Способ получения протеолитических концентратов Советский патент 1993 года по МПК A61K35/39 A23L1/31 

Изобретение относится к переработке

ерментного сырья, в частности к производтву ферментных концентратов, обладаюцих протеолитической активностью,

оторые могут быть использованы для выдеения высокоочищенных ферментных преаратов, таких как дезоксирибонуклеазы

ДНК-аза), рибонуклеаза (РНК-аза), трипин, химотрипсин, трипсиноген, химотрипиноген и катепсин-С.

Цель изобретения - предварительное ведение в экстракт 0,02-0,2 моль/л моче- ины и использование в качестве животного ырья замороженных естественным холо- ом до температуры минус 3-5°С поджелу- очной железы и селезенки северного леня, использование которых позволит бо- ее полно удовлетворить потребность био- имическойимедицинской

ромышленности в протеолитических фер- ентах. В настоящее время из-за удаленно- ти регионов обитания северного оленя от ест переработки эндокринно-ферментно- о сырья поджелудочная железа иселезенка е используются, следовательно получение ротоконцентратов на местах убоя живо- ных (бойнях) позволит не только рационально использовать оленеводческую продукцию, ной высвободить для производства инсулина дополнительное количество поджелудочной железы, перерабатываемое в настоящее время для получения протеоли- .тических ферментов.

Сущность способа заключается в том, что для удобства измельчения поджелудочную железу или селезенку северного оленя замораживают до температуры минус 3- 5°С, для стабилизации белковых структур при гомогенизации в сырье вводят 0,02-0,2 моль/л мочевины, экстрагирование ферментов ведут в течение 1-5 час при температуре 5-38°С и рН 2,3-4,5. По окончании экстракции отделяют негидролизованные остатки ткани, а экстракт лиофильно высушивают. Для очистки экстракта в некоторых случаях предусматривается высаливание балластных белков с обязательным отстаиванием экстракта, удалением осадков и ли- офилизацией экстракта.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами.

Пример 1.1,0 кг поджелудочной железы замораживают до температуры минус 3°С, измельчают ее до состояния флрша.

(Л

С

00

со м

00 00

ю

|

со

3 18378824

а затем фарш гомогенизируют в.4 объемахстаивают при температуре 5°С в течение 18

(от массы измельченного сырья) охлажден-час, а затем из экстракта удаляют нераствоного до минус 1° С водного раствора, содержаще-1рившиеся ткани путем центрифугирования.

го 0,2 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведутФугат лиофильно высушивают. Полученный

при температуре не выше в течение 3 5концентрат представляет собой порошок

мин, после чего к гомогенату прибавляют 5бледно-розового цвета, в. котором содерн, раствор серной кислоты до рН 2,3 и прижится 5,8% влаги и 60,0% белка. Специфипостоянном перемешивании и вышеуказан-ческая ДНК-азная активность 1 мг

ной температуре проводят экстрагирование концентрата составляет 0,07 Ед.

ферментов. Через 5 час в экстракт прибав-П р и м е р 4. 1,0 кг селезенки замораляют сульфат аммония до 0,23 насыщения иживают до температуры минус , измельпосле часового перемешивания проводятчают ее до состояния фарша, а затем фарш

формирование осадка при температуре 3°Сгомогенизируют в 1 объеме охлажденного

в течение 6 час. Образовавшийся осадок .до 1°С водного раствора, содержащего 0,04

удаляют центрифугированием при темпера-моль/л мрчевины. Гомогенизацию ведут

туре не выше 5°С, а фугат лиофильно высу-.при температуре не выше 5°С в течение 10

шивают. Полученный концентратмин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н.

