СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/10 C12Q1/10 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к микробиологии, а именно к выявлению токсигенных кишечных палочек (Escherihia coli).

В настоящее время выявление токсигенных кишечных палочек осуществляется с помощью таких способов, как: твердофазный радиоиммунологический, ганглиозид-иммуноферментный, тест Бикена, реакция коагглютинации, культурально-клеточные исследования (цитотоксичность), проба отека мышиной лапы, лигирования петель кишечника кролика и анальная проба на мышах сосунах (Зароза В.Г. Эшерихиоз телят. - М.: Агропромиздат, 1991 - 239 с.).

Известные способы являются весьма трудоемкими, дорогостоящими, трудновоспроизводимыми, дефицитными по используемым реагентам, а некоторые из них не соответствуют требованиям комиссии по проблемам этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук.

Также известен способ биотестирования токсичности кормов с помощью инфузорий стилонихий (Виноходов Д.О. Токсилокологические исследования кормов с использованием инфузорий - СПб, 1995, - с.64-65 - прототип), где осуществляют подготовку исследуемого объекта, тест организмов в качестве которых используют инфузории вида стилонихии, затем проводят испытания по выживаемости инфузорий и по проценту их выживания определяют степень токсичности исследуемого объекта.

Недостатком известного способа является отсутствие возможности биотестирования токсигенности болезнетворных бактерий, например кишечной палочки (Escherihia coli).

Техническим решением является расширение технологических возможностей использования инфузорий в качестве тест-объекта для обнаружения токсигенных E.coli, относительного определения количества вырабатываемых ими токсинов и сроков максимального накопления токсинов в среде культивирования, что позволит осуществлять эпидемиологический надзор за присутствием и распространением патогенных штаммов кишечной палочки и оптимизировать сроки культивирования при производстве вакцинных препаратов против эшерихиоза молодняка животных.

Поставленная задача достигается тем, что в способе биотестирования токсигенности кишечной палочки, включающем подготовку исследуемого объекта, в качестве тест-организмов используются инфузории вида стилонихии. Проведение испытания по выживаемости инфузорий и определение степени токсичности исследуемого бактериального объекта осуществляется по проценту выживания инфузорий. В качестве исследуемого объекта используют кишечную палочку, а для испытаний по выживаемости инфузорий - культуру кишечной палочки, выращенную на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1-3 суток, при этом среду с инфузориями смешивают с бульонной культурой кишечной палочки в соотношении 3:1 (на 3 капли среды культивирования инфузорий добавляют 1 каплю бульонной культуры E.coli).

Новизна заявляемого предложения заключается в том, что применение заявляемого предложения позволяет осуществлять биотестирование токсигенности кишечной палочки за счет культивирования инфузорий стилонихии совместно с бульонной культурой кишечной палочки. Эффективность применения инфузорий вида стилонихии подтвердилась экспериментом, в котором изучали 4 вида инфузорий - парамеции, стилонихии, колподы и тетрахимены. После проведенных исследований пришли к выводу, что в данном тесте можно использовать лишь один вид инфузорий - стилонихии, так как только они оказались чувствительными к выделяемым E.coli токсинам. Все остальные виды инфузории не только не погибали, но и размножались в присутствии бульонной культуры кишечной палочки, даже при высоких ее концентрациях. Существенным является то обстоятельство, что гибель стилонихий сопровождается их полным лизисом, то есть полным распадом, что весьма удобно при подсчете оставшихся в живых инфузорий.

Предварительно с помощью метода полимеразноцепной реакции (ПЦР) были подобраны штаммы Е.coli, имеющие гены, отвечающие за выработку токсинов: у штамма 196 - за энтерогемолизин; у 173 - за выработку только шигатоксина; у 174(9) - за выработку гемолизина, некротизирующего и шигатоксина. Контролем служил штамм Е.coli М-17, используемый в качестве пробиотического препарата и поступающий в аптечную, сеть под названием "колибактерин", он не обладает патогенными и токсигенными свойствами. В качестве отрицательного контроля использовался стерильный питательный бульон Хоттингера.

