ШТАММ ВИРУСА ЗАПАДНОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ (WESTERN ENCEPHALOMYELITIS VIRUS-WEE 163-A) ГКВ № 964 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N7/00 A61K39/193 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и предназначено для создания средств диагностики и профилактики заболеваний, вызванных вирусом западного энцефаломиелита лошадей.

Вирус западного энцефаломиелита лошадей (ВЗЭЛ) - возбудитель тяжелых заболеваний нервной системы - поражает человека и домашних животных (лошадей) и относится к группе карантинных инфекций (2-ая группа патогенности). Вирус передается кровососущими членистоногими (комарами) и в основном циркулирует в западном полушарии (Северная и Южная Америка), однако имеются сообщения о выделении ВЗЭЛ-подобного вируса на территории России, в Удмуртии (А.А.Смородинцев и др., 1962). Коммерческие отечественные диагностические тест-системы, базирующиеся на использовании очищенных вирусных антигенов, антител к ним (методы иммуноферментного анализа - ИФА, иммунофлюоресценции - ИФ, латекс-агглютинации - ЛА) или на выявлении генетического материала этого вируса (например, метод обратной транскрипции -полимеразной цепной реакции - ОТ-ПЦР) отсутствуют. Задача создания методов диагностики (в особенности дифференциации от других, близких по антигенной структуре альфавирусов) и профилактики этого заболевания, основанных на использовании хорошо охарактеризованных вирусных штаммов, остается актуальной. Отсутствие коммерческих отечественных диагностических тест-систем не позволяет проводить плановые экологические исследования (для выявления антигенно-родственных штаммов ЗЭЛ в сыворотках людей и животных) в регионах с потенциальным распространением антигенно-родственных альфавирусов.

Известны ослабленные (аттенуированные) штаммы вируса ЗЭЛ, использованные для приготовления диагностических и профилактических препаратов (например, штамм В628) в США. В Государственной коллекции вирусов Российской Федерации такие штаммы отсутствуют. Кроме того, в связи с общепринятыми правовыми нормами их коммерческое применение в других странах, в частности в Российской Федерации, невозможно.

В выпускаемой в РФ дивакцине (ВЗЭЛ - вирус восточного энцефаломиелита лошадей) применяется штамм ВЗЭЛ California с неохарактеризованной первичной структурой вирусных генов и его белков, а поэтому фенотип его патогенности невозможно контролировать на современном генетическом уровне.

Целью изобретения является создание высокопродуктивного штамма ВЗЭЛ с ослабленной вирулентностью, репродуцирующегося в доступной клеточной культуре (например, в фибробластах эмбриона кур - ФЭК) с высокими титрами при использовании производственных методов культивирования (роллерное или суспензионное) и обладающего высокой иммуногенной активностью и широкими антигенными связями с другими известными штаммами вируса ЗЭЛ с охарактеризованной первичной структурой белков вириона, который может быть использован для приготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Полученный штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей - western encephalomyelitis virus - WEE 163-А обладает рядом вирусологических свойств, позволяющих рассматривать его как удобную биотехнологическую модель для получения диагностических и вакцинных препаратов. Штамм может быть использован и для испытания противовирусных препаратов "ин витро" (в культуре ткани) и "ин виво" (на лабораторных животных). Штамм обладает высокой репродуктивностью, хорошо размножается в клетках ФЭК и перевиваемых клетках VERO при разных условиях культивирования, накапливаясь в титрах до 5×10⁹-1×10¹⁰ БОЕ/мл. Уровни его репродукции можно легко оценить по выраженному цитопатическому действию в клеточной культуре или титрованием по бляшкам под агаровым покрытием. Кроличьи антитела к нему реагируют в высоких титрах с другими известными штаммами ВЗЭЛ, циркулирующими в разных регионах мира. Штамм хорошо хранится при -70°С. Полученные нами сведения об его первичной структуре позволяют контролировать фенотип на генетическом уровне и могут быть использованы для создания генно-инженерных препаратов. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (ГКВ №964).

Культуральные свойства

Штамм вируса - WEE 163-A получен путем длительного последовательного культивирования и селекции мозгового варианта - WEE McMillan (McM) в первичных и перевиваемых клеточных линиях с периодическим клонированием среднебляшечного варианта (из бляшки в бляшку) путем предельных разведении. Вирус адаптирован к клеткам ФЭК.

