Рекомбинантная плазмидная ДНК р1ЕМЗ, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий VIвRIо сноLеRае - продуцент В-субъединицы холерного токсина Советский патент 1991 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии.

Целью изобретения является получение более продуктивного продукта В-субьеди- ницы холерного токсина.

С помощью генетических методов сконструирована коньюгативная плазмида

р1ЕМ-3, представляющая собой коинтеграт плазмиды р1ЕМ-1 с плазмидой рСТ Д27. несущей клонированный ген vet В, детерминирующий синтез В-субьединицы холерного токсина, и в результате коньюгативного введения сконструированной плазмиды р1ЕМ-3 в клетки штамма Vibrio cholerae че01 группы создан штамм V. cholerae КМ93 не-01 группы, который является новым штаммом - продуцентом В-субьединицы холерного токсина.

Пример 1. Получение коньюгативной плазмиды р1ЕМЗ. несущей ген vet В(В-субь- едииицы холерного токсина).

Плазмиду рОХ38, являющуюся производной F-фактора. который утратил все из- вестные IS-.элементы, маркируют мини-транспозоном, несущим в своем составе ген резистентности к канамицину. Такой транспозон дефектен по транспозиции и другим рокомбинационным событиям, гнязанным с транспозонами. Другой по- движ(ый элемент IS1 вводят в ту же плаз- миду методом транспозиции. В результате сконструированная плазмида plEMI содержит маркер канамицинрезистентно- сти (Km ) и ISI-элемент, способный обеспечить образование коинтегратов с некомьюгативными плазмидами, содержащими клонированные гены.

Плазмиду plEMI совмещают с плазми- дой оСТ Л 27 (1), несущий ген vet В, в клетках штамма F.coM НВ101 pro leu recAr m . Попученные клоны используют в коньюга- ционных скрещиваниях в качестве доноров. Реципиентом используют штамм E.coli К12Р3478 polA. В клетках такого реципиента плазмида рСГ Д 27 может существовать только в составе коинтеграта, образованно- 10 за счет гранспозиционного акта ISI-зле- гиента, поскольку для ее репликации нeoбxoди l продукт ро1А-гена. Поэтому сре- ;1И отобранных Те Кгл клонов трансконью- гангоч и тамма Р3478 большинство тех, стерые унаеледовали рекомбинантную Плазмиду - коинтеграт двух плазмид plEMI и рСТ Л 27. Доказательетво слияния двух плазмид получают при следующих актах ко1ньюгационных скрещиваний, когда при отборе по одному из маркеров, например Тс . наследуется и нееелектируемый маркер Km практически в 100% случаев. Ре- ком 6nt-t а нтная плазмида, в которой обье.цииеш. две плазмиды - коньюгативная p EMI и неконъюгативная рСт Д27 с геном vet В. названа плазмидой piEM3. Она стабильно сохраняется в клетках Е. соИ К12 в виде коинтеграта.

Пример 2. Создание штамма V. cholerae КМ93 не-01 группы.

В клетки НАГ-8ибриона С197 коньюга- тивным путем вводят коинтегратную плаз- миду р1ЕМЗ, состоящую из двух плазмид рОХ38 (мчни-Кт) и рСТ A 27. Полученные i рансконыоганты вибриона, содержащие плачмиду р1Е МЗ, Km Тс , и продуцируют

В-субьединицу холерного токсина, что огтре- деляют реакцией т1Г)ееивного иг.мунного гемолиза на плотной среде (Pfli/lf).

Поскольку созданные трансконъю янты

V. cholei ae С197/р1ЕМЗ содержат литиь одну-две копии клонированного гена vet В.так как коинтеграт р1Е МЗ является малокопий ной плазмидой, то для увеличения Koni/iiirto сти генов vet Б с целью повьиненг я

0 продукции В-субъединицы, на втором Э|Тпе получают клоны вибриона Km ТС/, которые после разьединения двух репликонов рОХ38 мини-Кт и рСТД27 и /тр,9ть1 плгзми ды рОХЗВ мини-Кт и реТД27 и утраты плаз5 МИДЫ рОХЗВ мини-Ктт- содержат лишь многокопийную Плазмиду рС.Т Д27, содер жащую гены Тс и vet В, Один из таких

ор

Km Тс клонов, проявляющий устойчибость к повышенным концентрациям тетргэц(кли0 на (20-40 мкг/мл) и продуцирующий 10 М мкг/мл культуральной среды В-субьед.ини- цы холерного токсина, выбран в качестве штамма-продуцента этого белка и обозна чем V. cholerare КМ93 не--01 группы.

