ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА I ТИПА Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 C12P21/00 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано, например, для приготовления диагностических препаратов.

В настоящее время одной из актуальных задач приготовления диагностических препаратов к вирусу герпеса является получение моноклональных антител.

Известны различные штаммы гибридных клеток, для получения которых использовали спленоциты животных, иммунизированных различными вирусами и балками [1,2,3].

Также известны штамм гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела к вирусу простого герпеса [2].

Однако продуцируемые этим штаммом моноклональные антитела используются в основном для изучения механизмов взаимодействия вируса с клеткой (влияние на проникновение вируса в клетку), для анализа взаимосвязей между различными представителями вирусов группы герпеса.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к вирусу простого герпеса 1 типа (ВПГ-1).

Это достигается тем, что штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus МАГ-1 - продуцент моноклональных антител к ВПГ-1 получают путем слияния мышиной миеломы Х-63Аg 8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных ВПГ-1.

Штамм гибридных клеток МАГ-1 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР г. Ленинград (отделение Всесоюзной Коллекции клеточных культур) под N ВСКК/П/450Д. Справка о депонировании прилагается.

История получения штамма.

Мышиные миеломные клетки гибридизовали по методу Келера и Мильштейна с клетками селезенки мышей BALB/с, иммунизированных ВПГ, тип 1 (штамм Cl) [4] . Фибробласты эмбрионов кур инфицировали ВПГ. Через 4 сут при максимальном развитии цитодеструктивного эффекта культуральную жидкость собирали, освобождали от клеточного детрита дифференциальным центрифугированием при 3000 и 6000 об./мин по 30 мин. Из свободной от клеточного детрита культуральной жидкости центрифугированием при 40000 об./мин в течение 1 ч концентрировали ВПГ. Полученный осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Содержание белка в суспензии было 2,7 мг/мл. Перед иммунизацией животных ВПГ-содержащую суспензию шестикратно замораживали и оттаивали. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно по 0,1 мл 4 раза с интервалом 7 дней. Бустерную дозу антигена вводили непосредственно в селезенку. Через 4 сут. готовили спленоциты для слияния с мышиной миеломой Х63-Ag 8.653. Слияние иммунокомпетентных спленоцитов с миеломой в соотношении 4:1 проводили с использованием 50% полиэтиленгликоля 4000 фирмы Loda. Число сливаемых клеток определяли из расчета 150000 селезеночных клеток на лунку панели. Гибридные клетки культивировали на селективной среде ГАТ (среда Дальбекко с пируватом натрия, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гептамицина, 10^-4 М гипоксантина, 10^-5 М аминоптерина и 4˙ 10^-5 М тимидина) в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Скрининг гибридом проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). С этой целью предварительно выращивали монослойную культуру клеток и инфицировали ее ВПГ-1 Cl. Через 48 ч (до развития деструктивного эффекта) клетки фиксировали в охлажденном ацетоне 7 мин. Наличие антител к ВПГ определяли по образованию зеленого свечения на оболочке инфицированных клеток. Титры МКА в культуральной жидкости гибридом колебались от 1:8 до 1:128 в РНИФ. Путем серийных пассажей клетки наиболее продуктивного клона МАГ-1 выведены в массовую культуру. При прививке линейным мышам BALB/с клетками МАГ-1 в дозе 3-5 мин, индуцировали образование асцитных опухолей. Гибридные клетки МАГ-1 продуцируют МКА к ВПГ-1 в культуральную жидкость в большом объеме (сотни миллилитров) на протяжении 39 серийных пассажей (срок наблюдения). Продуцируемые штаммом МАГ-1 антитела охарактеризованы в РНИФ.

Морфология культуры.

Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с ядрами, занимающими большую часть клетки. Ядрышки крупные, встречаются двуядерные клетки. Цитоплазма обычно имеет вид тонкого ободка или ядро смещено к одной стороне клетки.

Культуральные характеристики штамма.

Среда для культивирования - среда Дальбекко с пируватом натрия, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гентамицина (ростовая среда). Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - через 3-4 сут. Посевная доза - 200000 клеток/мл. Кратность рассева 1:3 - 1:4.

Клонирование гибридных клеток.

Клетки дважды клонированы методом предельных разведений. Выход субклонов, продуцирующих МКА к ВПГ-1, составил 87%.

