ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГОМОЛОГИЧНОГО ИЛИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩАЯ СТАБИЛЬНЫЙ МУТАНТНЫЙ ШТАММ VIBRIO CHOLERAE Российский патент 2005 года по МПК C12N1/21 C12N15/09 C12N1/21 C12R1/63 

Настоящее изобретение относится к способу получения thyA^- штаммов Vibrio cholerae, к таким штаммам, и к их применению. Данное изобретение в частности относится к штамму Vibrio cholerae, который был лишен своего thyA гена в хромосоме, т.е. Δ thyA штамму, утратившему функциональность по thyA гену. Этот штамм может включать один или несколько эписомальных, автономно реплицирующихся элементов ДНК, таких как плазмиды, необязательно имеющие чужой, напр., Е. coli, функциональный thyA ген, который дает возможность штамму расти в отсутствие тимина в культуральной среде, и необязательно имеющие структурный ген, кодирующий гомологичный или гетерологичный белок. Далее данное изобретение относится к thyA нуклеотидным последовательностям и белкам, которые кодируются ими, и к вакцине, включающей в качестве иммунизирующего компонента Δ thyA штамм Vibrio cholerae данного изобретения, или А^- штамм V. cholerae, полученный по способу данного изобретения.

Предпосылки создания изобретения

Экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных хозяевах наиболее часто достигается путем введения в бактерию-хозяин эписомальных самореплицирующихся элементов (напр., плазмид), которые кодируют структурный ген интересующего белка под контролем соответствующего промотера. Такие плазмиды наиболее часто сохраняют путем введения селективных маркерных генов, кодирующих белки, которые обеспечивают устойчивость к определенным антибиотикам (таким как ампициллин, хлорамфеникол, канамицин, тетрациклин и т.д.). Затем их сохраняют в хозяине путем добавления соответствующего антибиотика к культуральной среде.

Для стабильной сохранности плазмид в штаммах хозяина часто требуется добавление соответственно выбранных антибиотиков, без которых они могут расщепляться, являясь источником значительного количества клеток в любой культуре, которые лишены плазмиды и следовательно не могут экспрессировать целевой продукт.

Однако, применение антибиотиков при получении рекомбинантных белков не желательно по ряду причин. Кроме очевидного увеличения затрат, вызванных необходимостью добавок в культуральную среду, применение антибиотиков создает проблему при получении любого рекомбинантного белка, предназначенного для использования для человека или в ветеринарии. Это происходит прежде всего по трем причинам. Во-первых, остаточные антибиотики могут вызывать тяжелые аллергические реакции у чувствительных индивидуумов. Во-вторых, существует возможность селекции бактерий, резистентных к антибиотикам в природной бактериальной флоре у тех индивидуумов, которые используют продукт, и, наконец, ДНК, кодирующая резистентность к антибиотикам, также может переноситься к чувствительным бактериям у индивидуумов, использующих продукт, таким образом, также перенося нежелательную резистентность к антибиотикам на всю когорту.

Уже существуют изобретения, которые касаются этой проблемы, одним из которых является par ген, который эффективно убивает все клетки, которые не удерживают копию плазмиды после каждого деления клеток [1].

Другая патентная заявка [2], касающаяся описанного здесь изобретения, основывается на установлении последовательности thyA ДНК у Е. coli. Авторы вводили ген thyA в плазмиду, однако использовали штаммы хозяина, являющиеся спонтанными thyA^- мутантами, выбранными на основе резистентности к триметоприму. Такие мутанты не очень хорошо определяются (поскольку несут точечные мутации или небольшие делеции) и могут трансформироваться в дикий тип (то есть thyA⁺) в неприемлемо высоких количествах. Это может приводить к тому, что бактерия-хозяин может удалять плазмиду и, следовательно, утрачивать или не обеспечивать последовательное и надежное получение рекомбинантного продукта. Дополнительной проблемой селекции с применением триметоприма является вероятность возникновения приобретенной тиминовой зависимости вследствие мутации гена дигидрофолатредуктазы (fol А), который в результате не является комплементарным thyA гену [3], который несет плазмида. Данная патентная заявка была отозвана по крайней мере, в Европе.

Было продемонстрировано, что применение V. cholerae имеет преимущества для экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с другими прокариотическими системами экспрессии при обычном применении, при котором рекомбинантные продукты могут продуцироваться в больших количествах и секретироваться в культуральную среду, облегчая таким образом последующие процедуры очистки. Это в противоположность Е. coli, где продукт часто собирается в периплазматическом пространстве [4]. Одним из важных факторов, наделяющих V. cholerae этим свойством, является наличие eps генов в V. cholerae [5].

Тимидилатсинтетаза, которая кодируется thyA геном Esherichia coli и других бактерий, катализирует метилирование дезоксиуридилата (dUMP) с образованием дезокситимидилата (dTMP) и является необходимым ферментом биосинтеза дезоксириботимидин трифосфата (dTTP) для включения в ДНК. В отсутствие этого фермента бактерия становится зависимой от внешнего источника тимина, который включается в dTTP посредством реутилизационного пути, который кодируют deo гены [6].

