СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПСИНА Российский патент 2010 года по МПК C12N9/76 

Изобретение относится к биотехнологии, к технологии получения энзимов, а именно протеолитического фермента трипсина для использования в производстве культуральных вирусных вакцин, ветеринарии, медицине и других отраслях. Способ предусматривает измельчение поджелудочной железы убойных животных с последующим экстрагированием в подкисленной дистиллированной воде, разделением суспензии на фракции после экстрагирования на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм, высаливанием балластных веществ и фермента, разделением на фракции после высаливания на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм, с последующим высушиванием целевого продукта методом распыления или сублимации и расфасовкой целевого продукта, обессоливанием фермента методом диафильтрации на ультрафильтрационных аппаратах с использованием полых волокон (см. табл.1, 2).

Изобретение относится к биотехнологии, получению энзимов, таких как протеолитический фермент трипсин для использования в производстве культуральных вирусных вакцин, ветеринарии, медицине и других отраслях.

Известен способ изготовления трипсина для получения однослойных тканевых культур (1), который включает основные этапы: измельчение исходного сырья, экстрагирование фермента, высаливание балластных веществ и фермента, включающие ручные способы фильтрования через тканые мешки после первого высаливания и сбора осадка трипсина на бумажном фильтре, сушкой высола трипсина в калориферной или вакуумной сушилке и последующим измельчением и просеиванием готового продукта. Недостатком этого метода является ручной способ разделения и длительная сушка препарата, в результате которой есть возможность обсеменения конечного продукта посторонней микрофлорой, помимо всего на конечной стадии необходимо его измельчение и просеивание.

Другой известный способ получения трипсина связан с сильной гомогенизацией исходного сырья, что приводит к образованию устойчивой суспензии, а выделение балластных веществ и липидов с помощью раствора хитозана является дорогостоящим компонентом, применение бельтинг-ткани мало производительно для больших производственных серий (2).

В качестве прототипа можно рассматривать способ получения трипсина (3), предусматривающий способы разделения суспензий после экстрагирования и высаливания с помощью центрифугальной техники, а сушку препарата распылительным высушиванием.

Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении выхода очищенного препарата, его активности и срока годности. Указанная цель достигается тем, что для избежания устойчивости суспензии при экстрагировании исходное сырье измельчают до оптимальных размеров (7-11 мм) и экстрагируют при периодическом перемешивании в автоматическом режиме с последующим разделением суспензии на фракции на осадительно-фильтрующей центрифуге с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм, а после высаливания балластных веществ и трипсина разделением на фракции на осадительно-фильтрующей центрифуге с использованием фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм с последующей сушкой целевого продукта методом распыления или сублимации.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1 (оптимальный вариант). Поджелудочную железу (ПЖ) после хранения (не менее 4 месяцев - не более 12 месяцев) и последующего попеременного двукратного замораживания и оттаивания измельчают на электромясорубке с диаметром отверстий решетки заявленного интервала 7-11 мм, что обеспечивает эффективное разрушение клеточных оболочек ткани, исключает при экстрагировании образование устойчивой суспензии, повышает активность фермента и полный его выход по сравнению с аналогами (2 мм и менее 2 мм) /способ 1, 2/ и прототипом (5-6 мм) /способ 3/ (табл.1). Измельчение сырья до размеров 7 и 11 мм /способы 4, 14/ также улучшает все указанные позиции, но несколько уступает способам 5-13 по объему образующегося после экстракции надосадка.

Экстрагирование фермента из поджелудочной железы (100 кг фарша) проводят в водной среде в 2 этапа в эмалированных или нержавеющих реакторах. Дистиллированную воду, подкисленную серной кислотой (7 мл на 1 л), добавляют к сырью в соотношении 2:1 при первом экстрагировании и 1:1 при повторном экстрагировании. Перемешивание суспензии в сравнении с аналогом и прототипом осуществляют в автоматическом режиме при температуре 7-15°С: при перемешивании в течение 3 мин и с остановкой на 7 мин, что исключает пенообразование и получение устойчивой суспензии, наблюдаемое при постоянном перемешивании. При этом происходит образование наибольшего надосадка (199 л) после отстоя на 1 этапе экстрагирования (из 100 кг фарша) и повышение активности фермента (табл.1).

Балластные белки и трипсин выделяли методом фракционного осаждения из экстрактов в два этапа с помощью сульфата аммония (230 г на 1 л при высаливании балластных белков и - 180 г на 1 л при получении высола трипсина).

В таблице 1 представлены данные известных (1, 2, 3) и предлагаемых способов (4-14), отличающиеся разделением суспензии на фракции после экстрагирования на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента - от 0,5 мм до 10-12 мм и разделением на фракции после высаливания на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента - от 12 мкм до 26-28 мкм. Предлагаемые способы 4, 7, 8, 12, 13, 14 при применении разделения суспензий на фракции после экстрагирования на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента 1-5 мм и разделения на фракции после высаливания на центрифуге с размером пор фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм наиболее оптимальные. Технологический процесс при этом сокращается на 25 час по сравнению со способом 3 и на 48 час по сравнению со способом 1.

