Способ обнаружения энтеробактерий в воде Советский патент 1991 года по МПК G01N33/18 

1

(21)4615334/13 (22)01.12.88 (46)23.12.91. Бюл. №47

(71)Кишиневский медицинский институт

(72)В.М.Никитин, А.П.Каланча, Ф.И.Георги- ца, В.М.Скуратов и Л.Б.Загибалова

(53) 586(088.8)

(56) Корш Л.Е., Артемова Т.З. Ускоренные методы санитарно-бактериологического исследования воды. М., Медицина, 1978, с. 164-165.

(54)СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭНТЕРОБАК- ТЕРИЙ В ВОДЕ

(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам обнаружения энтеробактерий в регененированной воде. Цель изобретения - ускорение и повышение точности определения. Отобранн/ю пробу воды вносят во флакон с питательной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор, с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор. 5 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам обнаружения энтеробактерий в регенерированной воде.

Известны способы ускоренного обнаружения микроорганизмов в жидкостях по их способности редуцировать соли тетразоли- ев.

Наиболее близким по технической сущности является способ обнаружения кишечных палочек с помощью индикаторных бумажек, пропитанных питательной средой, содержащей мясо-пептонный бульон, лактозу, агар и ТТХ.

Недостатком известного способа является длительность обнаружения кишечных палочек (24-48 ч), а также его недостаточная чувствительность. Это связано с тем, что в состав среды внесен ТТХ, который при росте оказывает угнетающее действие на рост и размножение микроорганизмов,

Кроме того, способ индикаторных бумажек позволяет обнаружить только кишечные палочки, тогда как в воде могут

находиться и другие представители энтеробактерий.

Цель изобретения - ускорение и повышение точности определения энтеробактерий в регенерированной воде.

Поставленная цель достигается тем, что способ осуществляют путем посева отобранной пробы воды во флакон с питательной средой в виде пленки, содержащей сухой питательный бульон, углевод и индикатор, с последующей инкубацией и обнаружением энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор. При этом в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натрия или калия двухзаме- щенный, фосфорнокислый натрий, глицерин и дистиллированная вода при следующем соотношении ингредиентов в мас.%:

Сухой питательный

бульон0,014-0,016;

нитрат натрия или

калия0,001-0,01;

сл

с

XI О О О 00.

Двухзамещенный

фосфорнокислый

натрий0,0025-0,0035;

Глицерин0,0015-0,0025;

Вода дистиллиро-

ваннаяОстальное,

В качестве индикатора используют раствор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды.

Включенный в состав питательно-субстратной пленки нитрат натрия (калия) используют в качестве субстрата, который редуцируется абсолютно всеми знтеробак- териями в нитрит натрия (калия) и определяется с помощью индикатора на нитриты по хромогенной реакции. Двухзамещенный. фосфорнокислый натрий создает оптимальный рН 7,2-7,4 для роста и размножения энтеробактерий при растворении питательно-субстратной пленки в пробе регенерированной воды, которая имеет рН 6,4-6,6. Глицерин совместно с бульоном в сочетании с нитратом натрия (калия) служат пита- тельной основой для энтеробактерий, которая способствует их оптимальному росту и быстрому размножению (табл.1). Кроме того, глицерин совместно с питательным бульоном создает условия для образования пленки и фиксации ее на дне флакона, что способствует сохранности ее питательных качеств и стерильности (табл.2}.

Для обнаружения нитритов используется индикатор, содержащий реактив Грисса, цинковую пыль и ледяную уксусную кислоту в соотношениях 1,0:0,001:0,25 на 10 мл дистиллированной воды, который является наиболее чувствительным (табл.3).

Все это позволяет повысить чувствительность и ускорить обнаружение энтеробактерий до 6-4 ч при концентрациях . 104-106 и до 9 ч при концентрациях до 1-10 микробных клеток в 1 мл (табл.4).

Способ осуществляют следующим образом.

2,Приготовление индикатора на нитриты. Навеску сухого реактива Грисса растворяют в дистиллированной воде, добавляют ледяную уксусную кислоту и цинковую пыль. Полученный раствор фильтруют и хранят в холодильнике.

0 смешивают каплю среды из флакона с индикатором на нитриты и определяют их по изменению цвета, что свидетельствует о наличии в водб энтеробактерий.