Спонтанные мутанты, которые являются thyA^-, могут быть легко выделены на основе резистентности к триметоприму. Этот антибиотик ингибирует регенерацию тетрагидрофолата из дигидрофолата, продуцируемого в катализируемом тимидилатсинтетазой синтезе dTMP. Таким образом, если клетки являются thyA^-, то они становятся тимидин-зависимыми, но не истощают более тетрагидрофолатный пул в присутствии триметоприма.

Описание изобретения

Настоящее изобретение в его различных аспектах основано на новой нуклеотидной последовательности thyA гена Vibrio cholerae. Полезным применением thyA гена является, например, сохранение рекомбинантных плазмид, использующихся для гиперпродукции рекомбинантных белков в V. cholerae, и использование последовательности для вставки чужих генов в хромосому V. cholerae отбирающим и сайт-специфичным способом.

Один аспект данного изобретения направлен на способ получения thyA^- штамма Vibrio cholerae, включающий стадию направленного мутагенеза в хромосоме V. cholerae для делеции и/или вставки генных нуклеотидов в локусе thyA гена, имеющем по существу нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, фиг.1.

В данном описании и формуле подразумевается, что выражение "имеющий по существу нуклеотидную последовательность" включает нуклеотидные последовательности, которые имеют некоторые природные или неприродные нуклеотидные расширения, усечения, делеции или дополнения, которые не препятствуют природной функции нуклеотидной последовательности, о которой идет речь.

Другой аспект данного изобретения направлен на thyA^- штамм Vibrio cholerae, который представляет собой Δ thyA штамм, утративший функциональность thyA гена.

В воплощении этого аспекта данного изобретения Δ thyA штамм V. cholerae включает один или несколько эписомальных автономно реплицирующихся ДНК элементов, имеющих функциональный thyA ген, который делает возможным рост штамма в отсутствие тимина в культуральной среде.

В предпочтительном воплощении эписомальным, автономно реплицирующимся ДНК элементом является плазмида.

В другом предпочтительном воплощении Δ thyA штамм в соответствии с данным изобретением включает эписомальный автономно реплицирующийся ДНК элемент, особенно плазмиду, чужой thyA ген, такой как ген Е. coli.

В особенно предпочтительном воплощении этого аспекта данного изобретения Δ thyA штамм в соответствии с данным изобретением включает в одном или нескольких эписомальных автономно реплицирующихся ДНК элементах, особенно плазмидах, в дополнение к чужеродному thyA гену, такому как ген Е. coli, также структурный ген, кодирующий гомологичный или геторологичный белок, такой как неустойчивую к нагреванию В-субъединицу энтеротоксина Escherichia coli (LTB), или белок глутатион S-трансферазу Schistosoma japonicum (GST 26 kD) массой 26 кДа.

Третий аспект данного изобретения направлен на нуклеотидную последовательность 5'-фланкирующей области структурного thyA гена Vibrio cholerae, имеющего по существу нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, фиг.2.

Четвертый аспект данного изобретения направлен на нуклеотидную последовательность 3'-фланкирующей области структурного thyA гена Vibrio cholerae, имеющего по существу нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, фиг.3.

Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1 используется для вставки чужеродных генов в хромосому V. cholerae селективным и сайт-специфичным способом, и для направленного мутагенеза при получении thyA^- штаммов Vibrio cholerae.

Пятый аспект данного изобретения направлен на белок, который кодируется нуклеотидной последовательностью thyA гена Vibrio cholerae в соответствии с данным изобретением, такой как белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, фиг.4.

Шестой аспект данного изобретения направлен на белок, который кодируется нуклеотидной последовательностью 5'-фланкирующей области структурного thyA гена Vibrio cholerae в соответствии с данным изобретением, такой как белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, фиг.5.

Каждый из белков в соответствии с пятым и шестым аспектом данного изобретения может использоваться для исследовательских целей, кроме того, они являются потенциальными мишенями для антимикробной терапии.

Седьмой аспект данного изобретения направлен на вакцину, включающую в качестве иммунизирующего компонента Δ thyA штамм Vibrio cholerae в соответствии с данным изобретением или thyA^- штамм Vibrio cholerae, полученный по способу данного изобретения. Эта вакцина может использоваться для профилактического и терапевтического лечения холеры и необязательно других инфекционных заболеваний, особенно в случаях, когда используемый штамм был сконструирован для экспрессии чужих белков. Эта вакцина в дополнение к иммунизирующему компоненту (компонентам) будет включать носитель лекарства, такой как физиологический солевой раствор, и другие компоненты, часто использующиеся в вакцинах, такие как буферы и адъюванты. Применяющиеся носители для лекарств, буферы, адъюванты и другие компоненты раскрыты, напр., в European and US Pharmacopoeia.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 демонстрирует нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 thyA гена Vibrio cholerae.

Фигура 2 демонстрирует нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 5'-фланкирующей области структурного thyA гена Vibrio cholerae.

Фигура 3 демонстрирует нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 3'-фланкирующей области структурного thyA гена Vibrio cholerae.

Фигура 4 демонстрирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 белка, кодируемого структурным thyA геном Vibrio cholerae.

Фигура 5 демонстрирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 белка, кодируемого 5'-фланкирующей областью структурного thyA гена Vibrio cholerae.