Инфекционный титр вируса определяется титрованием под агаровым покрытием (число бляшкообразующих единиц в 1 мл культуральной жидкости –БОЕ/мл) или по развитию цитопатического эффекта (доз ЦПЭ/мл) в клетках ФЭК, ВНК-21 или VERO при титровании в микропланшетах. Штамм имеет среднебляшечный фенотип. Ниже приводятся показатели "продуктивности" штамма. Инфицирование монослоя двухсуточной культуры ФЭК с множественностью 0,1-1 БОЕ на 1 клетку приводит к развитию острой инфекции (цитопатическое действие вируса) и гибели клеток через 12-16 часов после заражения. При монослойном культивировании в стационарной культуре ФЭК уровень накопления инфекционного вируса достигает к этому времени 8-9×10⁸-1-5×10⁹ БОЕ/мл. Уровень продукции вируса на 1 клетку может превышать 1000 БОЕ (более 1000 инфекционных вирусных частиц).

Показатели инфекционного вируса при роллерном культивировании клеток ФЭК достигают уровней 5×10⁹-1-2×10¹⁰ БОЕ/мл. Роллерное и суспензионное культивирование инфицированных клеток ФЭК (1 млн. клеток/мл) позволяет получить большие (по массе) количества вируса.

Одновременно с инфекционной активностью в культуральной жидкости накапливаются гемагглютинины, которые определяются в реакции гемагглютинации с эритроцитами гуся (см. Шубладзе А.К. и С.Я.Гайдамович, 1958, Практическая вирусология) в титрах 1:32-1:64 ГАЕ/мл (гемагглютинирующих единиц). Реакция проходит в диапазоне рН 5,6-6,3 с оптимумом рН 6,0-6,1. Соотношение инфекционных и гемагглютинирующих единиц БОЕ:ГАЕ=10⁶-10⁷. Тест РГА может использоваться как ориентировочный на стадиях очистки и концентрации вируса.

Вирусные белки и антигенная активность

В состав вирусной частицы (вириона) ВЗЭЛ входят три белка: белок С (core) нуклеокапсида с мол. массой 33 кдальтон, который связан с геномной РНК вириона, и два гликопротеина оболочки вириона - Е2 (с мол. массой 46 кД) и Е1 (43 кД), Белок Е2 индуцирует в иммунном организме выработку нейтрализующих инфекционность антител, белок El - антигемагглютинирующих антител.

Штамм WEE 163-A обладает высокой антигенной активностью, а гипериммунная сыворотка кролика реагирует в высоких титрах (в реакциях нейтрализации - РН, торможения гемагглютинации - РТГА и иммунофлюоресценции - ИФ) с основными представителями ВЗЭЛ-подобных вирусов и в тех же реакциях более слабо - с относящимися к тому же серокомплексу Синдбис-подобными вирусами.

Инфекция и иммунитет у экспериментальных животных

Штамм WEE 163-A имеет ослабленную патогенность для мышей линии balb/c по сравнению со штаммом МсМ: при внутримозговом введении одинаковых доз вируса новорожденным мышам-сосункам гибель наступает позже на 1 сутки, чем в ответ на штамм МсМ; у взрослых мышей при периферическом заражении (подкожном или внутрибрюшинном) штаммом МсМ гибель мышей наступает на 3-4 сутки, а при заражении штаммом WEE 163-A той же дозой подкожно - выживают до 100% мышей, при внутрибрюшинном заражении штаммом WEE 163-A в той же дозе - выживают 50% мышей, а гибель оставшихся наступает на 7-8 сутки.

Культуральные и мозговые антигены штамма WEE 163-A характеризуются высокой иммуногенной активностью и вызывают развитие протективного иммунитета. Иммунные мыши, выжившие после подкожного заражения штаммом WEE 163-A, защищены от введения летальных доз (до 10) штамма МсМ.

