальную диагностику. Между тем, определение источника гиперпродукции андрогенов имеет принципиальное значение для последующего адекватного лечения. В 2003 г. на конференции в г.Ротердаме был достигнут консенсус по диагностическим критериям СПЯ, согласно которому, наряду с другими причинами гиперандрогении (синдром Иценко-Кушинга (СИК), андрогенпродуцирующие опухоли, гиперпролактинемия, изменения функции щитовидной железы), необходимо исключение ВГКН (Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and longterm health to polycystic ovary syndrome (PCOS) - Human Reproduction, vol.19, №.1, pp.41-47, 2004).

Большое значение для выбора тактики лечения больных с инциденталомами имеет диагностика стертых форм ВГКН как причина образования данных опухолей. Одной из основных жалоб больных с инциденталомами является артериальная гипертензия. Признаки вирильного синдрома довольно часто встречаются у женщин с аденомами коры надпочечников. С помощью стандартных методов иммуноферментного анализа (ИФА) трудно оценить гормональную активность данных опухолей, степень которой влияет на выбор тактики лечения.

Для диагностики стертых форм ВГКН, кроме определения уровней гормонов, необходимо проведение 2-3 функциональных проб: с синактеном, с дексаметазоном и другие (Дзенис И.Г., Юдина Т.Н., Брыкова Е.К., Бахарев В.А., Фанченко Н.Д. Диагностика гетерозиготного носительства мутантного гена 21-гидроксилазы //Акушерство и гинекология. - 1995. - №1. - С.21-23). Эти данные могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты, особенно при выявлении дефекта 11β-гидроксилазы (White PS, Curnow KM, Parcoe L. Disorders of steroid 11β-hydroxylase isozymes.// Endocr. Rev. 1994; 15: 421-438).

Процесс дифференциальной диагностики является трудоемким и дорогостоящим.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств диагностики стертых форм ВГКН.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников, включающем биохимическое исследование кортикостероидов крови, согласно изобретению дополнительно проводят биохимическое исследование мочи, при этом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определяют в крови уровни кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC), 11-дезоксикортизола (S), экскрецию с мочой свободного кортизола (FF) и свободного кортизона (FE), рассчитывают соотношения F/E и FF/FE, и при уровне кортизола в крови, не превышающем норму, и наличии по меньшей мере двух из трех признаков:

- уменьшение соотношения F/E на 25% и более,

- уменьшение соотношения FF/FE на 25% и более,

- уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой на 25% и более

диагностируют стертую форму врожденной гиперплазии коры надпочечников, причем при увеличении уровня кортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 21-гидроксилазы, а при увеличении уровня 11-дезоксикортизола и/или 11-дезоксикортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 11β-гидроксилазы.

Для определения критериев диагностики стертых форм ВГКН было обследовано 159 женщин в возрасте от 16 до 47 лет с различными формами вирильного синдрома и 130 больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников. Контрольную группу составили 30 здоровых человек. На основании клинических данных, результатов лучевой диагностики органов малого таза и надпочечников, а также данных количественного определения гормонов стандартными методами (ИФА и РИА) и оценки функциональных проб с синактеном - депо и 2 мг дексаметазона больные были распределены в следующие группы:

1. Больные с вирильным синдромом:

1.1. Идиопатический гирсутизм - 25 чел.

1.2. Функциональная гиперандрогения - 21 чел.

1.3. Стертая форма ВГКН - 38 чел.

1.4. Синдром поликистозных яичников - 60 чел.

1.5. Смешанная форма гиперандрогении - 15 чел.

2. Инциденталомы - 130 чел. Из них 21 больной был с диагнозом стертой формы ВГКН, 36 - с субклиническим СИК и 73 - опухоли с признаками гормональной активности.

Все диагнозы были верифицированы на основании совокупности клинико-анамнестических данных, показателей биохимических, гормональных исследований, методов лучевой диагностики. У части больных диагноз был подтвержден данными оперативного вмешательства и гистологического анализа удаленных опухолей.