Фигура 6 демонстрирует клонирование EcoRI/HindIII фрагмента, содержащего thyA ген V. cholerae в pUC19.

Фигура 7 демонстрирует сравнение продуктов thyA гена из Е. coli [16], V. cholerae и Н. influenzae [17], показывая высокую степень гомологии между V. cholerae и Н. influenzae по сравнению с Е. coli.

Фигура 8 демонстрирует вставку Kan^R-устойчивого блока генов в PstI сайт thyA гена V. cholerae в pUC19.

Фигура 9 демонстрирует ПЦР для генерации thyA-Kan фрагмента с XbaI концами.

Фигура 10 демонстрирует лигирование thyA-Kan фрагмента с Xbal концами в плазмиде pNQ705.

Фигура 11 демонстрирует частичную делецию thyA гена и начало Кап гена в pNEB193.

Фигура 12 демонстрирует Xbal расщепление для вырезания ΔthyA Δkan гена из pNEB193, лигирование рDМ4 по рестрикционному Xbal.

Фигура 13 демонстрирует в общих чертах стратегию полной делеции thyA гена V. cholerae.

Фигура 14 демонстрирует вставку 5' области выше thyA в pMT-SUICIDE 1; образование рМТ с 5 прим.

Фигура 15 демонстрирует вставку 3' области ниже thyA в рМТ с 5 прайм; образование рМТ ΔthyA V. cholerae.

Фигура 16 демонстрирует экспрессионный вектор рМТ-eltB(thyA), использующийся для экспрессии LTB в V. cholerae JS1569 ΔthyA.

Фигура 17 демонстрирует экспрессионный вектор рМТ-GST(thyA), использующийся для экспрессии GST в V. cholerae JS1569 ΔthyA.

Описание экспериментов

Применяемая стратегия

Для получения определенных thyA мутантов V. cholerae, которые могут быть использованы в качестве подходящих штаммов для продукции рекомбинантных белков, кодируемых на плазмидах, поддерживаемых thyA комплементацией, вначале необходимо клонировать и характеризовать ген дикого типа и его 5' и 3' фланкирующие области. Стратегия авторов состояла в том, чтобы вначале клонировать thyA ген V. cholerae на плазмиде, на основе комплементации thyA ауксотрофии в штамме Е. coli K12. Для определения местонахождения thyA структурного гена на полученном вначале большом фрагменте ДНК были проведены рестрикционный анализ и эксперименты по субклонированию. Затем проводили секвенирование соответствующей области, содержащей thyA ген и его 5' и 3' фланкирующие области.

Для подтверждения того, что один из секвенированных генов действительно является thyA геном V. cholerae, были проведены гомологичные сравнения с thyA последовательностями из других организмов. Клонированный ген также мог дополнять thyA фенотип мутантного штамма V. cholerae, который был выбран на основе устойчивости к триметоприму. Анализ последовательностей этого мутанта показал, что он действительно имеет единичную замену основания в гене, который авторы идентифицировали как thyA, что приводит к образованию стоп-кодона, дающего нефункциональный укороченный генный продукт.

Знание последовательности thyA и окружающей его области позволяет использовать подходящие векторы-"самоубийцы" для направленного мутагенеза. Рассматриваемыми стратегиями являются: (а) инактивация вставкой, (b) комбинация инактивации вставкой и делеции гена, и (с) удаление целого гена:

(а) Инициацию вставкой thyA гена достигают путем вставки Kan^R генного блока (с вектором-"самоубийцей" pNQ705 [14]).

(b) В штамме, несущем Kan^R генный блок, производили делецию приблизительно 400 пн (пар нуклеотидов), при этом удаляли каждые 200 пн из thyA гена выше сайта встраивания и из гена устойчивости к канамицину, который таким образом инактивировался. Таким образом авторы получали thyA ген, в котором была произведена делеция в центральной части гена, которая сопровождалась вставкой некодирующей области ДНК. Эту конструкцию вставляли в хромосому V. cholerae, используя вектор-"самоубийцу" рDМ4, получая в результате штамм, названный JS1569 ΔthyAΔKan.

(c) Полное удаление thyA гена производят путем лигирования вместе фланкирующих областей структурного гена, так, чтобы не разорвать другие открытые рамки считывания (разрыв соседнего lgt гена также является летальным). ДНК, несущую делецию, клонируют в новом векторе-"самоубийце" (PMT-SUICIDE-1), использующемся для вставки этой последовательности в хромосому V. cholerae. Полученный штамм называется JS1569 ΔthyA.

Для экспрессии рекомбинантных генов в этих ΔthyA штаммах V. cholerae конструируют два экспрессионных вектора. Каждый состоит из thyA гена Е. coli, точки начала репликации многокопийного вектора pUC19 общего предназначения, tac-промотера и rho-независимого trpA терминатора транскрипции. В один из двух векторов вставляют lacI^g ген для того, чтобы регулировать экспрессию от tac-промотера, который также содержит последовательность lac оператора.

Два гена были клонированы в эти плазмиды и экспрессировались во вновь образованном штамме V. cholerae с делецией thyA; JS1569ΔthyA. Первый кодирует В субъединицу неустойчивого к нагреванию человеческого энтеротоксина из Е. coli (LTB) (фигура 16), второй - sj26 глутатион-S-трансферазу (GST) из Schistosoma japonicum (фигура 17).