П р и м е р 1. Методика приготовления

5 питательно-субстратной пленки. Навеску питательного сухого бульона в 15 г тщательно размешивают в колбе со 100 мл холодной дистиллированной воды. Кипятят на медленном огне 1-2 мич, постоянно помеши0 вая. В полученный раствор вносят 2 г нитрата натрия (калия) и 3 г двухзамещенно- го фосфорнокислого натрия, постоянно перемешивая до полного растворения. Затем полученный раствор дважды фильтруют че5 рез двойной бумажный фильтр, после чего добавляют 2 мл глицерина. Питательная основа имеет вид жидкости темно-коричневого цвета. Далее пипеткой-дозатором переносят по 0,2 мл жидкой питательно-суб0 стратной основы в химически чистые сухие флаконы емкостью 10 мл. Для получения питательно-субстратных пленок выпаривают жидкую часть путем помещения флаконов под струю нагретого до 60°С

5 воздушного потока на 1 ч. После получения пленок светло-коричневого цвета флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками и стерилизуют.

Флаконы с питательно-субстратными

0 пленками хранят при +4-7°С в условиях холодильника и используют для ускоренного обнаружения энтеробактерий в регенерированной воде.

( сухого реактива Грисса и тщательно его гомогенизируют пестиком до получения мелкодисперсной пудры, затем приливают 10 мл дистиллированной воды, постоянно

0 перемешивая до полного растворения реактива. После чего раствор переносят в бактериологическую пробирку, к нему приливают 0,25 мл ледяной уксусной кислоты и вносят 0,01 г цинковой пыли. Полученный индика5 тор фильтруют и хранят в пробирке с плотно закрытой пробкой в холодильнике пыли в темном месте при комнатной температуре.

Исследуемую регенерированную воду забирают стерильным шприцем в объеме 1 мл и вносят во флакон с питательно-субстратной пленкой путем прокола резиновой пробки иглой шприца. После легкого встря- хивания для полного растворения и равномерного распределения питательной основы, флаконы направляют в термостат при 37°С. Регистрацию результатов проводят через 6 и 9 ч инкубации. Для этого с помощью шприца забирают 0,1 мл индикатора на нитриты и вносят во флакон путем прокола резиновой пробки иглой шприца. При положительной реакции на нитриты происходит окрашивание содержимого флакона в течение 1 мин в вишнево-красный цвет, а при отрицательной - остается первоначальный цвет (соломенно-желтый). При положительной реакции через б ч в 1 мл регенерированной воды до подращивания содержится 105-10е микробных клеток в 1 мл, а при положительной реакции через 9ч- 1-100 клеток в 1 мл.

Предлагаемый способ является более быстрым и позволяет повысить чувствитель- ность обнаружения энтеробактерий при наличии единичных микробных клеток в 1 мл регенерированной воды.

Т а б л и ч а 1

Влияние ингредиентов питательно-субстратной пленки на рост и размножение эчтеробактерий

Примечание. Вода для посева содержала 1-10 микробных клеток в t мл.

Формула изобретения

Способ обнаружения энтеробактерий в воде, предусматривающий посев отобранной пробы воды в питательную срэду. содержащую сухой питательны оульон, углевод и индикатор, последующую инкубацию и регистрацию энтеробактерий по их способности восстанавливать индикатор, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности определения, в сухой питательный бульон дополнительно введены нитрат натрия или калия, двухэамещенный фосфорнокислый натрий, и глицерин и дистиллированная вода при этом ингредиенты взяты в следующем соотношении, мас.%:

Сухой питательный

бульон

Нитрат натрия или

калия

Двухзамещенный

фосфорнокислый

натрий

Глицерин

Вода дистиллированная

а в качестве индикатора твор, содержащий реактивую пыль и ледяную укс соотношениях 1,0:0,001:0тиллированной воды.

10

более 10

обна руже

НЫ

Таблица2

Сохранность питательных качеств и стерильности питательно-субстратной пленки

„ ТаблицаЗ

Чувствительность и скорость определения энтеробэктерий а зависимости от количественных соотношений ингредиентов индикатора на нитриты

Примечание. Регистрация результатов обнаружения энтеробэктерий проводилась через 9 ч инкубации при 37°С

- - реакция отрицательная; С - реакция сомнительная; РП - реакция резко положительная . Скорость и чувствительность обнаружения энтеробэктерий предлагаемым и известным способом

г. В предлагаемом способе энтеробактерии в концентрациях 10-10 обнаруживались через 6-Ц ч, а в концентрациях 1-100 - через 9 ч инкубации при 37°С.

В известном способе обнаруживались только E.coli я концентрациях 10 и более при инкубации а течение 2 ч,.

Таб лица

Примечание,, Регистрация результатов обнаружения энтеробактерий проводилась через

9 ч инкубации при 37°С.

Чувствительность и скорость обнаружения энтеробактерий в зависимости от количественных соотношений ингредиентов питательно-субстратной пленки