5Характеристика титамма КМ93. Ото

бранный штамм, получив1иий названиэ Vibrio choleraT e КМ93 не-01 группы, иселе дован на патогенные свойства Он не вир,/- лентен для крольчат-еосункоз е дозе

0 10-10 микробных клеток, не вызывает накопления жидкоети в Тонком кишячнике взрослого кролика.

Культурально-морфологические гтри- знаки шт;:мма КМ93 - подвижные грамотри5 цательные палочки. Штамм хорошо p.ciei на простых полноценных средах и средах е тетрациклином (20 мкг/мл) При посеве в жидкие ереды вызывает равномерное помутнение бульона. Для роста на минималь

0 ной среде нуж ается в добавлении аденина.

Не способен продуцировать гемолизин (hly ).

Физиологические свойства - относится

к I группе Хайберга. Не лизирует Зритроии

ты барана, где агглютинирует куриные зрит5 роциты. Чувствителен к полимиксину Резистентен к холерным диагностическим фагам С. зльтор. ХДФ 3. 4, 5. Чув Л ите.аем к фагу ТЭПВ 2. используемому для фатоти пирования энтеропзтотенных Н.АГ-вибрио

50 нов.

Пример 3. Определение продуктивности штамма V.cholerae КМ93 не-О г оуппы в отношении В-су6ьединиць холерного ток сина.

Высушенную ампульную культуру

штамма КМ93 высенают на агар Хотгингера

рН 7,6 содержащий 10 мкг/мл тетрацикл на и инкубируют 18 ч при 37°С. В качест.е

контроля используют исходный штамм V.

cholerae С197 ие-01 группм , j также V cholerae 569В в качестве эталонного штамма - продуцента холерното токсина.

Колонии штаммов С197, КМ93 и 569В переносят методом реплик на чашки с 1 %- ным отмытым синказным атаром, содержащим 1% отг.1(-.1тых в синказног.1 эритроцитов O ip. jtia Посевы инкубируют 18 1ри , зал1/ Ввют слоем 0,5% синказно- го ягапа, содержа.1,ето азид натрия, компле- меи1 р орской свинки и М01-10рецепто(;ную чнт 1то ; г1оскуюсыворогку. Через 1-2 ч аы pspi - naHMs при учитывают оезульта ь; Вокр /г мзкро-.олоиий сконсгруированного штяг.м, K. 193, проду Цирую 1дего В-субье;- ;- .колерного токсина, наблюдают че;1-:ую зому гемолиза размером -1-5 ,мм. V исходного || ;аг1ма С197, не г;лазм1 :, -ы. яона ref iOjTM.ia отсутствует. Вокруг макрс. ,о- лсний iiiiaMria 569В, продуцируюидето хо- лерный то к г и t, также имеется зона гемолиза за счет вз.з11модействия В-Су Ь единиц - холепното токсина с соответств/ю- и 1 i-i м I а т (. I е л ..3 111 в а н г и т о к с и ч н с; и сывооот.ко.

.Для количестр.ечного определения ВСуР|1 еД1 , .г 1 ОГО ГОКС1-1НЛ ИСПОЛЬ.лОпйл 1 оер.аО оаз ,..; j.r и.гуноферг-ентнс гь ;