LTB подобен по структуре В субъединице холерного токсина, естественно продуцируемого штаммом хозяина, и секретируется в культуральную среду. Другой белок имеет эукариотическое происхождение, из Asian Liver Fluke. Известно, что sj26 GST экс-прессируется на высоких уровнях в Е. coli и накапливается в цитоплазме. Экспрессию двух рекомбинантных белков оценивают на основании GM1 ELISA теста культурального супернатанта в случае LTB и коммерчески доступного анализа в случае GST. Оба белка анализировали с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга.

Происхождение thyA гена

thyA ген клонируют из штамма V. cholerae JS1569. Этот штамм происходит из штамма Inaba 569B V. cholerae классического биотипа (АТСС №25870). Этот штамм имеет делецию в ctxA гене [7] и был сконструирован устойчивым к рифампицину [8].

Клонирование 1,4 kB (тысяч пар нуклеотидов) HindIII/EcoRI фрагмента, охватывающего thyA ген V. Cholerae.

Хромосомную ДНК, полученную по способу СТАВ [9], подвергают полному расщеплению с помощью рестрикционного фермента HindIII.

Обработанную ДНК лигируют в универсальную векторную плазмиду pBR322 (New England Biolabs Inc. Beverly, MA USA), которую подвергали расщеплению с помощью HindIII и обрабатывали щелочной фосфатазой.

Лигированную смесь вводят с помощью электропорации [10] в штамм Е. coli HB101, который фенотипически является ThyA^- (выбранный на основе устойчивости к триметоприму), и культуру помещают на модифицированные Syncase (MS) агарные планшеты [11] с дополнением 50 мкг/мл ампициллина, но не содержащие тимина. Так, оба трансформанта отбирают на основе приобретения плазмиды и присутствия функционального thyA гена.

Выращенные колонии расштриховывают до единичных колоний на агарных планшетах такого же типа и затем выращивают в MS среде, дополненной ампициллином. Плазмидную ДНК получают посредством "Wizard miniprepps (ProMega Corp. Madison Wis.) и обрабатывают HindIII. Выделяют фрагмент величиной приблизительно 10-12 kB, этот клон называют ThyA B2.

Для уменьшения размера фрагмента плазмиду разрезают с помощью EcoRI и подвергают повторному лигированию с помощью Т4 лигазы. Лигированную ДНК снова вводят с помощью электропорации в описанный выше штамм Е. coli, и для роста трансформантов используют такие же селекционные условия.

Колонии, полученные в этом эксперименте, выделяют, как описано выше, и плазмидную ДНК очищают и анализируют путем двойного расщепления с помощью EcoRI и HindIII. Остается фрагмент ДНК величиной приблизительно 1,4 kB, который сохраняет способность дополнять thyA мутацию в штамме-хозяине Е. coli. Этот фрагмент клонируют в плазмиде pUC19 (New England Biolabs), которую расщепляют с помощью тех же двух ферментов и обрабатывают щелочной фосфатазой. После электропорации трансформанты в этом эксперименте выделяют и характеризуют, как описано выше. Этот клон называют ThyA 1:2 (фигура 6).

Подтверждение того, что 1,4 kB HindIII/EcoRI фрагмент содержит thyA ген

Саузерн-блоттинг. Для подтверждения того, что клонируемый фрагмент действительно имеет хромосомное происхождение V. cholerae, ДНК из штамма JS1569 подвергают полному расщеплению под действием HindIII и EcoRI и HindIII. Фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза на агарозе вместе с обработанным HindIII клоном ThyA B2 и обработанным EcoRI и HindIII клоном ThyA 1:2.

После электрофореза ДНК переносят на нейлоновую мембрану, иммобилизуют с помощью УФ излучения и гибридизуют (в строгих условиях) с 1,5 kB фрагментом, вырезанным из клона ThyA 1:2, который был помечен ³²Р dCTP с помощью набора Amershams Multi-prime.

Результаты. Как в обработанной HindIII хромосомальной ДНК, так и в обработанном HindIII клоне ThyA B2, была ясно видна полоса, соответствующая 10 kB. Также в хромосомальной ДНК, обработанной EcoRI/HindIII и в плазмидной ДНК клона ThyA 1:2, была ясно видна полоса, соответствующая 1,4 kB (данные не показаны). Эти данные демонстрируют, что клонируемый фрагмент происходит из ДНК V. cholerae JS1569.

Трансформация JS1569 ThyA^- плазмидой ThyA 1:2

Для подтверждения того, что 1,4 kB клонированный EcoRI/HindIII фрагмент может поддерживать рост фенотипически ThyA^- V. cholerae, в тимин-зависимый мутант JS1569 (V. cholerae JS1569 4.4) вводят посредством электропорации плазмиду ThyA 1:2. Электропорация и селекционная среда были такими, как описано выше. JS1569 4.4 не растет на MS среде без добавления тимина.

Результаты. Выделяли колонии JS1569 4.4, которые росли в отсутствие тимина. Было показано, что все они несут ThyA 1:2 плазмиду, что подтверждает предположение, что клонируемый фрагмент содержится в thyA гене V. cholerae.