Проведенные исследования показали, что при стертой форме ВГКН характерны уровень кортизола в крови, не превышающий норму, уменьшение соотношения F/E крови на 25% и более (р<0,02), снижение уровня экскреции свободного кортизола с мочой на 25% и более (р<0,05) и соотношения FF/FE мочи на 25% и более (р<0,02). Причем дополнительное увеличение в крови промежуточных продуктов стероидогенеза 11-дезоксикортикостерона и/или 11-дезоксикортизола на 50% и более является специфичным для стертой формы ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы, а дополнительное увеличение уровня кортикостерона в крови на 50% и более специфично для стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы. Эти данные позволили определить критерии диагностики.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Для анализа берут 1 мл сыворотки крови и 2 мл суточной мочи. Хроматографирование проводят при следующих условиях: хроматограф жидкостный Чехия, насос НРР 4001, УФ детектор LCD 2563 (λ=254 нм), колонка Kromasil С-18 150 мм, 5 мкм, изократический режим элюирования, подвижная фаза 30% и 45% ацетонитрил-вода CH₃CN-H₂O (1 часть - 26:74 v/v, 2 часть - 41:59 v/v), скорость элюента 0,3 мл/мин. Для улучшения разделения стероидов, имеющих близкие времена удерживания, применяют β-циклодекстрин. Предел обнаружения 1-2 нг/мл. Определяют в крови уровни кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC), 11-дезоксикортизола (S) и соотношение F/E, экскрецию с мочой свободного кортизола (FF), свободного кортизона (FE) и соотношение FF/FE. Сравнение результатов проводят с нормой, полученной в данной лаборатории. Данные нормы, полученные нами при исследовании 30 здоровых лиц (статистическая обработка с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при р<0,05) представлены в таблице.

ТаблицаМедиана (LQ-UQ) нг/мл M (LQ-UQ) мкг/cFF/FEFЕВDOCSF/EFFFEFF63,5719,953,13,62,03,2713,6036,90,3751,8-71,715,5-22,62,0-3,53,5-4,01,5-2,52,74-3,6211,5-14,627,5-40,60,33-0,47

где LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль.

При уровне кортизола в крови, не превышающем норму, и наличии по меньшей мере двух из трех признаков:

- уменьшение соотношения F/E на 25% и более,

- уменьшение соотношения FF/FE на 25% и более,

- уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой на 25% и более

диагностируют стертую форму врожденной гиперплазии коры надпочечников, причем при увеличении уровня кортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 21-гидроксилазы, а при увеличении уровня 11-дезоксикортизола и/или 11-дезоксикортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 11β-гидроксилазы.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Ж. - 16 лет, ИМТ=23,5, нарушение менструального цикла (опсоменорея), акне, мышечная слабость, гирсутизм 2-ой степени.

Стандартные методы диагностики (ИФА): ДЭА-сульфат - 5,4 мкг/мл, Свободный тестостерон - 2,0 пг/мл, Проба с синактеном: - кортизол - 389 нмоль/л - фон, 928 нмоль/л - через 1 час, 1522 нмоль/л - через 10 час; 17-гидроксипрогестерон (17-ОНП) - 1,2 нг/мл - фон, 4,4 нг/мл - через 1 час, 6,4 нг/мл - через 10 час.

Проба с синактеном по данным литературы считается положительной при Д>0,065. У больной Ж. при оценки пробы с синактеном Д=0,13, что подтверждает диагноз стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы. Однако другие исследователи оценивают пробу с синактеном как положительную при подъеме уровня 17-ОНП через 10 час больше 10,0 нг/мл, а у данной пациентки он составил 6,4 нг/мл при нормальном фоновом уровне 17-ОНП.

Пациентке были проведены исследования по предложенному способу.

Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови: кортизол (F) - 32,0 нг/мл, кортизон (Е) - 16,4 нг/мл, кортикостерон (В) - 8,4 нг/мл, 11-дезоксикортикостерон (DOC) - 1,0 нг/мл, 11-дезоксикортизол (S) - 1,0 нг/мл, F/E - 1,95.

ВЭЖХ кортикостероидов мочи: свободный кортизол мочи (FF) - 2,3 мкг/с, свободный кортизон мочи (FE) - 9,8 мкг/с, FF/FE - 0,23.

По данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи установлены следующие признаки стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы:

1) увеличение уровня кортикостерона больше 50% по сравнению с контрольной группой,

2) снижение соотношения FF/FE в моче на 30,3%,

3) снижение экскреции свободного кортизола с мочой на 75%.

Таким образом, установленные у больной критерии стертой формы ВГКН по данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи дают возможность диагностировать у пациентки стертую форму ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы.

Пример 2. Больная Г., 28 лет, нарушение менструального цикла, бесплодие, гирсутизм 1 степени, поликистозные яичники.

Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови:

Кортизол (F) - 29,2 нг/мл

Кортизон (Е) - 18,4 нг/мл

Кортикостерон (В) - 5,4 нг/мл

11-дезоксикортикостерон (DOC) - 3,0 нг/мл

11-дезоксикортизол (S) - 1,0 нг/мл

F/E - 1,6

ВЭЖХ кортикостероидов мочи:

Свободный кортизол мочи (F) - 6,8 мкг/с

Свободный кортизон мочи (Е) - 32,8 мкг/с

FF/FE - 0,21

По данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи установлены следующие признаки стертой формы ВГКН:

1) снижение соотношения FF/FE в моче,

2) снижение соотношения F/E в крови,

3) снижение экскреции свободного кортизола с мочой.

Стандартные методы диагностики (ИФА):

ДЭА-сульфат - 5,4 мкг/мл

Тестостерон - 4,9 нмоль/л

ДЭА - 16 нг/мл

Свободный тестостерон - 2,8 пг/мл

Проба с синактеном - кортизол - 460 нмоль/л-фон

2200 нмоль/л - через 10 час

17-ОНпрогестерон - 3,6нг/мл-фон

12,2 нг/мл - через 10 час

Увеличение ДЭА-сульфата, базальное (фоновое) увеличение уровня 17-ОНП (3,6 нг/мл) и положительная проба с синактеном (Д=1,06 и увеличение 17-ОНП на пробе с синактеном >10 нг/мл) подтверждают диагноз стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы. СПЯ является вторичным.

Пример 3. Больной Б., 60 лет, аденома коры надпочечников (4,4×3,1 и 2,5×2,8)

Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови:

Кортизол (F) - 56,8 нг/мл

Кортизон (Е) - 36,7 нг/мл

Кортикостерон (В) - 2,2 нг/мл

11-дезоксикортикостерон (DOC) - 3,7 нг/мл

11-дезоксикортизол (S) - 1,0 нг/мл

F/E - 1,5

ВЭЖХ кортикостероидов мочи:

Свободный кортизол мочи (FF) - 26,0 мкг/с

Свободный кортизон мочи (FE) - 96,2 мкг/с

FF/FE - 0,27

По данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи установлены следующие признаки стертой формы ВГКН:

1) снижение соотношения FF/FE в моче,

2) снижение соотношения F/E в крови.

Стандартные методы диагностики (ИФА):

ДЭА-сульфат - 0,5 мкг/мл

Тестостерон - 15,9 нмоль/л

ДЭА - 9,5 нг/мл

Проба с синактеном - кортизол-360 нмоль/л-фон

2400 нмоль/л - через 10 час

17-ОНпрогестерон - 1,7 нг/мл - фон

17,5 нг/мл - через 10 час

На основании положительной пробы с синактеном (Д=2,29, подъем 17ОНП на синактене >10,0 нг/мл) подтвержден диагноз стертой формы ВГКН.

Пример 4. Больной Б., 27 лет, ИМТ=31, с артериальной гипертензией, акне.

Стандартные методы анализа (ИФА): кортизол 9 час - 626 нмоль/л, кортизол 21 час - 180 нмоль/л, АКТГ - 68 пг/мл, альдостерон 105 пг/мл, ангиотензин 1-0,4 нг/мл/час.

ВЭЖХ кортикостероидов крови: кортизол - 67,5 нг/мл, кортизон - 25,2 нг/мл, кортикостерон - 4,5 нг/мл, DOC - 18,4 нг/мл, S - 1,8 нг/мл. Свободный кортизол мочи - 4,5 мкг/с, свободный кортизон мочи - 35,6 мкг/с, соотношение FF/FE - 0,13.

