СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПСИНА Российский патент 2005 года по МПК C12N9/76 

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к технологии получения протеолитических ферментов, и может быть использовано в биологической промышленности при производстве культуральных вирусных вакцин, при работе с клеточными культурами, в медицине, ветеринарии и других отраслях промышленности.

Известен способ получения трипсина (1) - прототип, предусматривающий двухкратное размораживание и замораживание поджелудочной железы (ПЖ) от убойных животных в течение 12-16 часов, измельчение ПЖ, добавление воды и серной кислоты, выдерживание в течение 6 часов при 16-24°С при постоянном перемешивании, отделение экстракта путем центрифугирования с повторной экстракцией жмыха по описанной выше технологии, объединение полученных экстрактов с добавлением сернокислого аммония для осаждения балластных белков, отделяемых центрифугированием и утилизируемых. К трипсиносодержащей жидкости повторно добавляют сернокислый аммоний. Осадок трипсина отделяют на центрифуге, разводят водой и направляют на распылительную сушку. Выход готовой продукции с ПЖ составляет 1-1,5% (2).

Существенным недостатком этого способа является низкий выход готовой продукции (1-1,5%), многостадийность, трудоемкость, длительность технологических процессов и их сложность, трудность аппаратурного оформления и осуществления в промышленных условиях, загрязненность целевого продукта сернокислым аммонием, что отрицательно сказывается на качестве готового препарата, а также необходимость строительства очистных сооружений из-за загрязненности производства, не подлежащего утилизации сернокислым аммонием (1, 2).

Целью заявленного изобретения является увеличение выхода и повышение специфической активности трипсина, упрощение технологического процесса и сокращение его продолжительности, а также повышение безопасности и экологической чистоты производства.

Поставленная цель достигается тем, что технологический процесс получения трипсина включает измельчение (гомогенизацию) ПЖ, экстракцию готового продукта, отделение балластных белков и липидов путем добавления к гомогенату 1%-ного кислотного раствора хитозана из расчета 0,4-1,2 л на 1 кг ПЖ, перемешивание, отстаивание в течение 10-12 часов, фильтрацию полученной смеси через бельтинг-ткань, концентрирование трипсиносодержащего фильтрата методом ультрафильтрации через полые волокна, лиофилизацию или распылительное высушивание концентрата трипсина.

Пример 1 (получение трипсина с оптимальным количеством хитозана).

Для получения трипсина по предлагаемому способу 100 кг ПЖ от убойных животных размораживают при температуре 15-25°С и добавляют 200 л водопроводной воды. Полученную смесь подвергают измельчению на коллоидной мельнице. В гомогенат добавляют 1%-ный кислотный раствор хитозана в количестве 0,9 л на 1 кг ПЖ, включают механическую мешалку (180 об/мин) для перемешивания реакционной смеси до появления агломерированных частиц балластных веществ в виде белково-липидной фракции, перемешивание останавливают и реакционную смесь отстаивают в течение 10-12 часов. Отстоявшуюся смесь подвергают фильтрации для отделения сформировавшейся белково-липидной фракции, трипсинсодержащий раствор направляют на ультрафильтрацию для концентрирования трипсина. Полученный концентрат трипсина подвергают лиофильной сушке на ТГ - 50.

Выход готовой продукции из ПЖ составляет 12%. Специфическая активность трипсина по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 10 ПЕ/г препарата.

Полученный трипсин представляет собой тонкодисперстный порошок белого или кремового цвета, без посторонних примесей со специфическим запахом.

Пример 2 (получение трипсина с минимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 0,4 л на 1 кг ПЖ. Выход готовой продукции из ПЖ составляет 8%, а специфическая активность трипсина по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 8 ПЕ/г препарата.

Пример 3 (получение трипсина с максимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 1,2 л на 1 кг ПЖ. Выход готовой продукции из ПЖ составляет 10%, а специфическая активность трипсина по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 9 ПЕ/г препарата.

Пример 4 (получение трипсина с нижеминимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 0,3 л на 1 кг ПЖ.

Выход готовой продукции из ПЖ составляет 6%, а специфическая активность по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 5 ПЕ/г препарата.

Пример 5 (получение трипсина с вышемаксимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 1,3 л на 1 кг ПЖ. Выход готовой продукции из ПЖ составляет 10%, а специфическая активность по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 9 ПЕ/г препарата.

Таким образом, увеличение добавления 1%-ного кислотного раствора хитозана свыше 1,3 л на 1 кг ПЖ не приводит к увеличению выхода и повышению специфической активности трипсина (табл.1)

Таблица 1Сравнительные данные по выходу и активности трипсина в зависимости от количества 1%-ного кислотного раствора хитозана.Номер примераКоличество 1%-ного кислотного р-ра хитозана, лВыход трипсина из ПЖ,%Специфическая активность, ПЕ/г10,9121020,48831,210940,36551,3109

Сравнительная характеристика физико-химических и биологических свойств трипсина, полученных по известному способу и предлагаемому изобретению приведены в таблице 2.

Таблица 2Сравнительная характеристика физико-химических и биологических свойств трипсина.ХарактеристикаПоказатель при способе получения трипсинаЗаявленномИзвестномВыход трипсина из поджелудочной железы, %8-121,0-1,5Специфическая активность, ПЕ/г8-102,5-6,5Длительность технологического процесса, час3672

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет значительно (в 8 раз) увеличить выход целевого продукта и повысить активность трипсина за счет более полного выделения целевого продукта из трипсиносодержащей жидкости, сократить продолжительность технологического процесса за счет исключения целого ряда стадий, повысить безопасность и экологическую чистоту производства за счет исключения из процесса применения сернокислого аммония. В технологическом процессе не используются спирты и другие пожаровзрывоопасные и загрязняющие окружающую среду вещества.

Источники информации

1. SU 1628526, А 1, кл. С 12 N 9/76 - (прототип).

2. Попова В.М. Усовершенствование технологии изготовления и изучение свойств трипсина сухого для вирусологических целей. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 1999, с.38, 166.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению протеолитических ферментов? и может быть использовано в медицине, ветеринарии и других отраслях. Способ предусматривает измельчение (гомогенизацию) поджелудочной железы в водопроводной воде без применения буферных растворов, экстракцию продукта, отделение балластных белков и липидов. Отделение балластных белков и липидов осуществляют путем добавления к гомогенату 1%-ного кислотного раствора хитозана, перемешивания, отстаивания. Фильтруют полученную смесь через бельтинг-ткань. Концентрируют трипсиносодержащий фильтрат методом ультрафильтрации через полые волокна и подвергают сушке. Изобретение позволяет увеличить выход трипсина, повысить специфическую его активность, упростить технологический процесс получения трипсина и сократить его продолжительность, повысить безопасность и экологическую чистоту производства. 2 табл.

Способ получения трипсина, предусматривающий размораживание поджелудочной железы убойных животных, измельчение ее, экстракцию, отделение балластных белков и липидов, фильтрацию, концентрирование, высушивание и расфасовку целевого продукта, отличающийся тем, что перед измельчением в размороженную поджелудочную железу добавляют водопроводную воду, а экстракцию ведут обработкой гомогената 1%-ным кислотным раствором хитозана в количестве 0,4-1,2 л на 1 кг поджелудочной железы.