СОСТАВ АГАРОВОГО ПОКРЫТИЯ ДЛЯ ТИТРОВАНИЯ МЕТОДОМ НЕГАТИВНЫХ КОЛОНИЙ КОРОНАВИРУСА - ВОЗБУДИТЕЛЯ ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/00 C12N7/00 

Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой оптимизированный состав агарового покрытия, который может найти применение при оценке эффективности (по показателю снижения уровня накопления возбудителя) in vitro и in vivo неспецифических медицинских средств защиты (химиопрепараты, интерферон и его индукторы) в отношении возбудителя ТОРС, ретроспективного выявления в сыворотке крови реконвалесцентов антител к вирусу ТОРС, а также при определении концентрации биологически активного коронавируса - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома.

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях для выявления в исследуемых пробах вируса ТОРС, специфического выявления в сыворотках крови реконвалесцентов антител к возбудителю ТОРС, а также при оценке эффективности in vitro и in vivo лекарственных препаратов в отношении одноименного заболевания.

В конце 2002 г. в странах Юго-Восточной Азии появилась новая, ранее неизвестная нозологическая форма, быстро распространившаяся во многие регионы Земного шара - тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС).

ТОРС представляет собой вирусное респираторное заболевание, хорактеризующееся скоротечным развитием и высокой летальностью (8-11%).

Механизм передачи заболевания от человека к человеку - воздушно-капельный, контактный и пероральный. Заражение наиболее вероятно в условиях тесного бытового общения.

По данным эпидемиологического наблюдения в период с ноября 2002 г. по июнь 2003 г. заболевание получило наиболее широкое распространение в странах Юго-Восточной Азии (Китай, Гонконг, Тайвань, Сингапур, Вьетнам) и Северной Америки (США, Канада).

По результатам совокупного анализа всех материалов 11 сотрудничающих лабораторий стран, где зарегистрированы случаи заболеваний тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС), установлено, что их этиологическим агентом заболевания является атипичный коронавирус [1-4].

Для диагностики ТОРС использовали вирусологические, серологические, иммуногистохимические, электронно-микроскопические методы диагностики, а также ПЦР-анализ и сиквенс нуклеотидной последовательности генома.

Филогенетический анализ показал, что новый вирус не имеет тесной связи с другими известными кластерами коронавирусов (группы 1, 2 и 3) [4].

С учетом эндемичности возбудителя для территории сопредельных с РФ государств и возможности его завоза ТОРС представляет потенциальную угрозу для здравоохранения РФ.

Учитывая организационные сложности, возникающие при медицинском обеспечении коллективов в чрезвычайных ситуациях, связанных с ликвидацией очагов вспышек ТОРС, актуальной задачей является выявление возбудителя в исследуемых биопробах и оценка его биологической активности, определение специфических антител в сыворотках крови реконвалесцентов ТОРС и поиск эффективных фармакологических препаратов [5].

Основным показателем, характеризующим биологическую активность возбудителя ТОРС, является чувствительность вируса к различным культурам клеток и лабораторным животным.

Общепринято, что для определения биологической активности возбудителей вирусной природы отечественные и зарубежные специалисты используют две системы титрования - культуру клеток и животных. При этом концентрацию возбудителя вирусной природы определяли до начала 50-х годов методами титрования вирусов по цитопатическому действию (по ЦПД₅₀) и величине, вызывающей 50% летальный эффект у животных при конкретном способе инфицирования (по ЛД₅₀). Первый метод имеет ошибку титрования от 0,5 до 1,5 lgЦПД₅₀, а второй - от 1,0 lg до 2,5 lgЛД₅₀ в зависимости от видов культур клеток и животных соответственно. Поэтому исследователи всегда стремились к еще более точному определению концентрации возбудителя, добиваясь ее минимальной погрешности.

Большинство используемых в вирусологической практике лабораторных животных (белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики и т.д.) являются не чувствительными к вирусу ТОРС. Поэтому для определения концентрации биологически активного возбудителя приходится использовать титрование на культуре клеток.

В 1952 году американским ученым Дульбекко Р. впервые в практику вирусологических лабораторий был предложен новый метод титрования возбудителя - по бляшкам (метод образования негативных колоний возбудителя) [6]. Он внес решающий вклад в развитие методов количественной оценки вирусов в различных материалах.