Секвенирование ДНК плазмиды ThyA 1:2. Плазмидную ДНК секвенировали с помощью метода цепной дидезокси терминации [12], используя ABI PRISM^тм DYE набор для секвенирования с циклическим терминированием (Perkin Elmer). Используют как коммерчески доступные, так и сделанные с помощью традиционных методов праймеры. Данные анализировали с помощью модуля AutoAssembler Software package, последовательности ДНК анализировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 373 (Perkin Elmer). Анализ гомологии с установленной последовательностью ДНК проводили с помощью GCG программы [13].

Результаты. Наилучшая степень гомологии наблюдалась с тимидилатсинтетазой из различных видов. Причем гомогология с тимидилатсинтетазой Е. coli была довольно слабой (фигура 7).

Стратегия делеции thyA гена в V. cholerae JS1569.

Для получения определенных thyA мутантов V. cholerae JS1569 используют две различные стратегии, первая включает инактивацию thyA гена путем вставки Kan^R генного блока с последующей частичной делецией thyA гена и Kan^R генного блока. Вторая стратегия направлена на полную делецию thyA гена из хромосомы посредством нового вектора-"самоубийцы" рМТ SUICIDE-1. Этот вектор содержит 5' и 3' фланкирующие области thyA гена, а также R6K точку начала репликации и RP4 mob гены.

Для замены thyA гена штамма JS1569 авторы решили использовать уже тимин-зависимый JS1569 4.4, так как предварительные эксперименты показали, что наносится значительный ущерб при селекции от дикого типа до тимин-зависимого, даже в присутствии высоких уровней экзогенного тимина.

Инактивация thyA гена путем вставки Кап^R генного блока

Наша стратегия включает инактивацию thyA гена путем вставки гена устойчивости к канамицину в уникальный PstI сайт в thyA гене в виде Kan^R генного блока (Pharmacia) (фигура 8). Эту конструкцию амплификацируют с помощью ПЦР (Expand^ТМHigh Fidelity ПЦР system Boehringer Mannheim) с использованием праймеров, которые включают Xbal концы, так, что она может быть перенесена в плазмиду-"самоубийцу" pNQ705 [14], которая несет уникальный Xbal сайт и ген устойчивости к хлорамфениколу.

Для амплификации методом ПЦР инактивированного вставкой гена используют следующие праймеры:

ThyA-10: ^5'GCT СТА GAG CCT TAG AAG GCG TGG TTC^3'
соответствующий основаниям 557-575 в SEQ ID NO: 2 (фигура 2)
с добавлением сайта Xbal (жирным шрифтом)
и
ThyA-11: ^5'GCT СТА GAG СТА CGG TCT TGA TTT ACG GTA Т^3'
соответствующий последовательности, комплементарной основаниям 235-257 в SEQ ID NO: 2 (фигура 3) с добавлением сайта Xbal (жирным шрифтом) (фигура 9+10).

Полученную плазмиду затем переносят в Е. coli S-17, которая используется в конъюгационных экспериментах.

Так как реципиентный штамм JS1569 4.4 является устойчивым к рифампицину и чувствительным к хлорамфениколу, а донорный штамм Е. coli S-17 является устойчивым и к хлорамфениколу, и к канамицину, трансконъюганты выбирают путем селекции устойчивости как к рифампицину, так и к канамицину.

Полученные штаммы V. cholerae однако должны быть также устойчивыми к хлорамфениколу, так как целая плазмида вначале должна быть введена в хромосому.

Эксконъюганты, у которых инактивированный thyA ген, несущий Kan^R генный блок, включен в хромосому, и которые лишены плазмиды pNQ705, могут быть затем выбраны среди тех, которые являются хлорамфеникол-чувствительными, но остаются канамицин-устойчивыми.

Для подтверждения вставки гена устойчивости к канамицину в thyA ген, весь thyA ген подвергали амплификации методом ПЦР с использованием праймеров ThyA-10 и ThyA-11, и размер полученного фрагмента сравнивали с размером нативного thyA гена. Было обнаружено, что ожидаемый thyA фрагмент составляет 2,6 kb по сравнению с нативным thyA геном величиной 1,4 kb.

Результаты. Было показано, что эксконъюганты являются канамицин-устойчивыми, хлорамфеникол-чувствительными, и при амплификации методом ПЦР имеют включенный в хромосому генный блок устойчивости к канамицину. Секвенирование амплифицированного фрагмента показало, что имеет место единственный дефект в гене из-за вставки канамицинового гена. Это показывает, что из рекомбинации, которая имеет включенный в хромосому инактивированный вставкой ген, изъята точковая мутация, которая делает реципиентный штамм (JS1569 4.4) тимин-зависимым. Рост полученного штамма наблюдается только в том случае, если культуральная среда дополнена тимином (200 мкг/мл).

Частичная делеция thyA гена и Kan^R генного блока

Для дополнительной гарантии необратимости thyA мутации, инактивированный вставкой thyA субклонируют в виде XbaI фрагмента в pNEB 193 (New England Biolabs). ПЦР праймеры конструируют так, чтобы удалить 209 пар оснований из thyA гена и удалить 261 пару оснований из Kan^R генного блока.