Кариология культуры.

Кариотип соответствует мышиному виду. С помощью метода С-окраски выявлены маркеры родительской линии миеломы Х63. Модальный класс хромосом гибридомы - 116 (модальный класс родительской миеломной линии Х63 - 51 хромосома).

Изоферменты.

Подвижность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в клетках клона МАГ-1 характерна для мышиных клеток.

Сведения о контаминантах линии.

Бактерии не обнаружены, грибы и дрожжи не обнаружены, микоплазмы не обнаружены, вирусы - обнаружены частицы типа А и С, аналогичные частицы родительского штамма клеток Х63-Ag 8.653.

Консервация клеток.

Клетки МАГ-1 заморожены на 21, 27 и 30 пассажах. Общее количество ампул 45 по 5-7 млн.клеток в ампуле. Криозащитная среда - ростовая среда с 50% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% глицерина. Выживаемость при размораживании - не менее 50%.

Класс продуцируемых иммуноглобулинов - IgG 2b.

П р и м е р 1. Культивирование гибридных клеток и накопление МКА в культуральных (КЖ) и асцитических жидкостях (АЖ).

В культуральные матрасы объемом 250-500 мл засевают гибридные клетки МАГ-1 в концентрации 200 тыс./мл в ростовой среде. Культуры инкубируют при 37^оС в стационарном состоянии 3-4 сут. Клетки отделяют центрифугированием. Надосадок хранят при -20^оС и используют как образцы КЖ. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды без сыворотки и вводят в полость мышей BALB/с. Через 14-15 сут. образуется асцитическая опухоль, которую используют как образец АЖ.

П р и м е р 2. Определение активности МКА в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

РНИФ ставили на препаратах, инфицированных ВПГ, КЖ и АЖ разводили физиологическим раствором, наносили каждое разведение на фиксированную суспензию клеток и инкубировали 30 мин при 37^оС. После контакта во влажной камере тщательно отмывали от несвязавшейся сыворотки в двух порциях фосфатного буфера рН 7,2-7,4 по 10 мин, подсушивали на воздухе, а затем наносили меченную ФИТЦ антимышиную сыворотку в смеси с контрастирующим бычьим альбумином, меченным фторидом сульфародамина Б. После контакта во влажной камере при 37^оС в течение 30 мин клетки отмывали так же, как в первом случае, подсушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе. Титром считали то последнее разведение КЖ и АЖ, которое вызывало отчетливое специфическое свечение на +3 в культуре клеток, зараженных ВПГ, но дающих отрицательный результат в незараженной контрольной культуре клеток. Для выявления перекрестной реактивности МКА использовали культуры клеток ФЭК, зараженные вирусом осповакцины (штамм "серый клон"). Результаты исследований представлены в табл.1 и 2.

Результаты исследований, полученные в РНИФ, показывают, что моноклональные антитела специфически реагируют с вирусом простого герпеса, но не с вирусом осповакцины.

Полученный штамм гибридных клеток МАГ-1 синтезирует высокоспецифичные МКА к ВПГ-1 класса IgG 2b с титром в реакции непрямой иммунофлюоресценции 1:8000 (АЖ).

МКА, полученные в препаративных количествах, служат сырьем для получения диагностических препаратов, которые невозможно получить из поликлональных антисывороток. МКА незаменимы при получении высокоочищенных антигенов ВПГ-1, для исследования антигенных взаимоотношений между вирусами группы герпеса. Они могут оказаться полезными при исследовании закономерностей взаимодействия вирусов с клетками, а также для анализа деталей репликации и созревания вирусов.

Использование: биотехнология, вирусология. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния клетки селезенки мышей BALB/с, иммунизированных вирусом простого герпеса, с клетками миеломы X63-Ag 8.653. Штамм обозначен МАГ-1 и депонирован под номером ВСКК(П) N405Д. Штамм гибридных клеток продуцирует высокоспецифичные моноклональные антитела к вирусу простого герпеса 1 типа класса Ig G 2b. Титр антител в асцитической жидкости в реакции непрямой иммунофлюоресценции составляет 1:8000. 2 табл.

ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА I ТИПА.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П) N 450Д - продуцент моноклональных антител к вирусу простого герпеса I типа.