Суть метода заключается в том, что первичное внесение составленной прописи компонентов агарового покрытия обеспечивает рост и созревание полноценных вирионов вируса на фоне разрушения монослоя клеток и выхода зрелого возбудителя в питательную среду на определенные сутки. Внесение вторичного агарового покрытия обеспечивает окрашивание разрушенных вирусом клеток и получение негативных колоний («бляшек») вируса. Важно отметить, что метод титрования по бляшкообразованию негативных колоний в культуре клеток является наиболее чувствительным из всех существующих биологических методов определения активности возбудителей вирусной природы, так как имеет наименьшую ошибку титрования - от 0,1 до 0,5 lg БОЕ. Кроме того, чувствительность метода «бляшкообразования» в 100...1000 раз превосходит чувствительность выявления возбудителя с помощью иммуноферментного анализа и в 10...100 раз чувствительность выявления возбудителя с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции.

Учитывая многообразие популяций возбудителей вирусной природы, каждый вирус для своего размножения в культуре клеток или в межклеточном пространстве требует своего «питания». Кроме того, в зависимости от скорости репродукции вирусов в культурах клеток в состав агарового покрытия могут входить различные ингредиенты, позволяющие клеткам обеспечивать продукцию зрелых (полноценных) вирионов. При этом соотношение каждого из перечисленных компонентов, как правило, для того или иного рода (вида) вируса различное. Следовательно, каждый компонент значим при составлении агарового покрытия за исключением деминирализованной воды, которая служит определенным наполнителем. Он может быть подвержен количественному уменьшению взамен красителя без какого-либо снижения достигаемого эффекта. Следовательно, как при первичном, так и при вторичном агаровом покрытиях используется тот же основной состав агарового покрытия. Поэтому в вирусологической практике принято считать, что состав агарового покрытия един без какого-либо их значимого деления на два состава.

Изучение молекулярных особенностей вирусов человека и животных показало, что значение метода бляшек не ограничивается его использованием для титрования вируссодержащих культур. Анализ закономерностей распределения размеров негативных колоний, выявление в популяциях различных штаммов вирусов, клонов с генотипически обусловленными различиями по данному показателю, использование определенных культур клеток в качестве модельных тест-объектов сделали метод «бляшкообразования» одним из основных инструментов вирусологических исследований [7-9].

Условия образования негативных колоний в соответствии с механизмом «из клетки в клетку» позволяют считать вирусную популяцию, которую можно выделить из одной отдельно взятой бляшки, как потомство одной вирусной частицы. Это обстоятельство делает метод бляшек незаменимым инструментом при изучении генетики вирусов, в частности при выделении полученных с помощью генетических и генно-инженерных манипуляций генетически измененных вариантов вирусов, обладающих комплексом новых свойств [10].

Важно отметить, что каждое НИУ вирусологического профиля разрабатывает свой метод титрования негативных колоний исходя из экономических возможностей и интеллектуальных способностей. При этом за рубежом для проведения подобных исследований часто используются стандартные прописи растворов и сред [11, 12].

Изобретение содержит изобретательский уровень поскольку в настоящий момент из общедоступной литературы неизвестен состав заявленного агарового покрытия, позволяющего оценивать биологическую активность возбудителя ТОРС с указанным техническим результатом.

Целью настоящего изобретения является оптимизация состава агарового покрытия для определения концентрации биологически активного коронавируса - возбудителя ТОРС.

В состав агарового покрытия для определения концентрации биологически активного коронавируса - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома входят Бакто™ Агар, сыворотка крови крупного рогатого скота (СКРС), бикарбонат натрия, аминокислотно-витаминный комплекс, раствор Эрла, дистиллированная вода и краситель нейтральный красный (входит в состав только вторичного агарового покрытия).

Из данных литературы известно, что специалисты многих зарубежных научно-исследовательских учреждений используют свои составы агарового покрытия для определения биологической активности ряда возбудителей вирусных инфекций (геморрагической лихорадки с почечным синдром, лихорадки долины Рифт) [11, 12]. При этом по этим составам воспроизвести результат в отношении описанных возбудителей не представляется возможным. Однако для определения биологической активности вируса ТОРС в настоящее время состав агарового покрытия в литературе отсутствует.

Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что при использовании модифицированного состава агарового покрытия, предназначенного для определения концентрации биологически активного коронавируса - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома, воспроизводимость метода составляет 99,9%, а продолжительность анализа составляет (68±4) часов.

Новизна изобретения состоит в том, что в результате оптимизации состава агарового покрытия нами впервые предложен его модифицированный состав, использование которого обеспечивает количественную оценку биологической активности коронавируса - возбудителя ТОРС.

Оптимизированный состав агарового покрытия, рекомендованный для определения концентрации биологически активного вируса ТОРС, представлен в таблице 1.