Антигенные свойства

Вирус ЗЭЛ относится к роду Alphavirus (семейство Togaviridae) и входит в состав антигенного серокомплекса вирусов Синдбис - ЗЭЛ. Объединение Синдбис- и ЗЭЛ-подобных вирусов в один серокомплекс основано на антигенном сходстве белков оболочки вириона (белки Е1 и Е2 ВС и ВЗЭЛ имеют высокую гомологию и по первичной структуре), выявляемом в реакциях РН, РТГА, ИФ. Вирусы этой группы относятся к РНК-содержащим вирусам с геномом положительной полярности и имеют липидную оболочку. Обработка альфавирусов липид-экстрагирующими соединениями (нейоными детергентами, этиловым эфиром, хлороформом) в течение 30 минут приводит к инактивации инфекционной активности вируса. Диаметр вириона около 50 нм. В состав вирусных частиц входят три структурных белка, обладающих иммуногенными свойствами. Антитела к этим белкам или же сами белки выявляются в сыворотке иммунного (или больного) организма, а также в инфицированных клетках с помощью иммунологических реакций и вирусологических методов.

Методом иммуноблота было показано, что рекомендуемый штамм содержит три основных структурных белка: гликопротеины Е1 и Е2 оболочки вириона и белок С нуклеокапсида.

Трехкратная иммунизация кроликов или лабораторных мышей препаратами очищенного и сконцентрированного вируса (в т.ч. разрушенного детергентом) приводит к развитию специфического иммунного ответа. Структурные белки вириона можно выявить в зараженных ВЗЭЛ клеточных культурах методами ИФ или иммуноферментного анализа (ИФА коммерческие тест-системы отсутствуют). Использование специфических антител в методе непрямой иммунофлюоресценции позволяет обнаружить вирусспецифические белки в зараженных клетках в виде диффузного или гранулярного свечения в цитоплазме. Установлено, что антисыворотка к цельному или разрушенному вирусу и, главным образом, антитела к белку Е2 способны эффективно нейтрализовать инфекционную активность и других штаммов ВЗЭЛ (см. табл.2). Антисыворотка к цельному или разрушенному вирусу и, главным образом, антитела к белку Е1 приводят к торможению гемагглютинации гусиных эритроцитов, вызываемую разными штаммами ВЗЭЛ (см. табл.2).

Анализ аминокислотной последовательности белка Е2. Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность белка Е2:

N-конец-SITDDFTLTSPYLGF

CPNCRHSAPCFSPIKIENVWDESDDGSIRIQVSAQFGYNQAGTADVTKFRYMSYDHDH

DIEEDSMEKIAISTSGPCRRLGHKGYFLLAQCPPGDSVTVSITSGASENSCTVEFKIR

RKFVGREEYLFPPVHGKRVKCHVYDHLKERSAGYITMHRPSPHAYKSYLKEASGEVYI

KPPSGKNVTYECKCGDYSTGIVSTPTKMNGCTKAKQCIAYKSDQTKWVFNSPDLIRHT

DHSVQGKLHIPFRLIPTVCPVPLAHTPTVTKWFKGITLHLTATRPTLLTTRKLGLRAD

ATAEWITGTTSRNFSVGREGLEYVWGNHEPVRVWAQESAPSDPHGWPHEIIIHYYHRH

PVYTVIVLCGVALAILVGTASSAACITKARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCCIRPTNA-С-конец

Знание первичной структуры основного иммуногенного белка позволяет отслеживать изменения вирусного фенотипа на молекулярном уровне в процессе длительного культивирования вируса, а также использовать их для получения генно-инженерных конструкций, экспрессирующих белок Е2 или его фрагменты, для получения вирусных антигенов и антител к ним и последующего использования таких компонентов в иммунологических реакциях и тест-системах.

Пример 1. Получение препаративных количеств вирусных белков на основе штамма WEE 163-A.

Сравнительные показатели уровней накопления штамма WEE 163-A и прототипного штамма ВЗЭЛ МсМ приведены в табл.1. Использование штамма WEE 163-A для получения больших количеств вируса при производстве диагностических и профилактических препаратов будет более рентабельным (в пять-десять раз).

Пример 2. Демонстрация способности штамма WEE 163-A вызывать образование специфических антител, способных нейтрализовать разные штаммы вируса ЗЭЛ.

