СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ СЕМЯПОЧЕК Российский патент 2005 года по МПК A01G7/00 A01G17/02 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам получения стерильного растительного материала в культуре изолированных органов, тканей и клеток. Изобретение содействует охране окружающей среды.

Известен способ стерилизации растительных тканей воздействием активного хлора (гипохлорит кальция и натрия, хлорамин, хлорная известь). (Р.Г.Бутенко. "Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений", 1964, с.24-28).

К недостаткам способов применения активного хлора следует отнести необходимость приготовления каждый раз свежих растворов, высокие концентрации стерилизаторов, продолжительный период стерилизации, необходимость неоднократной промывки материала после стерилизации и невысокая эффективность стерилизации.

Известен способ получения стерильных зародышей и других генеративных органов (А.И.Здруйковская-Рихтер. "Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений in vitro", 1974, стр.34-39), где в качестве стерилизующего средства используется 90-95° спирт, в который погружается плод или косточка и затем обжигается над пламенем спиртовой горелки.

Недостатком данного способа является то, что не всегда достигается положительный эффект стерилизации.

Известен способ стерилизации семяпочек, включающий отделение плодов, промывание их, стерилизацию (Н.П.Лесникова, А.В.Смыков, В.М.Горина. "Биотехнологические исследования садовых и других ценных многолетних культур", 1997, с.50-51).

Недостатком этого способа является отсутствие положительного эффекта от стерилизации, что сказывается на невысокой его эффективности в отдельных комбинациях скрещивания персика (число инфицированных зародышей 17,2-27,8%), абрикоса (11,7-12,5%) и алычи (сорт Идиллия).

Целью стерилизации семяпочек винограда является обработка дезинфектантом, снижающим инфицирование семяпочек при вводе их в культуру in vitro.

Поставленная цель достигается тем, что в способе стерилизации семяпочек, включающем отделение плодов, промывание, стерилизацию, стерилизацию осуществляют в 2 этапа 0,8% раствором азотнокислого серебра, при этом вначале обрабатывают плоды в течение 8-10 минут, а затем выделенные из них семяпочки в течение 5-6 минут.

Новым в предложенном способе является то, что впервые азотнокислое серебро применяется для дезинфекции в культуре тканей и органов винограда.

Существенным является то, что в способе применяется двухкратная обработка одним и тем же дезинфектантом как ягод, так и семяпочек. При этом вначале ягоды обрабатывают 0,8% раствором азотнокислого серебра в течение 8-10 минут, затем выделенные из них семяпочки также обрабатывают 0,8% раствором азотнокислого серебра течение 5-6 минут. Благодаря предложенному способу инфицирование семяпочек, полученных при самоопылении бессемянных сортов, при вводе в культуру уменьшилось до 6,2-8,5%, а полученных от скрещивания бессемянных сортов винограда с бессемянными до 0-2,4%.

Способ осуществляется следующим образом.

Гроздь винограда, полученную от самоопыления или от скрещивания бессемянных сортов винограда, приносят в лабораторию вместе с пергаментным изолятором, в котором она находится на винограднике. Ягоды отделяют, промывают теплым мыльным раствором, затем проточной и дистиллированной водой и помещают в стеклянный бюкс с притертой крышкой. Готовят 0,8% раствор AgO₃ (азотнокислого серебра) и проводят стерилизацию в два этапа. Вначале заливают ягоды этим раствором на 8-10 минут. Затем раствор сливают, ягоды подсушивают промокательной бумагой и выделяют семяпочки, которые на самое оптимальное время - 5 минут также заливают этим раствором. Раствор сливают и бюкс с семяпочками переносят в бокс ("операционную"). В боксе семяпочки промывают тремя порциями стерильной дистиллированной воды. После этого семяпочки высаживают каждую в отдельную пробирку на твердую питательную среду Уайта. Культивирование семяпочек осуществляют в культуральной комнате при температуре 25-27°С, 16-ти часовом световом дне и интенсивности освещения 4-5 тысяч люкс. Регулярно проводят наблюдения за состоянием семяпочек и удаляют инфицированные.

Эффективность различных способов ступенчатой стерилизации семяпочек, полученных при самоопылении бессемянных сортов винограда, отражена в таблице 1.

Как следует из приведенных данных, обработка ягод 10,0% раствором гипохлорита кальция и натрия с последующей обработкой извлеченных семяпочек в растворе гипохлорита кальция или обжигом их в пламени горелки после опускания на 1 секунду в раствор 96,0% спирта не дает положительного результата. Инфицирование семяпочек составляет 78,6-100%. Не отмечено снижения инфицирования при обработке ягод раствором 0,8% AgNO₃ с последующим обжигом семяпочек в пламени горелки. Лишь при непосредственной обработке семяпочек раствором 0,8% AgNO₃ происходит существенное улучшение стерилизации. Гибель семяпочек от инфекции уменьшается до 17,8% при предварительной обработке ягод 10.0% раствором гипохлорита кальция и до 6,5-8,5% при предварительной обработке ягод также 0,8% раствором AgNO₃.

Таким образом, обработка ягод и выделенных из них семяпочек 0,8% раствором AgNO₃ обеспечивает улучшение стерилизации, которое выражается в снижении инфицирования семяпочек до минимальных размеров.

В таблице 2 представлены результаты различной стерилизации гибридных семяпочек, полученных от скрещивания бессемянных сортов винограда с бессемянными. Также, как и при различных способах обработки семяпочек, полученных от самоопыления, неэффективной оказалась стерилизация ягод и семяпочек раствором гипохлорита кальция. Отмечена 100% гибель от инфекции. Несколько лучше получены результаты при обработке ягод раствором гипохлорита кальция, а семяпочек раствором AgNO₃ или при обжиге их в пламени горелки, но гибель семяпочек от инфекции оставалась очень высокой. Более эффективным оказалось применение для обработки ягод раствора гипохлорита натрия с последующим обжиганием семяпочек в пламени горелки, а также гипохлорита кальция с последующей более продолжительной обработкой раствором азотнокислого серебра. Гибель семяпочек от инфицирования снизилась, но еще оставалась очень высокой - 32,1-39,3%. И лишь двукратная обработка ягод и семяпочек раствором AgNO₃ практически свела на нет гибель семяпочек от инфекции.

Стерилизация семяпочек, полученных от самоопыления бессемянных сортов винограда, и семяпочек, полученных от скрещивания бессемянных сортов винограда с бессемянными сортами, осуществляемая в два этапа, существенно уменьшает их инфицирование, в результате чего повышается эффективность селекционной работы.

В таблице 3 представлены результаты, касающиеся влияния дезинфектанта на инфицирование семяпочек после высадки их на питательную среду.

В таблице 4 представлены результаты, касающиеся влияния способа стерилизации на инфицирование семяпочек винограда после высадки их на питательную среду.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам стерилизации плодов и семяпочек. Стерилизацию проводят в два этапа 0,8% раствором азотнокислого серебра. В начале обрабатывают плоды в течение 8-10 минут, а затем выделенные из них семяпочки в течение 5-6 минут. Это обеспечивает снижение инфицирования семяпочек при вводе их в культуру in vitro и в результате этого повышение эффективности селекционной работы. 4 табл.

Способ стерилизации семяпочек, включающий отделение плодов, промывание их, стерилизацию, отличающийся тем, что стерилизацию осуществляют в два этапа 0,8% раствором азотно-кислого серебра, при этом вначале обрабатывают плоды в течение 8-10 мин, затем выделенные из них семяпочки в течение 5-6 мин.