Таким образом, thyA ген дополнительно разрывают так, что ген устойчивости к канамицину также инактивируется (в результате удаления начала кодирующей области). Общим результатом этой процедуры является штамм, несущий делеционный thyA ген, также содержащий вставку некодирующей ДНК.

ThyA-14: ⁵GGG GGC TCG AGG GGC АСА ТСА CAT GAA³ThyA-15: ⁵CCC CCC TCG AGC GCC AGA GTT GTT TCT GAA³Буквы, отмеченные жирным шрифтом, обозначают сайты расщепленияXhoI (фигура 11).

После амплификации методом ПЦР получают фрагмент ДНК, охватывающий всю плазмиду за исключением удаленной области. Амплифицированную ДНК подвергают расщеплению с помощью XhoI, проводят самолигирование и трансформируют в Е. coli HB101. Колонии отбирают на плашках, содержащих ампициллин. Индивидуальные колонии отбирают и расштриховывают. Небольшие препараты плазмид из индивидуальных колоний дают ожидаемые модели рестрикции при анализе с помощью рестрикционных ферментов XbaI, XhoI, HindIII и RsaI.

Неполный thyA ген, несущий инактивированный ген устойчивости к канамицину, вырезают из вектора путем Xbal расщепления, очищают и лигируют в pDM4 [15] (фигура 12). PDM4 является вектором-"сомоубийцей", полученным из pNQ705, содержащего SacBR ген из Bacillus subtilis и модифицированный сайт мультиклонирования.

После переноса pDM4 (ΔthyAΔKan) плазмиды в штамм Е. coli S-17 проводят трансконъюгационный эксперимент. В это время полученный выше штамм V. colerae JS1569 thyAKan используют в качестве реципиентного штамма.

Спаривание проводят как описано выше с селекцией по рифампицину и хлорамфениколу. После роста в этой среде колонии отбирают на среде, содержащей 10% сахарозы в отсутствие хлорамфеникола. Сахароза индуцирует sacBR ген, который кодирует левансукразу, которая превращает сахарозу в леван. Это соединение является токсичным для многих грам-отрицательных организмов. Таким образом, клоны, еще несущие плазмиду-"самоубийцу", убиваются живыми эксконъюгантами, которые утратили плазмиду.

Результаты. Была выбрана чувствительная к хлорамфениколу и канамицину колония. Амплификация методом ПЦР thyA области с использованием праймеров ThyA-10 и ThyA-11 подтверждает, что thyAKan фрагмент (2,6 kb) на хромосоме был заменен на фрагмент ΔthyAΔKan (2,1 kb).

Рост полученного штамма наблюдается только в том случае, если культуральная среда дополнена тимином (200 мкг/мл). Этот штамм был назван V. cholerae JS1569 ΔthyAΔKan.

Направленная делеция thyA гена в V. cholerae

Для этого подхода используют 5' и 3' последовательности, фланкирующие thyA ген. Конструируют новый вектор-"самоубийцу", рМТ SUICIDE-1 (фиг.14), который содержит R6K точку начала репликации, mob гены из RP4, ген устойчивости к хлорамфениколу и сайт для мультиклонирования из Litmus 28 (New England Biolabs). В результате конструируют модифицированный фрагмент, в котором thyA кодирующая область заменена на сайт для мультиклонирования (полученный из Litmus 28), оставляя только 5' и 3' область thyA локуса из V. cholerae. Полученную плазмиду используют для получения штамма V. cholerae, из которого полностью удален thyA ген.

В качестве исходного материала для этой конструкции используют рМТ SUICIDE-1 плазмиду (М. Lebens, неопубликованное).

Из 5' и 3' областей thyA локуса были конструированы следующие ПЦР праймеры:

ThyA-33: ⁵GGA СТА GTG GGT TTC CTT TTT GCT AT³соответствующий основаниям 109-126 в SEQ ID NO: 2 (фигура 2)(5' область thyA области) с Spel сайтом (выделено жирным шрифтом)иThyA-34: ⁵CCC CGC TCG AGA CCC TAT TTT GCT GCT АС³соответствующий последовательности, комплементарной основаниям815-832 в SEQ ID NO: 2 с присоединенным к нему сайтом XhoI(выделено жирным шрифтом).Эта пара праймеров дает ПЦР фрагмент из 743 оснований, соответствующий 5' фланкирующей области thyA гена.

ThyA-31: ⁵CGG GGT ACC TGG CTT GAT GGG TTT TAT³соответствующий основаниям 22-39 в SEQ ID NO:3 (фигура 3) (3' область thyA области) с kpnI сайтом (выделено жирным шрифтом)иThyA-32: ⁵GAA GGC CTT CGC CTC TGC TTG CGA CT³

соответствующий последовательности, комплементарной основаниям
731-749 в SEQ ID NO:3 с сайтом StuI (выделено жирным шрифтом).
Эта пара праймеров дает ПЦР фрагмент из 746 оснований, соответствующий 3' фланкирующей области thyA гена.

В качестве матрицы для ПЦР реакций используют препарат ДНК из V. cholerae JS1569 (фигура 13).