Таблица 1
Чувствительность разных видов инфузорий к суточной культуре Е.coli№ штамма E.coliПроцент гибели инфузорийпарамециистилонихииколподытетрахимены1. 196размножились701002. 173023размножились153. 174(9)размножились450454. М-17020205. Бульон Хоттингераразмножились2размножились20

Результаты опыта отображены в таблице 1, из которой видно, что можно использовать только один вид инфузорий - стилонихии, так как только они специфически чувствительны к выделяемым токсинам Е.coli. Тогда как парамеции и колподы не только не погибали, но и размножались в присутствии бульонной культуры кишечной палочки, даже при высоких ее концентрациях. А такие инфузории как тетрахимены явились, напротив, очень чувствительными и погибали при добавлении даже нетоксигенной кишечной палочки - М-17 и стерильного питательного бульона.

В предварительных исследованиях было подобрано оптимальное соотношение бульонов культуры кишечной палочки, различного срока инкубации и среды инфузорий, которое составило 1: 3 (то есть на одну каплю бульонной культуры кишечной палочки приходилось 3 капли среды культивирования инфузорий), что позволило максимально снизить процент ошибки. Так, при более низких концентрациях питательной среды с E.coli стилонихии не погибали, а при увеличении данного параметра - наблюдалось лизирование инфузорий до100%.

Пример конкретного осуществления метода биотестирования токсигенности кишечной палочки.

На предметное стекло наносят среду со стилонихиями (суточная культура), проводят их подсчет (для удобства подсчета желательно, чтобы количество стилонихий составляло 10-20 особей) с помощью бинокулярной лупы или микроскопа (увеличение 2×8), затем добавляют исследуемую бульонную культуру E.coli. После чего спустя 5 минут производят предварительный просмотр и подсчет количества живых инфузорий, для того чтобы исключить погрешность, связанную с влиянием различных факторов окружающей среды - запах, перепад температуры, осмотического давления и т.д., так как инфузории являются весьма чувствительными к ним. Стекла с исследуемым материалом помещают в предварительно приготовленные чашки Петри, которые ставят в термостат с температурой, оптимальной для существования инфузорий - 18-23°С. Чтобы капли с инфузориями не высыхали, на дно чашки помещают фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. По истечении 2-х часов производят окончательный подсчет числа живых инфузорий, который сравнивают с первоначальным значением. Подсчитывают всех стилонихий (как подвижные, так и неподвижные), погибшими считаются только лизированные. Для получения наиболее достоверных данных опыт надо дублировать 3-5 раз, затем подсчитывается средний показатель. Чем выше процент лизированных (погибших) микроорганизмов, тем более токсичной является культуральная среда, а исследуемый штамм бактерий соответственно - токсигенным. Кроме того, провели исследования по выявлению влияния сроков инкубации на токсичность культуральной среды. Тест-культуры инкубировали в течение 72 ч, через каждые 24 ч осуществляли контроль уровня токсичности. Результаты данного опыта отражены в таблице 2, из которой видно, что количество стилонихий после их инкубации в присутствии бактериальной культуры E.coli, способной продуцировать сразу несколько токсинов, составляет 45-55%.

Количество погибших стилонихий после контакта со средой культивирования E.coli, продуцирующих только шигатоксин, - 23-26%.

Количество лизированных инфузорий после контакта со средой культивирования E.coli, продуцирующей только гемолизин, - 10-11%.

Количество спонтанно погибших и после контакта со средой культивирования нетоксигенного штамма E.coli М-17 (непатогенного) - 0-5%.

