СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к методам санитарно-микробиологического контроля производства продуктов животного происхождения и может быть использовано в молочной, мясоперерабатывающей и других отраслях пищевой промышленности.

Одним из методов микробиологического контроля производства мясных и молочных продуктов является определение в них, наряду с другими, бактерий группы кишечных палочек (БГКП), являющихся возбудителями пищевых интоксикаций. Определяют кишечную палочку и для санитарно-гигиенической оценки чистоты воды и поверхностей трубопроводов, емкостей и оборудования предприятий, а также чистоты рук персонала.

Известные способы определения БГКП основываются на способности бактерий расщеплять глюкозу и лактозу, которые входят в состав питательных сред. При этом в жидких питательных средах Хейфеца, ХБ (хинол-бромкрезол пурпурный) и КОДА, используемых в лабораторной практике, образуются кислые продукты биохимических реакций, которые изменяют цвет индикаторной (питательной) среды, что служит признаком их размножения, т.е. присутствия в пробе; в среде Кесслера образуется газ вследствие расщепления лактозы [1].

Способы определения БГКП в средах Хейфеца и Кесслера имеют существенные недостатки, заключающиеся в том, что анализ проводится в течение длительного времени (18-20 ч) и при температуре 37°С с необходимостью термостатирования. Кроме того, для окончательного заключения присутствия кишечных палочек требуется пересев их с этих сред (после анализа) на среду Эндо, Плоскирева или Левина и термостатирование чашек Петри со средой 18-20 ч при температуре 37°С с последующим окрашиванием по Граму и микроскопированием [2]. В результате значительно усложняется методика определения и увеличивается продолжительность анализа.

Способ определения БГКП в среде КОДА или ХБ (прототип) вследствие выделения кишечных палочек в чистой культуре не требует дальнейшего подтверждения пересевом на другие среды [1, 2], что сокращает время анализа. Однако анализ проводится также продолжительное время (18-20 ч) и при повышенной температуре (37°С). В производственных условиях это обстоятельство не позволяет своевременно реализовать выпускаемую предприятием продукцию.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в сокращении продолжительности обнаружения бактерий группы кишечных палочек при одновременном снижении температуры при анализе.

Это достигается тем, что для обнаружения БГКП в пробе по изменению цвета жидкой питательной среды КОДА или ХБ в качестве питательной среды для бактерий используют смесь среды КОДА или ХБ и католита с рН 7-9 и окислительно-восстановительным потенциалом -370 мВ при соотношении объемов 1:(0,5-1,0), а определение изменения цвета ведут после выдерживания пробы в течение 5-8 ч при температуре 18-25°С.

При смешивании католита, который является биологически активной жидкостью, катализирующей внутри- и межклеточный метаболизм и инициирующий процесс размножения микроорганизмов, и среды КОДА или ХБ, являющейся основным компонентом питания микроорганизмов, мы получаем жидкую систему, в которой идет ускоренное размножение микроорганизмов.

Способ осуществляется следующим образом. Приготавливают необходимое количество жидкой питательной среды путем растворения сухой среды КОДА или ХБ в дистиллированной воде и кипячения в течение нескольких (1-2) минут с последующим охлаждением до комнатной температуры.

Католит готовят в диафрагменном электролизере униполярной обработкой водопроводной воды в катодной камере аппарата поточного или дискретного действия до рН 7...9 и окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) -200...-400 мВ.

Величину водородного показателя устанавливают близкой к значению рН жидкой питательной среды (около 8 единиц) с тем, чтобы резче был заметен цветовой переход среды в кислую зону при размножении кишечных палочек, а значения ОВП лежат в области наибольшего проявления биологических свойств католита, способствующих протеканию метаболических процессов в живых клетках.

После приготовления жидких сред берут стерильно навеску или смыв (мазок) с продукта (молока, воды) или другой поверхности известным методом и переносят его в пробирку с физраствором. Затем в пробирку с пробой приливают приготовленную жидкую питательную среду (КОДА или ХБ), а после этого - Католит в количестве 30-50% от объема питательной среды. В присутствии кишечных палочек и их размножении цвет пробы с течением времени изменяется с зеленого на желтый.

Содержание католита в питательной жидкости менее 30% приводит к снижению скорости размножения кишечных палочек, что увеличивает время анализа; при более 50%-ной концентрации католита в смеси уменьшается интенсивность окраски пробы в пробирке и снижается точность определения и, кроме того, происходит рост других бактерий, мешающих определению. Та или иная степень разведения питательной среды католитом в указанном диапазоне зависит от концентрации БГКП: при малом их количестве необходимо больше католита, при большом - возможно снижение его количества.