На основании стандартных методов анализа у больного Б. не было выявлено нарушений в регуляции системы гипофиз - кора надпочечников. По данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи (увеличение уровня DOC в крови, снижение экскреции свободного кортизола с мочой и уменьшение соотношения FF/FE в моче) можно сделать вывод о стертой форме ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы. Больному была проведена проба с синактеном-депо. Получены следующие результаты: в 9 час - кортизол 303 нмоль/л, 17-гидроксипрогестерон - 2,0 нг/мл. Через 10 час после введения синактена - кортизол - 844 нмоль/л, 17-ОНП - 5,2 нг/мл. Проба считается положительной (Д=0,10). Таким образом, больному без клинических признаков ВГКН на ранних стадиях удалось поставить диагноз стертой формы ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы.

Пример 5. Больная 3. - артериальная гипертензия, гиперандрогения, поликистозные яичники.

Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови:

Кортизол (F) - 53,3 нг/мл

Кортизон (Е) - 30,0 нг/мл

Кортикостерон (В) - 7,5 нг/мл

11-дезоксикортикостерон (DOC) - 24,0 нг/мл

11-дезоксикортизол (S) - <1,0 нг/мл

F/E - 1,75

ВЭЖХ кортикостероидов мочи:

Свободный кортизол мочи (FF) - 23,7 мкг/с

Свободный кортизон мочи (FE) - 109,3 мкг/с

FF/FE - 0,22

По данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи установлены следующие признаки стертой формы ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы и дефектом 21-гидроксилазы: увеличение уровней кортикостерона и 11-дезоксикортикостерона более чем на 50%, уменьшение соотношений F/E в крови и FF/FE в моче.

Стандартные методы диагностики (ИФА):

Тестостерон - 10,0 нмоль/л

ДЭА - 21 нг/мл

ДЭА-сульфат 6,49

17-ОНП - 1,45 нг/мл

кортизол - 652 нмоль/л

При проведении пробы с 2 мг дексаметазона произошло подавление ДЭА с 21 до 3,2 нг/мл, тестостерона с 10 до 0,24 нмоль/л, что характерно для надпочечниковой гиперандрогении. Проба с синактеном дала положительный результат (уровень 17-ОНП через 10 час составил 9,0 нг/мл, Д=0,75) несмотря на нормальный уровень 17-ОНП в 9 час и подъем уровня 17-ОНП через 10 час <10,0 нг/мл. Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи позволяют диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы.

Пример 6. Больная П. 28 лет - нормальный ИМТ, жалобы: нарушение менструального цикла, гиперандрогения, поликистозные яичники.

Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови:

Кортизол (F) - 41,2 нг/мл

Кортизон (Е) - 28,5 нг/мл

Кортикостерон (В) - 3,0 нг/мл

11-Дезоксикортикостерон (DOC) - 1 нг/мл

11-дезоксикортизол (S) - 9,4 нг/мл

F/E - 1,4

ВЭЖХ кортикостероидов мочи:

Свободный кортизол мочи (FF) - 7,8 мкг/с

Свободный кортизон мочи (FE) - 15,0 мкг/с

FF/FE - 0,52

По данным ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи установлены следующие признаки стертой формы ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы:

1) увеличение уровня 11-дезоксикортизола крови на 370% (в 4,7 раза),

2) снижение соотношения F/E в крови,

3) снижение экскреции свободного кортизола с мочой на 32,2%.

Стандартные методы диагностики (ИФА):

ДЭА-сульфат - 3,5 мкг/мл

Тестостерон - 3,3 нмоль/л

ДЭА - 14 нг/мл

Андростендион - 4,5 нг/мл

17-ОНП-2,6 нг/мл-фон, 9,2 нг/мл - на пробе с синактеном.

кортизол - 625 нмоль/л-фон, 2177 нмоль/л - на пробе с синактеном.

Положительная проба с синактеном (Д=0,44) подтверждает наличие стертой формы ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы.