Амплифицированную ДНК подвергают расщеплению под действием соответствующих рестрикционных ферментов и клонируют в рМТ SUICIDE-1 векторе (фигуры 14 и 15), с выходом плазмиды pMTΔthyA V. cholerae, которая содержит приблизительно 700 пар оснований 5' области выше thyA гена и такое же количество пар оснований 3' области ниже thyA гена.

Эту плазмиду переносят в Е. coli S17-1 и используют в конъюгационных экспериментах, как описано выше. В качестве реципиента используют штамм V. cholerae JS1569 4.4. Спаривание проводят на LB агаре, дополненном рифампицином, хлорамфениколом и тимином. Эксконъюганты, которые утратили плазмиду-"самоубийцу" в хромосоме, отбирают на основе чувствительности к хлорамфениколу.

Результаты. Отбирают хлорамфеникол-чувствительную и рифампицин-устойчивую колонию. Амплификация методом ПЦР с использованием праймеров ThyA-10 и ThyA-11 thyA области приводит к получению фрагмента величиной 1,4 kb из нативного thyA гена и фрагмента величиной 0,6 kb из thyA гена. Это подтверждает, что thyA структурный ген на хромосоме был делетирован. Кроме того, бактерия была способна расти только в среде, дополненой тимином. Этот штамм называется V. cholerae JS1569 ΔthyA.

Экспрессия В субъединицы неустойчивого к нагреванию энтеротоксина из Е. coli (LTB) и sj26 глутатион-3-трансферазы (GST) из Schistosoma japonicum в V. cholerae JS1569 ΔthyA.

Конструируют два экспрессионных вектора, каждый состоит из thyA гена из Е. coli, точки начала репликации высококопийного вектора pUC19, tac промютора и rho-независимого trpA терминатора транскрипции. В один из двух векторов был вставлен lacI^q ген для регуляции экспрессии от tac промотора, который также содержит lac операторную последовательность (фигуры 16 и 17).

Экспрессия белка LTB в штамме V. cholerae JS1569 ΔthyA.

Экспрессионный вектор, показанный на фигуре 16, вводят с помощью электропорации в V. cholerae JS1569 ΔthyA. Селекцию трансформантов проводят на MS-агаре. Индивидуальные колонии выращивают для продуцирования мини-плазмидных препаратов, которые контролируют с помощью анализа с использованием рестрикционных ферментов. Для экспрессии трансформант выращивают в MS среде при 37°С в культуре при встряхивании. Культуральную среду собирают и анализируют на наличие LTB методом GM1-ELISA.

Результаты. Было обнаружено, что культура продуцирует приблизительно 300 мкг/мл LTB, как оценено с помощью GM1-ELISA. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг с использованием специфичных к LTB моноклональных антител дополнительно подтверждает, что секретируемым белком является LTB.

Экспрессия белка GST в штамме V. cholerae JS1569 ΔthyA

sj26 глутатион-S-трансферазе (GST) из Schistosoma japonicum клонируют в экспрессионном векторе, показанном на фигуре 17. Этот вектор является идентичным первому за исключением последовательности lacI^q гена. lacI^q дает возможность контролировать экспрессию рекомбинантных белков. Этот вектор вводят с помощью электропорации в V. cholerae JS1569 ΔthyA. Селекцию трансформантов проводят на MS-агаре. Индивидуальные колонии выращивают для продуцирования мини-плазмидных препаратов, которые контролируют с помощью анализа с использованием рестрикционных ферментов. Для экспрессии трансформант выращивают в MS среде при 37°С в культуре при встряхивании с добавлением IPTG.

Результаты. В цитоплазме бактерии V. cholerae был обнаружен рекомбинантный белок. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг с использованием специфичных к GST моноклональных антител (Pharmacia BioTech, Uppsala) подтверждает, что экспрессируется GST. Уровень экспресии для GST труднее определять, чем для LTB, так как этот белок экспрессируется внутриклеточно, но считается, что он находится в том же интервале, что и для LTB.

Ссылки

1. Molin, S., К.A.Gerdes. 1984. Stabilized plasmids. US Patent 4,760,022.

2. Morona, R., and S.R.Attridge. 1987. Non-antibiotic marker system. EPC-A- 0251579.

3. Green, J.M., B.P.Nichols, and R.G.Matthews. 1996. Fotate biosynthesis, reduction and polyglutamylation. In: F.C.Neidhardt, R.Curtiss III, J.L.Ingraham, E.C.C.Lin, K.B.Low, B.Magasanik, W.S.Reznikoff, M.Riley, M.Schaechter and H.E.Umbarger (Eds.) Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. ASM Press Washington D.C. pp665-673.

4. Neill, R.J., B.E.Ivins, and R.K.Hotmes. 1983. Synthesis and secretion of the plasmid-coded heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in Vibrio cholerae. Science. 221: 289-290.

5. Sandkvist, M., M.Bagdasarian, S.P.Howard, and V.J.DiRita. 1995. Interaction between the autokinase EpsE and EpsL in the cytoplasmic membrane is required for extracellular secretion in Vibrio cholerae. ЕМВО J. 14:1664-1673.

6. Neuhard, J. and R.A.Kelln. 1996. Biosynthesis and conversions of pyrimidines. In: F.C.Neidhardt, R.Curtiss III, J.L.Ingraham, E.C.C.Lin, K.B.Low, B.Magasanik, W.S.Reznikoff, M.Riley, M.Schaechter and H.E.Umbarger (Eds.) Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. ASM Press Washington D.C. pp580-599.