метод. В качестве конгрол Д и для опредя .е- Hit.q чувствительности метода использовалм очищенный препарат .- олерното токсина Клетки luvaMNi.a КМ93 в объеме 5 мл выраиди- вал11 1В ч при в среде содержащей 3% казяминовьи кисло г и 0,5%. дрожжевого зк. :трактг1 . р11 J.f-,. Клетк - цен- трифу ироуанием. в супер: аганте опре.;то- ляют кг-личестсо В-субъединицы холерного токС / на, Сенг 1б 1лизацию микооплат пио- г.loнoклoнaльиы 1и г ммуноглобулина- ми класса IgG к В-субьединице xo/iepHorc- гоксина, В лунки микроплат вносят по 100 .мкл раствора моноклонапьнь к антител в 0,01 М нафий-фосфдтном буфере fPBS) ph 7,4. в концентрации 10 мкг/мл, инкубируют 1 ч при и оставляют на ночь при . Затем пластины промывают этим буфером с 0,057о твин-2, (), высуи1ивают и используют для поставки ELISA. В сенсибили- ai ipOBaHHbi моноклональными антителами лунки дсоавляют пробы в объеме 100 мкп, инкуб /1руют 1 ч при , после трехкратного про. PBST в лунки вносят мон.о к л С н г.- л ь н ы е антитела, м е ч е н н ы .- пероксидазой в рабочем разведении 1:400. Коньюгаты антител с пероксидазой получе- нь периодатным методом. После инкубации пластин шест /1кпатно промывают PBST и в каждую добавляют субстрат - 0.3%- ную перекись водорода в 0,05 М лимонной кислоте .оИ 4,0 и 0,0005 М 2,2 -азиноди-(3

черон

этилбензтиазо/1ин-6-сульфанат). Через 30 мин экспозиции при комнатной температуре при постоянном встряхивании измеряют оптическую плотность раствора при 405 нм Чувствительность метода в данной серии опытов составляет 1 нт. В соответствии с установленной чувствите. ьностью и подсчетом числа выросших в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают |родукцию В-субъединицы холерною токсина штзммсм КМ93. Установлено, что штймм КМЭЗ синтез1(, ует 10- 11 мг В-субь- гЛ1 :;ицы на 1 л кульгурзльной средь, штамм . взятый как продуцент холерного юк . - 10 м;/л, у ис/одногг; штамма С197 продукция Б -субьед11ниць1 равна 0.

/Для г|одтрерждс11ия того, что штамм КМЭЗ продуцирует лишь В-субъединицу хо- -lepHoro токсина, активность этого белка H3y i.jKjT в кожной пробе по Крейгу. В качестве контроля помимо исходного штйммз С197 используют сконструированный штамм С197 (рС0107). прг дуцирующий хо- лери.,1И гоксич, образование которого коди- (Ууется генами Vet А. В. клонированными в составе плазмиды. Установлено, что положительная реакция (образование папул раз- 10 мм за счет д е и с т в и я А-с/бъе,диницы, в результа1е которого изменяется проницаемость сосудов) имеет место лишь в случае использования |.итамма С 197 (рСО 07) продуцирующего холерный ток- Ciu; (обнаруживается в разведении 1:1200- М400). Штаммы КМ93 и С197 ни в одном ррзпеденги их супеонатантов не длют поло- ;,:ег;ьной реакции.

(л:особ; ость штамма КМОЗ продуцировать В-субъединицу холерн ..;го токсина проверяют также при выраидпвании его в реакторе, т.е. в производствен1-1ых условиях. Определение количестр а В-субъединицы в кул,гур: 1Льных фильтрах зеакций пассивной гемя глютинации показало, что в случае ui-гамма КМЭЗ В-субъединица холеоного го.сина регистрировалась пои использовании разведения фильтра а 1.1280, в то время как у штамма 569В, взятого в качестве эта, онното, - в разведении 1.640.

, плучение стабильности наследования плазмиды рСТ Д 27, контролирующей синтез В-субьединицы, ноказа/ю. что при выращивании штамма КМЭЗ в среде без антибиотиков в течение ; 3 ч 98%, клонов сохраняют маркеры Тс и способность к продукции В-субъедимиць1 Эти заданные свидетельствуют о Bt.icoKon стабильности штамма КМ93 - продуцента (субьединицы. Добавление в среду вк1р,т1цир;1Н1 ; тетрацик- У1ина (5 мкг/мл) обеспечпг. i П( ; /: -ную ста- бильность штамма КМ ; О1мо1иении

синтеза В-субьединицы, так как в данных условиях размножаются лишь те клетки, в которых содержится плазмида рСТ Д27 с геном Тс и vet В. Выращивание штамма КМ93 в производственных условиях в среде с добавлением тетрациклина и последующая проверка полученных изолированных колоний на продукцию токсина с помощью РПИГ показала, что все изученные 1500 колоний являются Тс и продуцируют В-субъ- единицу.

