СРЕДСТВО ИЗ ОТХОДОВ ЦИТРУСОВЫХ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОЯЗВЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 A61P1/04 

Изобретение относится к медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к разработке способа получения полисахаридов из отходов цитрусовых, обладающих противоязвенной активностью.

Полисахариды оказывают гастропротективное действие преимущественно за счет их обволакивающих свойств. Экспериментально доказано, что продукты расщепления полисахаридов в опытах на животных стимулируют образование слизи и нормализуют кислотность сока желудка, что способствует грануляции ткани на дне язвенного дефекта [1, 2]. В медицинской практике используется плантаглюцид - смесь полисахаридов подорожника большого для лечения язвенной болезни желудка [3]. Данный препарат рассматривается нами в качестве прототипа и аналога по действию.

В патогенезе язвенной болезни значительную роль играют деструктивные процессы, обусловленные локальным закислением среды, гидролизом клеточных структур и биополимеров, повреждением плазматических и лизосомальных мембран клеток слизистой оболочки желудка (СОЖ) [4]. Важное значение, особенно при язвенном процессе нейрогенной этиологии, имеет нарушение регионального кровотока слизистой оболочки с последующей гипоксией клеток ишемизированной ткани, ведущей к нарушению энерогообеспечения и активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) [5].

Целью данного изобретения является получение полисахаридов путем комплексной переработки отходов цитрусовых, не относящихся к пектинам и обладающих более выраженной по сравнению с прототипом противоязвенной активностью.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Отходы цитрусовых (1:10) обрабатывают известковой водой (рН 10) и через 40 мин отжимают. Операцию повторяют еще дважды. В полученных объединенных фильтратах осаждают гесперидин 50% раствором кислоты хлористоводородной (рН 5). Полученный осадок гесперидина фильтруют. Маточный раствор после отделения гесперидина из отходов цитрусовых упаривают до 1/50 первоначального объема. Далее осаждение полисахаридов проводят 3-х кратным объемом 96% спирта этилового. Выделившийся осадок полисахаридов повторно растворяют в небольшом количестве воды (10-20 мл) и осаждают спиртом этиловым. Полученные полисахариды отделяют и сушат.

Способы поясняются следующими примерами.

Пример 1. 530 г сухих и измельченных отходов мандаринов типа "уншиу" обрабатывают раствором негашеной извести (10 частей сырья, 1 часть извести и 6 частей воды) (рН 10), отжимают через хлопчатобумажную ткань средней плотности. Операцию повторяют дважды. В полученных фильтратах осаждают гесперидин добавлением 50% раствора кислоты хлористоводородной до рН 5. Полученный осадок гесперидина отделяют фильтрованием.

3 л маточного раствора после получения из отжимов мандарина гесперидина концентрируют под вакуумом до 1/50 первоначального объема, т.е. до 60 мл. Далее к этому водному концентрату приливают 3-х кратный объем (180 мл) 96% спирта этилового для осаждения полисахаридов. Выпавший осадок полисахаридов отделяют, вновь растворяют в 15-20 мл воды и осаждают 60 мл спирта этилового. Данную операцию повторяют дважды. Полученные полисахариды отделяют и сушат. Выход целевого продукта составляет 5,75 г (1,085%).

Пример 2. 530 г сухих и измельченных до 5 мм отходов из апельсин типа "вашингтон" обрабатывают раствором негашеной извести (10 частей сырья, 1 часть извести и 6 частей воды) (рН 10), отжимают через хлопчатобумажную ткань средней плотности. Операцию повторяют дважды. Из полученных объединенных фильтратов осаждают гесперидин добавлением 50% раствора кислоты хлористоводородной до рН 5. Полученный осадок гесперидина отделяют.

3 л маточного раствора после отделения гесперидина упаривают до 60-70 мл. Далее к этому водному концентрату приливают 3-х кратный объем (180 мл) 96% спирта этилового для осаждения полисахаридов. Выпавший осадок полисахаридов отделяют, вновь растворяют в 15-20 мл воды, осаждают 60 мл спирта этилового. Данную операцию повторяют дважды. Полученные полисахариды отделяют и сушат. Выход целевого продукта составил 5,9 г (1,11%).