Таблица 1
Состав агарового покрытия, рекомендованного для определения концентрации биологически активного вируса ТОРС¹КомпонентыНормативные документыОбъем агарового покрытия², млпервичноевторичное10-кратный концентрат аминокислотного витаминного комплексаТИ 6.001-8810,2±0,210,2±0,210-кратный концентрат глюкозосолевого раствора ЭрлаТИ 6.001-8810,2±0,210,2±0,2сыворотка крупного рогатого скотаТУ МЗ СССР 49-246-792,0±0,12,0±0,15% раствор бикарбоната натрияГОСТ 4201-792,1±0,082,1±0,08деминерализованная водаГФ-Х, ст.7325,3±0,220,3±0,20,1% раствор нейтрального красногоТУ 6.09-4120-75-5,0±0,0антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД.мл^-1)ГФ-Х0,2±0,10,2±0,11,5% раствор Бакто™ Агар«Bacto™ Agar» (REF 214010), производитель Becton, Dickinson and Company50±0,950±0,9Примечания: 1. Агаровое покрытие вносят во флаконы при температуре покрытия (42±2)°С.
2. Объем компонентов представлен на 100 мл агарового покрытия.

Определение концентрации вируса ТОРС в исследуемых пробах осуществляют следующим образом. Флаконы "В полет" с двухсуточным монослоем клеток, отобранные для титрования, извлекают из термостата и удаляют из них ростовую среду. Десятикратным шагом готовят разведения исследуемой пробы. На каждом флаконе обозначают номер пробы и разведение; на каждое разведение берут не менее четырех флаконов.

В каждый из четырех флаконов вносят по 0,5 мл соответствующего разведения и, покачивая флакон, равномерно распределяют инокулят по всему монослою культуры клеток. Затем флаконы укладывают горизонтально, при этом поверхность с клеточным монослоем должна находиться внизу, и оставляют при температуре (37,5±0,5)°С. Через 60 минут инокулят из флаконов удаляют пипеткой и в каждый флакон вносят 7,5 мл первичного агарового покрытия. Флаконы укладывают горизонтально, поверхность с инфицированным клеточным монослоем должна находиться внизу. Когда агар застывает, флаконы переворачивают клеточным монослоем вверх и помещают в термостат при температуре (37,5±0,5)°С. Через 48 часов во флакон вносят 7,5 мл вторичного агарового покрытия и продолжают инкубирование при тех же условиях. Учет негативных колоний проводят через 20 час после нанесения вторичного агарового покрытия. Негативные колонии (бляшки) белого цвета, имеют четко очерченные края на розовом фоне живых клеток. Диаметр бляшек - от 1,3 до 2,0 мм. При использовании флаконов объемом 25 мл во флакон вносят 2,7 мл агарового покрытия.

Количество вируса ТОРС в исследуемой пробе, выраженное в БОЕ*мл^-1, рассчитывают по формуле:

где: А - количество БОЕ в 1 мл пробы, БОЕ×мл^-1;

а - средневзвешенное количество бляшек во флаконе, шт.;

b - кратность разведения;

с - объем инокулята, мл;

n - количество определений.

Соблюдение предложенного оптимизированного агарового покрытия позволяет определять концентрацию и параметры бляшкообразования биологически активного возбудителя ТОРС, штамм СоД, в культуре клеток:

- биологическая активность, lg БОЕ×мл^-1(6,8±0.2)- средний размер негативных колоний, мм(1,6±0,2)- диапазон варьирования негативных колоний, мм(1,3...2.0)- соответствие дифференциальной кривой размеров негативных колоний нормальному распределениюсоответствует;- продолжительность анализа, час(68±4).

Определение индекса нейтрализации иммунной сыворотки к вирусу ТОРС осуществляют следующим образом. Используют исследуемую иммунную сыворотку, положительный контрольный образец (сыворотку животного того же вида, заведомо содержащую специфические антитела к вирусу ТОРС), отрицательный контрольный образец (сыворотку животного того же вида, заведомо не содержащую специфические антитела к вирусу ТОРС) и эталонный штамм СоД вируса ТОРС.

Готовят десятикратные разведения вируса ТОРС, штамм СоД. Из рабочих разведений отбирают аликвоты, в которые вносят равные объемы исследуемой сыворотки, положительного и отрицательных контрольных образцов. Полученные смеси помещают в термостат при температуре (37,5±0.5)°С. Далее определение проводят, как описано в предыдущем примере.

Индекс нейтрализации (ИН) определяют по формуле:

где lg А_к - биологическая активность в варианте с использованием отрицательного контрольного образца;

lg A_оп - биологическая активность в варианте с использованием исследуемой иммунной сыворотки.