представляет собой порошок белого цвета враствор серной кислоты до рН 3,5 и при

котором содержится 5,4% влаги. 2,3% жира „энергичном перемешивании в течение 1,5

и 40,1% белка. Содержание ДНК-азы со-час ведут экстрагирование ДНК-азы. По исставляет 0,08 Ед/мг; трипсин+химотрипсинтечение указанного времени экстракт отста- 0,8 Ед/мг, а РН К-азы - 0,05 Ед/мг концен-rивают при температуре 5°С в течение 24 час,

трата.после, чего удаляют остатки нерастворивПример 2. 1,0 кг поджелудочной шейся ткани центрифугированием, а фугат

железы замораживают до температуры ми-лиофильно высушивают. Полученный коннус 5°С, измельчают ее до состояния фарша,центрат представляет собой порошок бледа затем фарш гомогенизируют в 4 объемахно-розового цвета, в котором содержится

охлажденного до 0°С водного раствора, со-10,0% влаги и 80,0% белка. Специфическая

держащего 0,2 моль/л мочевины. Гомогени- -пДНК -азная активность 1 мг концентрата созацию ведут при температуре не выше 5°Сставляет 0,5 Ед.

в течение 10 мин, после чего к гомогенатуП р и м е р 5. 1,0 кг селезенки замора- прибавляют 5 н раствор серной кислоты доживают до температуры минус 3°С, измель- рН 3,5 и при постоянном перемешивании ичают ее до состояния фарша, а затем фарш вышеуказанной температуре проводят экс-гомогенизируют в одном объеме охлажден- трагирование ферментов. Через 5 час после ного до 0°С водного раствора, содержащего перемешивания экстракта в него прибавля-0,02 моль/л мочевины. Гомогенизацию веют мелкими порциями сульфат аммония додут при температуре не выше 5°С в течение 0,23 насыщения. Формирование осадка3 мин, после чего в гомогенат прибавляют 5 проводят при температуре 6°С в течение 12 .н. раствор серной кислоты, до рН 3,0 и в час. Осадок из экстракта удаляют центрифу- wтечение 30 мин проводят интенсивное пере- гированием при температуре не выше 5°С,мешивание смеси при комнатной темпера- а фугат лиофильно высушивают. Получен-туре. Остатки соединительной ткани ный концентрат представляет собой поро-удаляют из экстракта путем центрифугиро- шок белого цвета, в котором содержится .вания, а в фугат прибавляют гидроокись на- 10,1% влаги, 4,9% жира и 65,9% белка. Со-трия до рН 6,0 и сульфат аммония до 0,4 держание ДНК-азы составляет 1,6 Ед/мг,насыщения. Смесь отстаивают в течение 1 трипсин+химотрипсин - 2,1 Ед/мг, а РНК-час и удаляют из нее образовавшийся оса- азы - 1,1 Ед/мг концентрата.док путем центрифугирования. Осадок от- Пример 3. 1,0 кг селезенки замора- брасывают, а фугат лиофильно высушивают, живают до температуры минус.3°С, измель-Полученный концентрат представляет со- чают ее до состояния фарша, а затем фаршбой порошок бледно-розового цвета, в кото- гомогенизируют в одном объеме охлажден-ром содержится 4,9% влаги, 59,5% белка и ного до 0°С водного раствора содержащего9,7% минеральных веществ. Специфиче- 0,04 моль/л мочевины. Гомогенизацию ве- ,.екая РНК-азная активность 1 мг концентра- дут при температуре не выше 5°С в течениета составляет 0,7 Ед. - 3 мин, после чего в гомогенат прибавляют 5Пример 6.1,0 кг селезенки замора- н, раствор серной кислоты до рН 2,3 и приживают до температуры минус 5°С, измель- энергичном перемешивании ведут экстра-чают ее до состояния фарша, а затем фарш гировэние ДНК-азы в течение 1 часа. Погомогенизируют в одном объеме охлажден- истечении указанного времени экстракт от-ного до 1°С водного раствора, содержащего

),2 моль/л мочевины. Гомогенизацию ведут |ри температуре не выше 5°С в течение 10 1ин, после чего в гомогенат прибавляют 5 н аствор серной кислоты до рН 5 и в течение 50 мин проводят интенсивное перемешива- ше смеси при комнатной температуре. Ос- атки соединительной ткани удаляют из жстракта центрифугированием, а в фугат фибавляют гидроокись натрия до рН 8,0 и ;ульфат аммония до 0,4 насыщения. Смесь истаивают в течение 2,5 час, удаляютиз нее (бразовавшийся осадок центрифугирова- шем, а фугат лиофильно высушивают. Пол- ченный концентрат представляет собой юрошок белого с розоватым оттенком цве- а, в котором содержится 9,9% влаги,, 70,1 % белка и 5,3% минеральных веществ. Специфическая РНК-азная активность 1 мг концентрата составляет 2,0 Ед.