Отделение балластных белков и липидов при добавлении к гомогенату 1% хитозана (способ 2) сокращает процесс, но для больших серий в производственных масштабах не приемлем, так как он дорог по сравнению с солями, используемыми при осаждении балластных белков и трипсина и срок хранения ниже.

Пример 2. Пример осуществляют аналогично примеру 1, который отличается тем, что для удаления солей используют аппараты УВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50ПА, УВА-2-100ПА на полых волокнах ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из ароматического полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа с использованием гидросистемы с помощью центробежного насоса марки ЦНГ-0,5/10.

Раствор трипсина (0,25%) очищают и концентрируют на ультрафильтрационных аппаратах (табл.2), при обессоливании препарата применяют метод диафильтрации (в фильтруемый раствор вводят растворитель, равный объему фильтрата). Аппараты УВА-2-5ПА, УВА-2-15 ПА (с полыми волокнами ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА и с пределом задержания по белку 5, 15 кДа) при ультрафильтрации исходного раствора трипсина дают мутный фильтрат, в то же время УВА-2-50 ПА, УВА-2-100ПА (с полыми волокнами ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА и большим пределом задержания по белку 50, 100 кДа) обеспечивают получение прозрачного фильтрата. Наибольшая степень обессоливания трипсина на 1 этапе происходит на аппарате УВА-2-50 ПА при высокой степени концентрирования, а на аппарате УВА-2-100ПА концентрирование на всех этапах имеет высокую степень, увеличивающуюся до значения 7,25 по мере удаления солей. При диафильтрации на этой установке эффект обессоливания исходного раствора возрастает с каждым последующим циклом. Ультрафильтрационные установки на полых волокнах позволили в благоприятных гидродинамических условиях осуществлять на компактных аппаратах очистку, концентрирование и обессоливание диафильтрацией ферментного раствора трипсина в стерильных условиях.

Таблица 2 Характеристики Растворы Цикл Наименование разделительных аппаратов УВА-2-5ПА УВА-2-15 ПА УВА-2-50 ПА УВА-2-100ПА Степень удаления солей диафильтрацией Концентрат 1 1,38 1,06 6,30 1,10 2 2,49 2,10 4,00 1,70 3 4,00 3.60 2,60 2,50 4 2,75 2.70 1,10 3,50 Степень концентрации Концентрат 1 1,87 6,04 5,94 5,23 2 1,22 4,15 5,99 6,00 3 1,63 2,79 4,09 5,41 4 3,44 3,05 4,32 7,25 Прозрачность Фильтрат 1-4 мутный мутный прозрачный прозрачный Производительность, л/мин Фильтрат 1 0,76 0,78 1,10 0,58 2 1,00 0,78 1,10 0,50 3 1,90 0,72 0,55 0,45 4 1,00 0,76 0,29 0,42

Источники информации

1. РСТ Латвийской ССР 424-84 ТУ ОКП 921.828.1500.

2. Патент РФ 2265053, С12N 9/76.

3. Авторское свидетельство SU 1628526, С12N 9/76.

Изобретение относится к биотехнологии. Подготовленную поджелудочную железу убойных животных измельчают до размеров 7-11 мм и подвергают экстрагированию в подкисленной дистиллированной воде при температуре 7-15°С и периодическом перемешивании. Разделяют суспензию на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм. Разделение на фракции после высаливания балластных веществ и трипсина проводят с использованием фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм с последующим высушиванием целевого продукта методом распыления или сублимации. При этом обессоливание проводят диафильтрацией на ультрафильтрационных аппаратах с использованием полых волокон. Изобретение обеспечивает повышение выхода очищенного препарата, его активности и срока хранения. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения трипсина, предусматривающий двойное замораживание и двойное размораживание поджелудочной железы убойных животных, измельчение исходного сырья с последующим двойным экстрагированием в подкисленной дистиллированной воде, разделение суспензии на фракции фильтрованием, высаливание балластных веществ и трипсина, разделение на фракции с последующим высушиванием и расфасовкой целевого продукта, отличающийся тем, что измельчение исходного сырья проводят до размеров 7-11 мм, экстрагирование проводят при температуре 7-15°С и периодическом перемешивании в автоматическом режиме, разделение суспензии после экстрагирования осуществляют на осадительно-фильтрующей центрифуге с автоматической выгрузкой осадка с применением фильтрующего элемента с размером пор 1-5 мм, а разделение на фракции после высаливания балластных веществ и трипсина проводят с использованием фильтрующего элемента с размером пор 16-20 мкм с последующей сушкой целевого продукта методом распыления или сублимацией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление солей, используемых для высаливания балластных веществ и трипсина, проводят диафильтрацией с использованием аппаратов на полых волокнах.