Пример 3. 450 г сухих и измельченных отходов до 5 мм из лимонов сорта "ударник" обрабатывают раствором негашеной извести (10 частей сырья, 1 часть извести и 6 частей воды) (рН 10), отжимают через хлопчатобумажную ткань средней плотности. Операцию повторяют дважды. Из полученных объединенных фильтратов осаждают гесперидин добавлением 50% раствора кислоты хлористоводородной до рН 5 и отделяют полученный осадок гесперидина.

2,2 л маточного раствора после отделения гесперидина концентрируют под вакуумом до 50 мл. Далее к этому водному концентрату приливают 150 мл 96% спирта этилового для осаждения полисахаридов. Выпавший осадок полисахаридов отделяют, вновь растворяют в 15-20 мл воды, осаждают 60 мл спирта этилового. Данную операцию повторяют дважды. Полученные полисахариды фильтруют и сушат. Выход целевого продукта составляет 4,95 г (1,10%).

На основе данных хроматографического анализа, в частности по величине интенсивности окраски пятен углеводов после обработки хроматорграмм анилинфталатным реактивом, установили, что основными моносахаридами в полисахаридных комплексах цитрусовых являются L-арабиноза, галактоза, рамноза, фруктоза и следовые количества галактозы. Преобладающие кислые моносахариды - галактуроновая и глюкуроновая кислоты.

Количественное содержание нейтральных сахаров определяют спектрофотометрически с пикриновой кислотой. Количественное определение кислых сахаров проводят карбазольным методом [12]. Из полученных данных следует, что максимальное содержание кислых сахаров, обладающих противовоспалительным действием, наблюдается в полисахаридных комплексах из отходов мандарин, что указывает на целесообразность их дальнейшего изучения.

Исследования противоязвенного действия веществ полученных полисахаридов из мандарина проводят на модели язвенной патологии, в основе которой лежит нейродистрофическое поражение желудка, воспроизводили по методу Н.С. Заводской, которая является одним из наиболее часто используемых методов для оценки противоязвенной активности соединений, путем наложения на 10 мин зажима Пеана на дуоденальную область под легким эфирным наркозом [6].

В эксперименте использовали белых крыс-самцов линии Вистар массой 140-160 г, содержащихся на стандартном режиме вивария. Животные были разделены на 4 группы: 1-я - контрольная группа крыс с нейродистрофическим поражением СОЖ; 2-я - крысы, получавшие ПСК (полисахаридный комплекс) перорально в течение 10 дней до воспроизведения патологической модели в дозе 50 мг/кг; 3-я - крысы, получавшие ПСК перорально в течение 10 дней до воспроизведения патологической модели в дозе 100 мг/кг и 4-я - крысы, получавшие плантаглюцид перорально в течение 10 дней до воспроизведения патологической модели в дозе 100 мг/кг. Животных декапитировали через 24 часа после операции и проводили тотальную резекцию желудка.

Степень поражения СОЖ оценивали по методу Смагина В. Г. путем тщательного макроскопического обследования слизистой оболочки и выражали в баллах [7].

В гомогенате СОЖ определяли содержание ТБК (реагирующих с тиобарбитуровой кислотой) - активных продуктов по методу Охкавы и соавт. [8]. В сыворотке крови определяли общую и изоферментную активности кислой фосфатазы, используя стандартные наборы реактивов фирмы La Chema.

У контрольных животных наблюдалось выраженное поражение СОЖ, которое составило 22,2 +0,19 баллов. При этом наблюдалось формирование "ишемических" линейных некрозов и глубоких эрозивных дефектов. Эти изменения соответствуют описанной в литературе картине "ишемических" некрозов при язвенной болезни, в патогенезе которой важную роль играет гипоксия тканей [9]. Следует отметить, что появление эрозивно-язвенных дефектов на СОЖ регистрировалось в основном в пилорическом отделе и в области преджелудка, т.е. там, где слизистая оболочка имеет слабые факторы защиты. Это подтверждает тот факт, что при нейрогенном поражении желудка резистентность слизистой оболочки снижается именно в данных зонах, в результате чего она становится восприимчивой к действию ульцерогенных факторов.