Пример 1. Расчет биологической активности вируса ТОРС в исследуемых пробах

Таблица 2
Результаты определения биологической активности вируса ТОРС в исследуемых пробахРазведение вируссодержащей суспензииОбъем инокулята, вводимого во флакон (матрас), млКоличество флаконов (матрасов) на разведение, шт.Количество «бляшек» во флаконе (матрасе), шт.Среднее количество «бляшек», шт.Биологическая активность вируса, БОЕ/мл123456

Продолжение таблицы 212345610^-70,540, 1, 0, 10,56,0^×10⁶10^-60,542, 3, 3, 22,510^-50,5430, 32, 29, 3230,7

Пример 2. Расчета индекса нейтрализации иммунной сыворотки к вирусу ТОРС

Таблица 3
Результаты определения индекса нейтрализации иммунной сыворотки к вирусу ТОРС.Разведение вируссодержащей суспензииСыворотка...Объем инокулята, вводимого во флакон (матрас), млКоличество флаконов (матрасов) на разведение, шт.Количестве «бляшек» во флаконе (матрасе), шт.Среднее количество «бляшек», шт.Биологическая активность вируса, БОЕ/мл (lgБОЕ/мл)Индекс нейтрализации, lg БОЕ/мл10^-7 0,542, 2, 3, 22,3  10^-6Нормальная0,5430, 31, 27, 3530,86,0·10⁶ (6,8) 10^-5 0,54Слив- 2,010^-4 0,543, 2, 3, 43,0  10^-3Иммунная0,5437, 39, 32, 305,86,8·10⁴ (4,8) 10^-2 0,54Слив-  

Источники информации

1. CDC Report on SARS (http://www.cdc.gov/ncidod/sars.htm).

2. Pei J., SekelHck M.J., Marcus P.I., Choi I.S., Collisson E.W. Chicken interferon type I inhibits infectious bronchitis virus replication and associated respiratory illness. // J. Interferon. Cytokine Res. - 2001.- Vol.21, N 12. - P.1071-1077.

3. Turner R.B., Felton A., Kosak K., Kelsey D.K., Meschievitz C.K. Prevention of experimental coronavirus colds with intranasal alpha-2b interferon. // J. Infect. Dis. - 1986. - Vol.154, N 3. - P.443-447.

4. Ng L.F., Liu D.X. Further characterization of the coronavirus infectious bronchitis virus ЗС-like proteinase and determination of a new cleavage site. // Virology. - 2000. - Vol.272, N 1. - P.27-39.

5. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни - важнейший фактор биоопасности. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2003. - №3. - С.4-16.

6. Dulbecco R. Production of plaques in monolayer tissue cultures caused by single particles of animal viruses. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1952. - Vol 38. - P.747-752.

7. Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и теплокровных животных. - М., Медицина, 1975.

8. Левкович Е.Н., Карпович Е.Л., Засухина Г.Д. Генетика и эволюция вирусов животных. - М., Медицина, 1971.

9. Жданов В.М., Ершов Ф.И. Молекулярные основы биологии арбовирусов. - М., Медицина, 1973.

10. Пшеничнов В.А., Донченко В.В., Мошков А.Е. О некоторых закономерностях изменения структуры вирусных популяций. // В кн.: Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, Изд. АН СССР, 1975. - С.89-91.

11. Peter L.Summers, David J. McClain. Plaque assay and plaque-reduction neutralization test (PRNT). / Manual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and Hantavims Pulmonary Syndrom. Ed. Ho Wang Lee, Charles Calisher, Connie Schmaljohn. - WHO, Seoul. - 1998. - P.92-98.

12. McCown J., W.Brandt, W.Bancroft, and P.Russell. Dimethyl sulfoxide enhancement of phlebovirus fever virus plaque formation. // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1979. - Vol.28. - P.733-739.

Изобретение относится к области вирусологии. Состав содержит глюкозосолевой раствор Эрла, аминокислотно-витаминный комплекс, сыворотку крупного рогатого скота, 5% раствор бикарбоната натрия, 0,1% раствор нейтрального красного, 1,5% раствор Бакто™ Агара, деминерализованную воду, пенициллин и стрептомицин. Состав может быть использован в вирусологических и иммунологических исследованиях для выявления в исследуемых пробах вируса ТОРС, специфического выявления в сыворотках крови реконвалесцентов антител к возбудителю ТОРС, а также при оценке эффективности in vitro и in vivo лекарственных препаратов в отношении возбудителя ТОРС. 3 табл.

Состав агарового покрытия для титрования методом негативных колоний коронавируса - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома, характеризующийся содержанием следующих компонентов, мл из расчета на 100 мл агарового покрытия:

глюкозо-солевой раствор Эрла10,0-10,4аминокислотно-витаминный комплекс10,0-10,4сыворотка крупного рогатого скота1,9-2,15%-ный раствор бикарбоната натрия2,02-2,180,1%-ный раствор нейтрального красного для вторичного покрытия4,7-5,31,5%-ный раствор Бакто™ Агара49,1-50,9деминерализованная вода для первичного покрытия25,1-25,5для вторичного покрытия20,1-20,5пенициллин200 ЕДстрептомицин200 ЕД