Время, в течение которого происходит изменение цвета индикаторной (питательной) среды в присутствии БГКП при их размножении в исследуемой пробе, составляет 5-8 ч, а сам анализ проводится без термостатирования при температуре 18-25°С. При этом время выдержки зависит от количества бактерий в пробе: чем их больше, тем меньше время, за которое изменится окраска пробы, и наоборот. Наблюдение за изменением окраски пробы в пробирке проводят визуально, а для повышения точности оценки цвета применяют фотометрический метод, используя для этого, например, фотоэлектрокалориметр (ФЭК). При измерении на ФЭКе фиксирование окончания анализа производят при изменении начальной окраски пробы с БГКП на 10-15%; при меньшем отклонении считают, что кишечные палочки в пробе отсутствуют.

Пример.

Приготовили раствор питательной среды растворением 40 г порошка среды КОДА по ТУ 9229-072-00419785-97 в 500 см³ холодной дистиллированной воды, прокипятили в течение 2 мин, профильтровали, вновь довели до кипения и затем охладили до комнатной температуры (22°С). Готовая жидкая питательная среда КОДА имела рН 7,5 и была светло-зеленого цвета.

Католит готовили с помощью электроактиватора СТЭЛ-4Н-60 из водопроводной воды с добавлением в нее 0,9 мас.% поваренной соли. Получили 3 порции католита: с рН 7,2; 8,9 и 10,3 и ОВП -200, -370 и -460 мВ соответственно.

Для идентификации БГКП взяли смыв (мазок) с размороженной туши КРС и перенесли в физраствор (0,9 мас.%-ный раствор NaCl). В пробирки для анализа налили по 1 см³ приготовленной пробы. Затем в них налили жидкой питательной среды КОДА и католита (кроме контрольной пробы) из расчета соотношения объемов 1:0,5; 1:1 и 1:1,5. Общий объем пробы в каждой пробирке, включая 1 см³ физраствора с БГКП, составлял 10 см³. Пробирки с пробами закрывали стерильными марлевыми тампонами. Цвет жидкости в пробирках был от голубого до синего. Опыты проводили при температуре в лаборатории 20-24°C. Контрольная проба - без католита - анализировалась по обычной методике: при 37°С в течение 20 часов. Наблюдения изменения окраски пробы в пробирках вели визуально.

Результаты проведенных исследований влияния добавки католита в жидкую питательную среду КОДА на скорость обнаружения БГКП показаны в таблице.

Как видно из приведенных данных, оптимальные условия идентификации БГКП лежат в пределах: рН 7,0-9,0 и ОВП -370 мВ (с учетом допустимой эстраполяции), соотношение объемов среды КОДА и католита 1:(0,5-1,0) при времени выдержки 5-8 ч при температуре 18-25°С.

Для подтверждения наличия БГКП в пробах произвели высев из пробирок на среду Эндо, термостатирование при температуре 37°С в течение 20 ч, окрашивание по Граму и микроскопирование. Во всех случаях присутствия кишечных палочек, показанных в таблице, анализ подтвердил их наличие, а в пробах при максимальном разведении среды КОДА католитом (1:1,5) присутствовали еще и кокки и другие бактерии.

Были проведены параллельные опыты в одинаковых условиях со средой ХБ, при этом получены аналогичные результаты.

Таким образом, добавка католита в питательную среду КОДА или ХБ приводит к значительному ускорению роста и развития бактерий группы кишечных палочек при нормальной температуре, что ведет к сокращению времени и уменьшению температуры при анализе по сравнению с известными способами.

Источники информации

1. ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа.

2. Артемьева С.А. и др. Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки. Справочник. М.: Колос, 2002, с.242.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам санитарно-микробиологического контроля производства продуктов животного происхождения, и может быть использовано в молочной и мясоперерабатывающей отраслях промышленности. Способ заключается в том, что для обнаружения бактерий группы кишечных палочек в пробе по изменению цвета жидкой питательной среды для бактерий использует смесь среды КОДА или ХБ и католита с рН 7-9 и окислительно-восстановительным потенциалом -370 мВ при соотношении объемов 1:(0,5-1,0), а определение изменения цвета с зеленого на желтый ведут после выдерживания пробы в течение 5-8 ч при температуре 18-25°С. Изобретение позволяет значительно сократить продолжительность обнаружения БГКП при одновременном снижении температуры при анализе. 1 табл.

Способ обнаружения бактерий группы кишечных палочек в пробе по изменению цвета, предусматривающий приготовление жидкой питательной среды КОДА или ХБ, внесение в нее пробы и выдерживание до изменения цвета питательной среды на желтый, отличающийся тем, что при приготовлении питательной среды используют смесь питательной среды КОДА или ХБ и католита с рН 7-9 и окислительно-восстановительным потенциалом - 370 мВ при соотношении объемов 1:(0,5-1,0), выдерживают пробу в течение 5-8 ч при температуре 18-25°С, а определение изменения цвета ведут визуально или фотометрически.