Профилактическое введение ПСК в течение 10 дней резко снизило степень поражения СОЖ: в дозе 50 мг/кг, как и у препарата сравнения - до 1,5+0,5 баллов, а в дозе 100 мг/кг - до 0,5+0,4, т.е. увеличение дозы привело к усилению защитного эффекта, оцениваемого по макроскопической картине СОЖ, в 2 раза. При этом дефекты слизистой выражались лишь в наличии небольших (до 2-3 мм) эрозий в пилорическом отделе желудка.

Одновременно с высокой степенью поражения СОЖ в сыворотке крови контрольных животных отмечалось увеличение активности общей кислой фосфатазы на 48% (Р<0,01) по сравнению с нормой и особенно выражено - на 70% (Р<0,001) - ее простатического изофермента. Помимо этого содержание ТБК-активных продуктов в гомогенате СОЖ в контрольной группе было значительно выше (в 2,3 раза), чем в опытных группах. Эти изменения свидетельствуют об усилении ПОЛ в СОЖ в процессе язвообразования и дестабилизации лизосомальных мембран с последующим выходом во внеклеточное пространство кислых фосфатаз. Профилактический прием ПСК как в дозе 50 мг/кг, так и в дозе 100 мг/кг, а также Платаглюцида резко (почти в 6 раз) снизил выход кислых гидролаз, что привело к нормализации активности этих ферментов в сыворотке крови. Одновременно наблюдалось снижение содержания ТБК-активных продуктов в гомогенате слизистой при приеме ПСК в дозе 50 мг/кг и Плантаглюцида на 56% (Р<0,01)по сравнению с контролем и на 64% (Р<0,01) - при приеме ПСК в дозе 100 мг/кг.

Определение острой токсичности и расчеты LD₅₀ осуществляли по методу Кербера [10]. Белым мышам массой 18-20 г внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл суспензии исследуемых веществ. На каждую дозу в опыте брали по 6 мышей. Установлено, что LD₅₀ водорастворимого полисахаридного комплекса отходов цитрусовых составляет более 2833 мг/кг, следовательно, данное вещество относятся к классу практически нетоксичных веществ [11].

Результаты проведенных исследований показывают, что заявляемый полисахаридный комплекс обладает выраженным противоязвенным действием, превышающим по некоторым показателям активность официального лекарственного препарата плантаглюцида.

Это свидетельствует о целесообразности дальнейших исследований данного вещества с целью создания эффективных лекарственных препаратов.

Таблица 1Степень поражения слизистой оболочки желудка у крыс с нейродистрофическим язвенным процессом и при профилактическом введении полисахаридного комплекса (ПСК) из кожуры цитрусовых.Вид дефектаБальная шкалаКонтрольные порядковые номераВведение ПСК в дозе 50 мг/кг
порядковые номераВведение ПСК в дозе 100 мг/кг
порядковые номераВведение плантаглюцида в дозе 100 мг/кг
порядковые номера  123456123456123456123456отсутствие эффекта0       +  ++ +    ++    отек, покраснение0,1                        единичные геморрагии0,2+++++ +++++ + + +++++++ изъязвление S-1 мм1++++ +                  эрозия 2-4 мм2+++++++ ++  +  +    + ++5-7 мм3+ ++ +                  8-10 мм4+  + +                  11-15 мм5     +                  16-20 мм6  + +                   множественные эрозии7++ +                    одиночная язва8+ + +                   множественные язвы9 +  +                   прободная язва10                        Степень поражения СОЖ 22,2±0,191,0±0,50,5±0,41,0±0,5М±м (баллы) n=6п=6n=6n=6