Таким образом, результаты, полученные при лабораторном и пооизводственном испытании штамма на стабильность синте за В-субъединицы, четко показывают, что выращивание штамма в среде стетр.эцикли- чом обусловливает 100%-ную стабильность этого признака.

Таким образом, сконструированный Итамм У. cholerae КМ93 не-01 группы ярля- ется продуцентом В-субьединицы холерного токсина, секретирующейся во внешнюю среду. Штамм КМ93 может быть использован в качестве производственного штамма для получения иммуногенного В-субьединичиого комплекса, применяемого для создания диагностических Л профилактических препаратов против холеры.

Ф с р Г-: ула изобретения

1, Рекомбииантная плазмидная ДНК р1ЕМЗ, кодирующая синтез В-субьедииицы /олерного токсина г- ол м 44 МДа и размерам 67.9 Т.П.Н., содержащая

плазмидную ДНК вектора рСТ Л27 р.чп- мером 9,6 т Г1,и. с с.айтами рестрики/г, - один С1а I, лаа Pst I, три Hinc П.

ДНК трансмиссивной плазмиды р1ЕМ1 размером 57.5 т.п.н. с сайтами рестрикции - один ho I, шесть EcoR I, один Pst I b 151-элементе плазмиды plEMI;

дополнительную копию ISI-элемента, возникающую в процессе коинтеграции составляющих плазмид, размером 768 п.и, с сайтом рестрикции Pst I;

v.: В - ген. обеспечивающий синтез В- с/бьединицы холерного токсина:

et С - ген, обеспечивающий резистент- ность к тетрацик./ .ну;

kan - , обеспечивающий розистент- -lO Tb к канамицииу;

круг хозяев - штаммы Escherlchia coll :(12 и Viorlo cholerae

2. Способ конструирования рекомби- антной плазмидной ДИК р1ЕМЗ. кодирующей синтез В-субьединицы холерного гокс1 1на, заключающийся в том, что штамм Е coliK12HB101 гесА, несущий две автономные плазмиды рСТ Л27 и plEMI, из которых последняя обладает трансм .1ссивными свойствами, скрещивают посредством коньюга- ции со штаммом Е. coil К12 Р3478 pol А, в котором плазмида рСТД 27 не способна ре- тицироваться автономно, отбирают клон Тс Кгп , содержащий трансмиссивную ое- кс м Ьииантную плазмиду, образующуюся путем объединения двух исходных плазмид за счет транспозиции ISI-элемента с обра- эован1, коинтеграта.

3 .1 I .мг1 бактерии Vibrio cho erae КМ 93 iiijo/vyU .-HT В-субье/(Иницы холерного ток /1на.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии. Целью изобретения является получение более продуктивного продуцента В- субьединицы холерного токсина. Сконструирована ре- комбинантная коньюгативная плазмида р1ЕМЗ в результате объединения с помощью 151-злемента, введенного в состав коньюгативной плазмиды plEMI, двух плазМИД plEMI, производной коньюгативной плазмиды рОХ38. маркированной мини- транспозоном с геном резистэнтности к t а- намицину(Кт и рСТ 27. прс1 1водной pBR 322. несущей в своем сосгапе клонированный ген vet В и маркер резистентнести к тетрациклину (Тс ). Путем конью1ации плазмида р1ЕМЗ перенесена из штамма Е. coli К 12 в штамм V. cholerae С197 не-01 группы. Среди отобранных трансконьюгантов в1-.|де- лен ьитамм КМ93, утративший маркер Kft коньюгативной части коинтеграта. отлич ю- ц .ийся повышенной резистентностью к тетрациклину, стабильным сохранением этого признака и способностью эффективно продуцировать В-су6ьединицу холерного токсина в количестве 10-11 мг/л культуральной среды. Способность (лтамма КМ93 к экзог- родукции В-субьединицы холерного токги на определена с использованием трех методов: реакции пассивною иммунного гемолиза на чашках, иммуноферментного метода ELISA, титрации препарата в кожной пробе по Крейгу. а такхе в производственных условиях при выращивании штамма в реакторе. Показано, что штамм КМ93 не патогенен для крольчат-сосунков в дозе 10 -10 микробных клеток и не вызывает накопления жидкости в тонком кишечнике взрослого кролика 3 с.п.ф-лы. ся о ел о ю ю