Пример 7. 1,0 кг селезенки замора- кивают до температуры минус 3°С, измель- 1ают ее до состояния фарша, а затем фарш омогенизируют в течение 3 мин в 2 объемах от массы селезенки) водного раствора, со- ;ержащего 0,02 моль/л мочевины. По исте- (ении указанного времени в гомогенат трибавляют 5 н. раствор гидроокиси натрия о рН 7,0 и продолжают гомогенизацию в ечение 10 мин. В полученную суспензию цобавляют 3,5 н,раствор серной кислоты до )Н 3,5 и при температуре 38°С и интенсив- юм перемешивании ведут экстрагирование сатепсина-С в течение 1 час. Затем в экс- ракт добавляют 10 мл толуола, смесь энер- ично перемешивают и оставляют при шшеуказанной температуре для отстаивания на 20 час, при этом через каждые 3 час троводят корректирование рН. Из отстояв- иегося экстракта путем центрифугирования удаляют нерастворившуюся часть ткани, в лиофильно высушивают.,Полученный сонцентрат представляет собой порошок :легка желтоватого цвета в котором содер- кится 4,9% влаги и 35,0% белка. Специфи- (еская катепсиновая активность составляет ),18 Ед/мг белка.

Пример 8. 1.0 кг селезенки замора- кивают до температуры минус 5°С, измель- 1зют ее до состояния фарша, а фарш омогенизируют в течение 10 мин в двух )бъемах (от массы селезенки) водного рас- вора, содержащего 0,02 моль/л мочевины. 1о истечении указанного времени в гомоге- ат прибавляют 5. н.раствор гидроокиси на- рия до рН 7,0 и продолжают омогенизацию в течение 25 мин. В пол- ченную суспензию добавляют 3,5 н. рас- вор соляной кислоты до рН 3.5 и при

температуре 38°С и интенсивном перемешивании ведут экстрагирование катепсмна- С в течение 1,5 час, после чего в экстракт добавляют 10 мл толуола, смесь энергично перемешивают и оставляют при вышеуказанной температуре для отстоя на 26 час, при этом через каждые 3 час проводят корректировку рН. Из отстоявшегося экстракта удаляют нерастворившуюся часть тканей путем центрифугирования при температуре не выше 3°С. С фугата снимают образовавшуюся в результате охлаждения жировую пленку и подвергают его лиофильному высушиванию. Полученный концентрат представляет собой порошок слегка желтоватого цвета, в котором содержится 10,0% влаги и 45,5% белка. Специфическая катепсиновая активность составляет 0,5 Ед/мг белка. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

1.Способ получения протеолитических концентратов, предусматривающий измельчение животного сырья, экстракцию ферментов кислым, раствором при рН 2,3- 4,5, отстаивание экстракта, удаление из него осадка и лиофилизацию экстракта, отличающийся тем, что в качестве животного сырья используют поджелудочные железы или селезенку северного оленя, при этом перед экстракцией в сырье вводят 0,02-0,2 моль/л мочевины.

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю щи и с я тем, что при использовании в качестве сырья поджелудочной железы северного оленя перед отстаиванием в экстракт вводят сульфат аммония до 0,23 насыщения.

3.Способ по п.1, о т л и ч а ю щи и с я тем. что при использовании в качестве сырья селезенки северного оленя с целью получения протеолитического концентрата, обладающего дополнительно рибонуклеаз- ной активностью, экстракцию ведут при комнатной температуре, из экстракта удаляют нерастворившиеся ткани и затем вводят гидроокись натрия до значений рН 6,0-8,0 и сульфат аммония до 0,4 насыщения, образовавшийся в процессе отстаивания осадок удаляют,

4.ч Способ по п.1,отличающийся тем, что при использовании в качестве сырья селезенки северного оленя с целью получения протеолитического концентрата, обладающего дополнительно катепсиновой активностью, после введения в сырье мочевины в смесь вводят гидроокись натрия до рН 7,0. экстракцию и отстаивание экстракта ведут при 38°С, а перед отстаиванием в экстракт вводят толуол.