Таблица 2Влияние профилактического применения ПСК на активность общей кислой фосфатазы (Кф_общ) и простатического изофермента кислой фосфатазы (Кф_прост) в сыворотке крови крыс с нейродистрофическим поражением СОЖгруппы животныхактивность Кф_общ, нкат/лактивность Кф_прост, нкат/л1. контроль n=4; x±S_x480±0,41240±0,412. опыт (50 мг/кг) n=6; x±S_x180±0,8841,0±0,63. опыт(100 мг/кг) n=6; x±S_x192±0,745,6±0,154. плантаглюцид (100 мг/кг) n=6; x±S_x190±0,0742,5±0,30Примечание. В норме содержание кислой фосфатазы составляет:
общей 0-250 нкат/л;
простатического изофермента 0-70 нкат/л.Таблица 3Влияние профилактического применения ПСК на содержание ТБК-активных продуктов в СОЖ крыс с нейродистрофическим поражениемгруппы животныхсодержание ТБК-активных продуктов, нмоль МДА/мгСОЖ1. контроль n=6; x±S_x4,24±0,172. опыт (50 мг/кг) n=6; x±S_x1,85±0,243. опыт (100 мг/кг) n=6; x±S_x1,52±0,565. плантаглюцид (100 мг/кг) n=6; x±S_x1,75±0,24

n - количество животных в группе;

х - среднее значение;

S_x - среднестатистическое отклонение, (разница).

Литература.

1. Оболенцева Г.В. Растительные полисахариды - перспективный источник лекарственных средств // Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химически активности химических соединений: Тез. Докл.всесоюз.конф. - М., 1981. Ч.2. - С.108-109.

2. Anti-ulcer activity and mode of action of the polysaccaride fraction from leaves of Panax ginseng / Sun-Xiao-Bo, M. Ysukasa, Y.Haruci // Planta med. - 1992. - Vol. 58, №5. - P.432-435.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей, изд. 14-е. М.: Новая волна, 2000. - Т.2. - С.320.

4. Амиров Н.Ш., Белостоцкий Н.И. Активность лизосомальных ферментов в слизистой оболочке желудка крыс при экспериментальном язвообразовании // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1987. - №10. - С.445-448.

5. Нейрогенные механизмы гастродуоденальной патологии / Ф.И.Комаров, И.С.Заводская, Е.В.Морева и др. М.: Медицина, 1984. - 240 с.

6. Заводская И.С. Механизмы язвообразования экспериментальных язв желудка, вызванных нанесением чрезвычайных раздражителей на область 12-перстной кишки // Фармакология и токсикология. - 1955. - №2. - С.37-41.

7. Смагин В.Г., Виноградов В.А., Булгаков С.А. Лиганды опиатных рецепторов. - М.: Наука, 1983. - 237 с.

8. Ohkawa H., Ochihi N., Vagi К. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thyobarbituric acid reaction // Anal. Biochem.-1979.-Vol.95, N2.-P. 351-538.

9. Ивашкин В.Т., Минасян Г.А., Уголев А.М. Теория функциональных блоков и проблемы клинической медицины. Л.: Наука, 1990. - 303 с.

10. Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии. М, 1971. - С.526-531.

11. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. В кн. Технология новых промышленных химических веществ - Вып.13, М.: Медицина, 1973. - с.47-51.

12. Государственная фармакопея СССР. М.: Медицина, 1987. - XI изд. - Вып.1. - 334 с.; 1990. - Вып.2. - 398 с.

Изобретение относится к медицине и фармацевтике. Противоязвенное средство представляет собой полисахаридный комплекс, полученный при комплексной переработке отходов цитрусовых после их обработки известковой водой и подкислением 50% раствором кислоты хлористоводородной, для отделения гесперидина. Затем производят объединение водных экстрактов после отделения гесперидина, их упаривание и осаждение полисахаридов 3-х кратным объемом 96% этанола с последующей фильтрацией, очисткой и сушкой целевого продукта. Изобретение позволяет повысить активность продукта. 3 табл.

Водорастворимые полисахариды с противоязвенной активностью, отличающиеся тем, что их выделяют осаждением 3-кратным объемом 96%-го этанола из упаренных водных фильтратов, образующихся при отделении гесперидина из подкисленного экстракта, полученного обработкой отходов цитрусовых известковой водой.