Пример 7. Больная К., 22 г. Клинические признаки стертой формы ВГКН - гиперандрогения, нарушение менструального цикла, низкий рост (156 см).

Данные стандартных методов анализа (ИФА):

Тестостерон - 2,6 нмоль/л

Свободный тестостерон 6,0

ДГЭА - 13 нг/мл

ДЭА-сульфат 6,6 мкг/мл

Δ-4андростендион 5,4 нг/мл

ГСПГ - 75 нг/мл

Проба с синактеном - кортизол 9 час 406 нмоль/л

Кортизол через 10 час - 1755 нмоль/л

17-ОНпрогестерон в 9 час - 1,6 нг/мл, 17-ОНпрогестерон через 10 час - 8,6 нг/мл, Д=0,56.

Повышенный уровень ДЭА-сульфата и ГСПГ свидетельствуют о надпочечниковой форме гиперандрогении. Проба с синактеном является сомнительной. Отмечены нормальный уровень 17-ОНП и его подъем на пробе с синактеном <10,0 нг/мл. Однако установленное Д=0,56 дает основание считать пробу с синактеном положительной. На основании стандартных методов нельзя с уверенностью диагностировать стертую форму ВГКН, тем более установить дефект ферментов стероидогенеза.

Данные ВЭЖХ кортикостероидов крови

Кортизол - 57,8 нг/мл

Кортизон - 48,8 нг/мл

Кортикостерон - 3,5 нг/мл

DOC - 28,0 нг/мл

S - 9,4 нг/мл

F/E - 1,18 нг/мл

Данные ВЭЖХ кортикостероидов мочи:

FF - 5,6 мкг/с

FE - 24,2 мкг/с

FF/FE - 0,23

Увеличение уровней DOC и S в крови, снижение экскреции свободного кортизола с мочой и соотношений F/E крови и FF/FE мочи дает основание диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 11β-гидроксилазы.

Использование предложенного способа позволяет диагностировать стертую форму ВГКН на ранних стадиях без использования дорогостоящих и трудоемких средств.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и лабораторной диагностике. Для осуществления способа диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочеников (ВГКН) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определяют в крови уровни кортизола, кортизона, кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона, 11-дезоксикортизола, а также экскрецию с мочой свободного кортизола и свободного кортизона. Рассчитывают соотношения F/E и FF/FE, где F - уровень кортизола в крови; Е - уровень кортизона в крови; FF - экскреция с мочой свободного кортизола; ЕЕ - экскреция с мочой свободного кортизона. При уровне кортизола в крови, не превышающем норму, и наличии по меньшей мере двух из трех признаков: уменьшение соотношения F/E на 25% и более, уменьшение соотношения FF/FE на 25% и более, уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой на 25% и более диагностируют стертую форму врожденной гиперплазии коры надпочечников. При этом при увеличении уровня кортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 21-гидроксилазы, а при увеличении уровня 11-дезоксикортизола и/или 11-дезоксикортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 11β-гидроксилазы. Использование предложенного способа позволяет диагностировать стертую форму ВГКН на ранних стадиях. 1 табл.

Способ диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников, включающий биохимическое исследование кортикостероидов крови, отличающийся тем, что дополнительно проводят биохимическое исследование мочи, при этом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определяют в крови уровни кортизола, кортизона, кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона, 11-дезоксикортизола, экскрецию с мочой свободного кортизола и свободного кортизона, рассчитывают соотношения F/E и FF/FE, где F - уровень кортизола в крови; Е - уровень кортизона в крови; FF - экскреция с мочой свободного кортизола; ЕЕ - экскреция с мочой свободного кортизона,

и при уровне кортизола в крови, не превышающем норму, и наличии по меньшей мере двух из трех признаков: уменьшение соотношения F/E на 25% и более, уменьшение соотношения FF/FE на 25% и более, уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой на 25% и более диагностируют стертую форму врожденной гиперплазии коры надпочечников, причем при увеличении уровня кортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 21-гидроксилазы, а при увеличении уровня 11-дезоксикортизола и/или 11-дезоксикортикостерона в крови на 50% и более судят о дефекте 11β-гидроксилазы.