Трехкратную иммунизацию кроликов препаратами очищенных по стандартной методике вирусных частиц (разрушенных детергентом) проводили подкожно (паравертебральные точки) и в подколенные лимфатические узлы. Первую иммунизацию проводили с использованием полного адъюванта Фрейнда, последующие - без адъюванта с интервалом 4 недели. Титры антител определяли в стандартных реакциях (РН, РТГА, ИФ) с гомологичным (WEE 163-A) и прототипными гетерологичными (штаммы МсМ, FM, HJ, Y-62) вирусами, выделенными на территории Сев. Америки и России. Полученные результаты показывают (см. табл.2), что препарат антигена на основе предлагаемого штамма (WEE 163-А) обладает высокой иммуногенной активностью (высокие титры в РН, РТГА, ИФ), а индуцируемые им антитела вызывают перекрестную нейтрализацию основных прототипных штаммов ВЗЭЛ.

Биотехнологическая характеристика

Предлагаемый оригинальный штамм вируса ЗЭЛ (WEE 163-A-адаптированный, аттенуированный) обладает высокой репродуктивностью. Приготовленные на его основе препараты могут найти применение в вирусологической практике при разработке профилактических средств (вакцин -инактивированной, субъединичной, моновалентной и т.д.) против западного энцефаломиелита и диагностических тест-систем для выявления маркеров (антигенов и антител) этой инфекции. Штамм (как ослабленный по патогенности) может быть использован и для испытания противовирусных препаратов, т.к. титруется (точное количественное измерение) в стандартных, широко распространенных клеточных культурах. Приведенные сведения об аминокислотной последовательности основного иммунодоминантного белка вириона являются "паспортом" данного высокопродуктивного штамма, позволяющим изучать изменения фенотипа вируса на молекулярном уровне, и могут быть использованы для создания генно-инженерных препаратов.

Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей - western encephalomyelitis virus - WEE 163-A депонирован в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под номером ГКВ №964. Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность гликопротеина Е2 оболочки вириона

N-конец- SITDDFTLTSPYLGFCPNCRHSAPCFSPIKIENVWDESDDGSIRIQVSAQF

GYNQAGTADVTKFRYMSYDHDHDIEEDSMEKIAISTSGPCRRLGHKGYFLLAQCPPGDSVT

VSITSGASENSCTVEFKIRRKFVGREEYLFPPVHGKRVKCHVYDHLKERSAGYITMHRPSP

HAYKSYLKEASGEVYIKPPSGKNVTYECKCGDYSTGIVSTPTKMNGCTKAKQCIAYKSDQT

KWVFNSPDLIRHTDHSVQGKLHIPFRLIPTVCPVPLAHTPTVTKWFKGITLHLTATRPTLL

TTRKLGLRADATAEWITGTTSRNFSVGREGLEYVWGNHEPVRVWAQESAPSDPHGWPHEII

IHYYHRHPVYTVIVLCGVALAILVGTASSAACITKARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCC

IRPTNA-С-конец. Штамм обладает высокой репродуктивностью, хорошо размножается в клетках ФЭК и перевиваемых клетках VERO при разных условиях культивирования, накапливаясь в титрах до 5×10⁹-1×10¹⁰ БОЕ/мл. Кроличьи антитела к нему реагируют в высоких титрах с другими известными штаммами ВЗЭЛ, циркулирующими в разных регионах мира. Штамм хорошо хранится при -70°С. Штамм может быть использован для создания генно-инженерных препаратов. 2 табл.

Высокопродуктивный штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей - western encephalomyelitis virus - WEE 163-A рода Alphavirus (семейство Togaviridae) ГКВ №964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов, имеющий следующую аминокислотную последовательность (первичную структуру) гликопротеина Е2 оболочки вириона:

N-конец- SITDDFTLTSPYLGFCPNCRHSAPCFSPIKIENVWDESDDGSIRIQVSAQF GYNQAGТADVTKFRYMSYDHDHDIEEDSMEKIAISTSGPCRRLGHKGYFLLAQCPPGDSVT VSITSGASENSCTVEFKIRRKFVGREEYLFPPVHGKRVKCHVYDHLKERSAGYITMHRPSP HAYKSYLKEASGEVYIKPPSGKNVTYECKCGDYSTGIVSTPTKMNGCTKAKQCIAYKSDQT KWVFNSPDLIRHTDHSVQGKLHIPFRLIPTVCPVPLAHTPTVTKWFKGITLHLTATRPTLL TTRKLGLRADATAEWITGTTSRNFSVGREGLEYVWGNHEPVRVWAQESAPSDPHGWPHEII IHYYHRHPVYTVIVLCGVALAILVGTASSAACITKARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCC IRPTNA-С-конец.