7. Kaper, J.В., H.Lockman, M.M.Baldini, and M.M.Levine. 1984. A recombinant live oral cholera vaccine. Biotechnology 2:345-349.

8. Sanchez, J., and J.Holmgren. 1989. Recombinant system for overexpression of cholera toxin B subunit in Vibrio cholerae as a basis for vaccine development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:481-485.

9. Wilson, К. 1994. Preparation of genomic DNA from Bacteria. In Current protocols in Molecular Biology (F.A.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, and K.Struhl, eds.) pp.2.4.1-2.4.2 John Wiley & Sons, New York.

10. Sheen, J. 1994. High-efficency transformation by electroporation. In Current protocols in Molecular Biology (F.A.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, and K.Struhl, eds.) pp.1.8.4-1.8.5. John Wiley & Sons, New York.

11. Lebens, M., S.Johansson., J.Osek., M.Lindblad and J.Holmgren. 1993. Large-scale production of Vibrio cholerae toxin B subunits for use in oral vaccines. Biotechnology. 11:1574-1578.

12. Sanger, F., S.Nicklen, and A.R.Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467.

13. Program Manual for the Wisconsin Package. Version 8. September 1994. Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison Wisconsin.

14. Milton, D.L., A.Nordqvist, and H.Wolf-Watz. 1992. Cloning a metalloprotease gene involved in the virulence mechanism of Vibrio anguillarum J. Bacteriol. 174:7235-7244.

15. Milton, D.L., R.O'Toole, and H.Wolf-Watz. 1996. Flagcllin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum J.Bacteriol. 176:1310-1319.

16. Belfbrt, M., G.Maley, J.Pedersen-Lane and F.Maley. 1983. Primary tructure of the Escherichia coli thyA gene and its thymidylate synthase product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4914-4918.

17. Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O., Clayton, R.A., Kirkness, E.F., Kerlavage, A.R., Bult, C.J., Tomb, J.-F., Dougherty, B.A., Menick. J.M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fileds, C.A., Gocayne, J.D., Scott, J.D., Shirely, R., Liu, L.-I., Glodek, A., Kelley, J.M. Weidman, J.F., Phillips, C.A., Spriggs, Т., Hedblom, E., Cotton, M.D., Utterback, T.R., Hanna, М.С., Nguyen, D.Т., Saudek, D.M., Brandon, R.C., Fine, L.D., Fritchman, J.L., Fuhrmann, J.L., Geoghagen N.S.M., Gnehm, C.L., McDonald, L.A., Small, K.V., Fraser, C.M., Smith, H.O., and J.C.Venter. 1995. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae RD. Science 269:496-512.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медицине. Получен стабильный штамм Vibrio cholerae, не содержащий в хромосоме ген thyA и, таким образом, утративший функциональность гена thyA. Путем трансформации указанного штамма экспрессирующим вектором, содержащим функциональный ген thyA и ген, кодирующий гомологичный или гетерологичный белок, создана экспрессионная система для получения указанного гомологичного или гетерологичного белка. Применение изобретения позволяет повысить стабильность системы для экспрессии гомологичного или гетерологичного белка. 7 з.п. ф-лы, 17 ил.

1. Экспрессионная система, используемая для получения гомологичного или гетерологичного белка, содержащая стабильный штамм Vibrio cholerae, несущий экспрессирующий вектор, причем указанный стабильный штамм Vibrio cholerae представляет собой штамм Vibrio cholerae ΔthyA, не содержащий в хромосоме ген thyA и, таким образом, утративший функциональность гена thyA, а указанный экспрессирующий вектор содержит функциональный ген thyA и, по меньшей мере, один ген, кодирующий гомологичный или гетерологичный белок.2. Экспрессионная система по п.1, в которой стабильный штамм Vibrio cholerae лишен гена thyA, имеющего последовательность от нуклеотида 839 до нуклеотида 1690 в SEQ ID NO:1.3. Экспрессионная система по любому из предшествующих пунктов, в которой функциональный ген thyA в экспрессирующем векторе представляет собой ген thyA Е. coli.4. Экспрессионная система по любому из предшествующих пунктов, в которой гетерологичный белок представляет собой В-субъединицу термолабильного энтеротоксина Escherichia coli (LTB).5. Экспрессионная система по пп.1-3, в которой гетерологичный белок представляет собой белок глутатион-5-трансферазу Schistosoma japonicum массой 26 кДа (GST).6. Экспрессионная система по любому из предшествующих пунктов, в которой вектор представляет собой плазмиду.7. Экспрессионная система по любому из предшествующих пунктов, в которой штамм Vibrio cholerae ΔthyA лишен гена thyA путем сайт-направленного мутагенеза в хромосоме Vibrio cholerae для делеции и/или вставки нуклеотидов в локусе гена thyA.8. Экспрессионная система по любому из предшествующих пунктов, в которой хромосомный ген thyA имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или указанную нуклеотидную последовательность, содержащую какие-либо природные или искусственные нуклеотидные удлинения усечения, делеции или вставки, которые не влияют на природную функцию нуклеотидной последовательности.