Таблица 2
Процент лизиса (гибели) стилонихий после контакта с культурой кишечной палочки, выращенной на бульоне ХоттингераСрок инкубации, чШтамм E.coli196173174(9)М-17Бульон Хоттингера247,0±0,326,0±,945,0±2,32,0±0,12,0±0,24811,0±0,524,5±1,047,5±2,55,0±0,307210,0±0,523,0±1,155,0±3,005,0±0,3

Проведенный опыт показал, что:

1). Инфузории можно использовать в качестве биологической модели для тестирования токсигенных свойств E.coli.

2). Не все виды инфузорий являются специфически чувствительными к токсинам E.coli, наиболее достоверные данные получаются при использовании стилонихий.

3). Наибольший процент гибели стилонихий (45-55%) вызвал штамм E.coli 174(9), обладающий политоксичностью; меньшей токсичностью обладал 2-й штамм - 173, вырабатывающий только шигатоксин (23-26%); штамм E.coli 196, выделенный от павшего животного, обладающий способностью продуцировать энтерогемолизин, вызвал лизис 7-11% стилонихий; 4-й штамм E.coli (М-17) вызывал гибель 0-5% стилонихий, такой же процент гибели происходил при внесении стерильного бульона Хоттингера.

4). Данный метод позволяет определить время максимального накопления количества токсинов, продуцируемых тест-штаммом E.coli. Так, например, штамм, имеющий ген, отвечающий за выработку только шигатоксинов, максимально продуцировал токсин через 24 ч его культивирования, а штамм, обладающий способностью продуцировать гемолизин, шигатоксин и некротизирующий фактор, - через 72 ч культивирования.

Использование бульона Хоттингера для выявления токсигенных свойств E.coli является наиболее предпочтительным, поскольку на такой питательной среде как мясопептонный бульон, основной среде культивирования бактерий, продукция токсинов этой бактерией не столь выражена. Для подтверждения этого приводим данные соответствующих экспериментов, результаты которых отражены в таблице 3.

Таблица 3
Процент лизиса (гибели) стилонихий после контакта с культурой кишечной палочки, выращенной на мясопептонном бульонеСрок инкубации, чШтамм E.coli196173174(9)М-17Мясопептонный бульон245,0±0,210,0±1,925,0±1,33,0±0,11,0±0,3489,0±0,513,5±1,029,5±2,52,0±0,33,0±0,2729,0±0,414,0±0,735,0±3,000

Из таблицы видно, что тенденция накопления токсинов, вырабатываемых кишечной палочкой в процессе культивирования на мясопептонном бульоне, аналогична при ее культивировании на бульоне Хоттингера, однако количественный уровень токсинов ниже, о чем свидетельствует более низкий процент гибели стилонихий.

Следовательно, для определения токсигенности штаммов кишечной палочки, изолированных из патологического материала от животных для получения достоверных результатов целесообразней использовать более богатый по питательности бульон Хоттингера нежели простой мясопептонный бульон.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при выявлении токсигенных кишечных палочек. Способ предусматривает проведение испытания по выживаемости инфузорий вида стилонихии путем смешивания среды инфузорий вида стилонихии с кишечной палочкой, выращенной на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1-3 суток в соотношении 3:1 и определение степени токсичности исследуемого объекта, оцениваемой по степени выживания инфузорий. Изобретение позволяет обнаружить патогенные штаммы кишечной палочки, осуществлять эпидемиологический надзор за ее присутствием и распространением, оптимизировать сроки культивирования при производстве вакцинных препаратов против эшерихиоза молодняка животных. 3 табл.

Способ биотестирования токсигенности кишечной палочки, включающий подготовку исследуемого объекта, тест-организма в виде среды инфузорий вида стилонихии, проведение испытания по выживаемости инфузорий и определение степени токсигенности исследуемого объекта по проценту выживания инфузорий, отличающийся тем, что в качестве исследуемого объекта используют кишечную палочку, а для испытаний по выживаемости инфузорий - культуру кишечной палочки, выращенную на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1-3 суток, при этом среду с инфузориями смешивают с бульонной культурой кишечной палочки в соотношении 3:1.